微透析采樣考察玉龍散中烏頭堿在大鼠皮膚局部的透皮吸收過程△

李懷國，李子鴻，劉東文，鄭芳昊

(佛山市中醫(yī)院，廣東 佛山 528000)

微透析采樣考察玉龍散中烏頭堿在大鼠皮膚局部的透皮吸收過程△

李懷國*，李子鴻，劉東文，鄭芳昊

(佛山市中醫(yī)院，廣東 佛山 528000)

目的：考察玉龍散中烏頭堿的透皮吸收過程。方法：采用HPLC-MS/MS技術(shù)建立SD大鼠皮膚微透析液中烏頭堿含量的測定方法。通過考察微透析技術(shù)中對(duì)烏頭堿體內(nèi)回收率的影響因素，確定采樣條件。經(jīng)皮給藥后，考察烏頭堿的局部透皮吸收過程。結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)成功建立了HPLC-MS/MS測定微透析樣品中烏頭堿含量的方法。微透析采樣流速選擇1.5 μL·min-1，采樣間隔為30 min。烏頭堿的AUC為18 973.27 h·ng·mL-1，MRT為14.97 h，Cmax為2 976.38 ng·mL-1，Tmax為11.76 h。結(jié)論：微透析采樣技術(shù)可用于玉龍散中烏頭堿的透皮吸收過程研究。

玉龍散；烏頭堿；微透析

玉龍散是佛山市中醫(yī)院自發(fā)研制的傳統(tǒng)外用制劑，具有溫經(jīng)散寒、活血止痛的功效，臨床主要用于跌打舊患、寒邪著絡(luò)引起的關(guān)節(jié)酸痛或外科關(guān)節(jié)痛等癥。本制劑制備工藝簡單，取各味中藥粉碎成細(xì)粉，過篩，混勻，即得。使用時(shí)將本品與加熱的水及蜜糖混合均勻，平鋪于敷藥紙上，敷患處即可。該方由生草烏、生天南星等共7味中藥組成。其中，生草烏祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛，起主要治療作用，在方中所占比例較大，為君藥[1-4]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，生草烏的主要有效成分為烏頭類生物堿，但同時(shí)也是其產(chǎn)生毒性的成分。在院內(nèi)制劑標(biāo)準(zhǔn)中，本品對(duì)烏頭堿的含量進(jìn)行了限定，按質(zhì)量計(jì)應(yīng)低于3 mg·g-1。但是，關(guān)于烏頭堿的透皮吸收過程卻并不清楚，為該品種的合理使用帶來了極大的風(fēng)險(xiǎn)。本研究擬采用微透析技術(shù)考察玉龍散中烏頭堿在皮膚局部的透皮吸收過程。

1 儀器與材料

1.1 儀器

RWD302微透析系統(tǒng)(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，CMA30微透析探針(瑞典CMA公司)，HPLC-MS/MS聯(lián)用儀(1200 HPLC和6410 Triple Quad 液質(zhì)聯(lián)用儀，美國安捷倫科技有限公司)。

1.2 試藥

玉龍散(佛山市中醫(yī)院自制，批號(hào)：1421301)，經(jīng)測定烏頭堿含量為2.43 mg·g-1；烏頭堿對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：1213511-2012521)；鹽酸普羅帕酮對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100047-200305)。

1.3 動(dòng)物

SD雄性大鼠(SPF級(jí))20只，體重(200±20)g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(粵)2008-0021。

2 方法

2.1 微透析法收集局部皮膚透析液

2.1.1 Ringer’s液與探針的預(yù)處理 分別稱取氯化鈉4.30 g、氯化鈣0.12 g、氯化鉀0.15 g，轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶中，用蒸餾水定容前加稀鹽酸調(diào)pH至7.4，經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)過濾后得Ringer’s液，使用前超聲脫氣20 min。將新探針浸泡于水中，以2 μL·min-1的流速灌流2 h，洗去雜質(zhì)。體內(nèi)試驗(yàn)前，將透析膜浸泡于肝素鈉注射液中超過20 min。

