人參莖葉總皂苷對(duì)黃瓜白粉病菌的活性影響研究△

楊鶴，宋述堯，許永華，盧寶慧，張連學(xué)

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

人參莖葉總皂苷對(duì)黃瓜白粉病菌的活性影響研究△

楊鶴，宋述堯*，許永華，盧寶慧，張連學(xué)*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

目的：為人參源殺菌劑的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。方法：通過(guò)洋蔥球莖內(nèi)表皮膜法研究人參莖葉總皂苷對(duì)黃瓜白粉病菌孢子萌發(fā)的影響，采用盆栽法研究其對(duì)白粉病菌的溫室防效。結(jié)果：人參莖葉總皂苷對(duì)白粉病菌孢子萌發(fā)的EC50為5.74 mg·mL-1；溫室防效的EC50為23.51 mg·mL-1。結(jié)論：人參莖葉總皂苷可抑制黃瓜白粉病菌孢子萌發(fā)，溫室防效良好，可進(jìn)一步研發(fā)為中藥殺菌劑。

人參莖葉總皂苷；白粉病菌；孢子萌發(fā)；防治效果；殺菌劑

黃瓜白粉病是我國(guó)北方露地和保護(hù)地黃瓜種植中發(fā)生和危害較重的病害之一，在黃瓜整個(gè)生長(zhǎng)期均可危害。病原菌屬于子囊菌亞門(mén)的白粉病菌Sphaerothecafuliginea(Schlecht)Poll.。目前大面積種植的高產(chǎn)品種大多缺乏抗病性，長(zhǎng)期高劑量施用殺菌農(nóng)藥，使病菌逐步產(chǎn)生了抗藥性[1]，因此在生產(chǎn)實(shí)踐中急需安全有效的防治黃瓜白粉病的新型殺菌劑。

三萜類物質(zhì)是植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的適應(yīng)生態(tài)環(huán)境的物質(zhì)，它們具有抵抗真菌、病毒、細(xì)菌侵?jǐn)_的作用[2]。人參皂苷作為典型的三萜類物質(zhì)，是人參的一種重要次生代謝產(chǎn)物，其藥理作用早已得到大眾的認(rèn)可，并且越來(lái)越多的研究學(xué)者也關(guān)注到人參皂苷的生態(tài)學(xué)作用。人參皂苷作為人參、西洋參的一類主要化感物質(zhì)在人參忌連作問(wèn)題上被廣泛研究[3]，并有報(bào)道指出人參莖葉總皂苷具有抑菌作用[4]。本實(shí)驗(yàn)室比較了人參莖葉總皂苷對(duì)于不同植物病原菌的活性，發(fā)現(xiàn)對(duì)黃瓜白粉病菌作用顯著。人參莖葉總皂苷作為天然活性物質(zhì)，如果能開(kāi)發(fā)為植物源農(nóng)藥，用于代替化學(xué)方法作為防治果蔬病害的綠色防治手段，對(duì)于環(huán)境保護(hù)和生物安全將具有重要意義。

黃瓜白粉病菌為植物專性寄生菌，只能寄生與之親和的活體，不能在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，因此以往研究中，很少采用孢子萌發(fā)法評(píng)價(jià)藥劑對(duì)該菌的活性。本文采用洋蔥球莖內(nèi)表皮膜法評(píng)價(jià)人參莖葉總皂苷對(duì)黃瓜白粉病菌孢子萌發(fā)的影響，并進(jìn)行了人參莖葉總皂苷對(duì)白粉病菌的溫室防治效果研究，以期研發(fā)一種新型植物源殺菌劑。

1 材料與方法

1.1 材料

人參莖葉總皂苷購(gòu)自吉林省宏久生物科技股份有限公司(紫外檢測(cè)總皂苷含量為81.7%)。白粉病菌孢子采自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院溫室。供試黃瓜品種為好運(yùn)來(lái)208，購(gòu)于山東省寧陽(yáng)縣蔬春種業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 人參總皂苷溶液的制備 將人參莖葉總皂苷用0.05%的吐溫-80水溶液分別配制成0.5，5，10，20，50 mg·mL-1的質(zhì)量濃度梯度，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 白粉病菌孢子萌發(fā)試驗(yàn) 采用洋蔥球莖內(nèi)表皮膜法[5]研究人參莖葉總皂苷對(duì)白粉病菌孢子萌發(fā)的影響。取溫室中黃瓜上感染的白粉病菌，用去離子水將孢子洗脫，過(guò)濾，1000 rpm離心5 min，去上清液，重復(fù)3 次。重懸浮孢子至分生孢子含量1×106個(gè)·mL-1。

取1.2.1藥劑和孢子懸浮液按1∶1混勻并滴到洋蔥表皮膜上，架于盛有淺層無(wú)菌水的培養(yǎng)皿中，28 ℃加蓋保濕培養(yǎng)，每個(gè)處理3 次重復(fù)，以0.05%的吐溫-80水溶液處理為空白對(duì)照。待對(duì)照組70%以上萌發(fā)時(shí)觀察并計(jì)算孢子萌發(fā)率，顯微鏡觀察孢子萌發(fā)情況，每個(gè)處理隨機(jī)觀察3個(gè)視野，以每視野下能觀察到的80～100個(gè)孢子為記錄對(duì)象，記錄孢子總數(shù)和萌發(fā)數(shù)，以孢子芽管長(zhǎng)于孢子短半徑為萌發(fā)，按下式計(jì)算萌發(fā)率和相對(duì)抑制率：

相對(duì)抑制率=

1.2.3 白粉病菌溫室防治試驗(yàn) 采用盆栽法[6]研究人參莖葉總皂苷對(duì)黃瓜白粉病菌的溫室防治效果。按照1.2.2方法配置孢子懸浮液。取63株長(zhǎng)勢(shì)相同的健康供試黃瓜幼苗，溫室單株栽培，待5～7片真葉期時(shí)，分為7組。用孢子懸浮液均勻噴霧接種，20～23 ℃，相對(duì)濕度95%，黑暗保濕條件下培養(yǎng)24 h。然后取1.2.1藥劑均勻噴施于生長(zhǎng)點(diǎn)以下第3，4，5片葉正反面至潤(rùn)濕，以0.05% 的吐溫-80水溶液為對(duì)照，采用生產(chǎn)上常用的乙嘧唑胺菌酯為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)處理3 株，3次重復(fù)。在20～23 ℃，正常日光溫室，相對(duì)濕度85%～90%條件下培養(yǎng)7 d。按表1 的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[6]調(diào)查記錄葉片發(fā)病情況，每處理調(diào)查10片葉，按下式計(jì)算病情指數(shù)和防治效率。

表1 黃瓜白粉病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 22.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多重比較采用Duncan’s法。以人參皂苷濃度對(duì)數(shù)值和孢子萌發(fā)相對(duì)抑制率的幾率值，人參皂苷濃度對(duì)數(shù)值和溫室防效幾率值作毒力回歸方程，根據(jù)回歸方程計(jì)算兩次分析的EC50值及95%的置信限。

3 結(jié)果與分析

3.1 白粉病菌孢子萌發(fā)的影響

人參莖葉總皂苷對(duì)黃瓜白粉病菌孢子萌發(fā)的影響見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)條件下培養(yǎng)，隨著藥劑濃度的升高，孢子萌發(fā)率呈顯著降低趨勢(shì)，孢子萌發(fā)相對(duì)抑制率呈顯著升高趨勢(shì)，人參莖葉總皂苷對(duì)白粉病菌孢子萌發(fā)有明顯的抑制作用。

當(dāng)人參莖葉總皂苷濃度為0.5～50 mg·mL-1時(shí)，通過(guò)對(duì)濃度對(duì)數(shù)與白粉病菌孢子萌發(fā)相對(duì)抑制率幾率值作毒力回歸分析，可以進(jìn)一步分析人參莖葉總皂苷對(duì)孢子萌發(fā)的抑制效果。結(jié)果顯示，回歸方程為Y=0.956 2X+4.2742，相關(guān)系數(shù)r=0.937，可知人參莖葉總皂苷對(duì)白粉病菌孢子萌發(fā)的抑制作用與其濃度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)。得出人參皂苷有效抑菌濃度EC50為5.74 mg·mL-1，95%置信限為3.58～9.21 mg·mL-1。

藥劑濃度(mg·mL-1)萌發(fā)率(%)校正萌發(fā)率(%)相對(duì)抑制率(%)508 00±1 73f11 11±2 41f88 89±2 41e2023 00±0 58e31 94±0 80e68 06±0 80d1035 33±4 04d49 07±3 24d50 92±3 24c546 00±2 89c63 89±4 01c36 11±4 01b0 556 33±2 33b78 24±3 24b21 76±3 24aCK72 33±2 90a100a—

注：表中同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著，P<0.05。

3.2 白粉病菌溫室防治

人參莖葉總皂苷對(duì)黃瓜白粉病菌溫室防治效果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，隨著藥劑濃度的升高，黃瓜葉片發(fā)病率和病情指數(shù)均有逐漸降低的趨勢(shì)，并且均顯著低于對(duì)照組。防治效果隨藥劑濃度的升高而顯著增強(qiáng)，當(dāng)藥劑濃度達(dá)到10 mg·mL-1時(shí)，與陽(yáng)性對(duì)照的防治效果相同，高于此濃度的藥劑防治效果均顯著強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照。

藥劑濃度/mg·mL-1發(fā)病率(%)病情指數(shù)(%)防治效果(%)505 00±0e33 33±0d66 67±0d2016 67±3 33d48 15±7 41c51 85±7 41c1040 00±5 77c77 78±0b22 22±0b546 67±1 67c85 19±7 41b14 81±7 41b0 558 33±1 67b100±0a0aCK73 33±1 67a100±0a—陽(yáng)性對(duì)照40 24±4 91c77 78±0b22 22±0b

注：表中同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著，P< 0.05。

通過(guò)對(duì)濃度對(duì)數(shù)與防效幾率值作毒力回歸分析，回歸方程為Y=1.798 5X+2.533 7，相關(guān)系數(shù)r=0.993 3，可知人參莖葉總皂苷對(duì)白粉病菌溫室防治效果與其濃度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)。得出人參皂苷有效溫室防治濃度EC50值為23.51 mg·mL-1，95% 置信限為12.98～42.58 mg·mL-1。

4 討論

人參莖葉總皂苷對(duì)黃瓜白粉病菌孢子萌發(fā)具有明顯的抑制作用，分生孢子的萌發(fā)是白粉病田間流行和再侵染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，抑制分生孢子萌發(fā)可以有效控制病害流行，減輕其危害程度。與室內(nèi)對(duì)白粉病菌孢子萌發(fā)的抑制作用相比，受植物自身和溫室環(huán)境的綜合影響，人參莖葉總皂苷抑菌效果明顯降低，但其仍具有明顯的防治效果，且其防治效果與藥劑濃度在一定范圍內(nèi)成正相關(guān)。

植物次生代謝物質(zhì)是植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中與環(huán)境相互作用，通過(guò)次級(jí)代謝途徑產(chǎn)生的物質(zhì)，它們?cè)谥参镞M(jìn)化中起到不可或缺的作用，具有廣泛的生態(tài)學(xué)意義[7]。將人參次生代謝產(chǎn)物人參皂苷開(kāi)發(fā)為植物源農(nóng)藥，無(wú)脊柱動(dòng)物毒性或植物毒性，同時(shí)還有一定的保健作用，并有環(huán)境降解迅速且資源豐富，可再生等優(yōu)點(diǎn)。人參栽培過(guò)程中具有季節(jié)脫落現(xiàn)象，人參莖葉往往被棄之地里，但有研究顯示人參葉中總皂苷含量比人參根部含量更高[8]。因此本研究選擇人參莖葉皂苷作為試驗(yàn)原料，將廢棄物有效利用，極大降低成本。前人在人參皂苷抑菌及其有效成分方面也有過(guò)研究[4]，本研究得出人參莖葉總皂苷可以抑制白粉病菌孢子萌發(fā)，同時(shí)具有良好的溫室防治效果。因此，可以此研究為基礎(chǔ)，進(jìn)一步研究人參皂苷對(duì)果蔬類病原真菌生長(zhǎng)的抑制作用，研發(fā)新型植物源農(nóng)藥潛力巨大。

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InhibitoryEffectsofGinsenosidesonCucumberPowderyMildewFungus(Sphaerothecafuliginea)Activity

YANG He，SONGShuyao*，XUYonghua，LUBaohui，ZHANGLianxue*

(CollegeofChineseTraditionalMedicine，JilinAgricultureUniversity，Changchun130118，China)

Objective：This study is aimed to provide scientific basis for using ginsenosides as the fungicide.Methods：In order to evaluate the inhibitory effects of ginsenosides from ginseng stem and leaf on cucumber powdery mildew fungus spore germination and its control efficiency in greenhouse，onion bulb inside skin membrane and pot cultivation methods were employed in this study.Results：The results indicated that ginsenosides from ginseng stem and leaf EC50on powdery mildew fungus spore germination and preventive effects in greenhouse were 5.74 mg·mL-1and 23.51 mg·mL-1，respectively.Conclusion：Ginsenosides，with the potential for further development of a Chinese herbal fungicide，perform well on suppression of spore germination and prophylaxis in greenhouse.

ginsenosides from ginseng stem and leaf；Sphaerothecafuliginea；spore germination；control effect；fungicide

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(20130311)；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20150204043N Y)

] 宋述堯，教授，研究方向：設(shè)施園藝工程及蔬菜生態(tài)生理研究；E-mail：sysongjlau@126.com； 張連學(xué)，教授，研究方向：藥用植物栽培與加工；E-mail：zlx863@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.7.019

2017-01-17)

*[