政府和社會(huì)一直大力支持和倡導(dǎo)“全民閱讀”，為了鼓勵(lì)民眾培養(yǎng)良好的閱讀習(xí)慣， 2017年在國務(wù)院法制辦會(huì)議審議并原則通過《全民閱讀促進(jìn)條例（草案）》中，計(jì)劃將全民閱讀納入國家戰(zhàn)略。[1]全民閱讀已成為全社會(huì)共同參與的一項(xiàng)重大工程，以大學(xué)生為目標(biāo)群體的高校圖書館在全民閱讀中有著不可推卸的責(zé)任，承擔(dān)著重要的角色。從20世紀(jì)90年代末至今，高校圖書館服務(wù)內(nèi)容在不斷發(fā)生變化，閱讀推廣作為新興服務(wù)門類，發(fā)揮著越來越重要的作用，包括讀書講座、閱讀研討、展覽、影視鑒賞等內(nèi)容的閱讀推廣活動(dòng)成為圖書館評(píng)估工作中的重要一環(huán)。許多高校圖書館成立專門的閱讀推廣部門，組織專業(yè)的閱讀推廣團(tuán)隊(duì)策劃組織閱讀活動(dòng)。

2.1.2 微透析手術(shù) 取SD雄性大鼠，實(shí)驗(yàn)前用脫毛膏去腹部毛，并用20%烏拉坦按體質(zhì)量(0.1 mL·g-1)麻醉。根據(jù)微透析采樣要求，于敷藥紙黏貼皮膚中心位置植入微透析探針，平均深度為83.26 μm。取玉龍散藥粉10 g，加煮熱的水及蜜糖(水、蜜糖用量均為10 mL)，混合均勻后平鋪于敷藥紙上(4 cm×4 cm)，敷于裸露皮膚處。分別于給藥前及給藥后每隔30 min收集透析液。

2.2 HPLC-ESI-MS/MS法測定大鼠局部皮膚微透析液中烏頭堿的含量

2.2.1 內(nèi)標(biāo)對(duì)照品溶液的制備 精密稱取普羅帕酮對(duì)照品，加甲醇溶解制成0.1 mg·mL-1的溶液，作為儲(chǔ)備對(duì)照品溶液。臨用前，將儲(chǔ)備液用甲醇稀釋至規(guī)定濃度，先用氮?dú)獯蹈?，再用同體積Ringer’s液溶解，得到內(nèi)標(biāo)對(duì)照品溶液。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)透析液樣品及質(zhì)控樣品的制備 精密稱取烏頭堿對(duì)照品，加甲醇溶解制成0.1 mg·mL-1的溶液，作為儲(chǔ)備對(duì)照品溶液。取儲(chǔ)備對(duì)照品溶液，用甲醇分別稀釋至1、10、50、100、500、1000、2000、5000、10 000 ng·mL-1，得烏頭堿對(duì)照品系列工作溶液。分別吸取各濃度的工作溶液100 μL，先用氮?dú)獯蹈桑儆肦inger’s液溶解，得到濃度為1～10 000 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)透析液系列樣品。其中，10、500、5000 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)透析液樣品分別作為烏頭堿的低、中、高質(zhì)控樣品。

2.2.3 供試品溶液的制備 以體積比1∶1混合待測透析液和內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液后即得供試品溶液。

2.2.4 色譜條件 色譜柱：苯基柱(Alltima Phenyl，250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.1%甲酸-乙腈(40∶60)；流速：0.35 mL·min-1；柱溫：35 ℃；運(yùn)行時(shí)間：2.5 min；進(jìn)樣量：2 μL。

質(zhì)譜條件：輔助霧化氣壓力：35 Psi(1 Psi=6.895 kPa)；毛細(xì)管電壓：±4000 V；離子源溫度：350 ℃；干燥氣(N2)流速：8.0 L·min-1。具體參數(shù)見表1。

表1 烏頭堿含量測定的質(zhì)譜參數(shù)

2.3 烏頭堿在SD大鼠皮膚局部的藥代動(dòng)力學(xué)過程

采用建立的微透析采樣條件，于SD大鼠給藥皮膚處植入微透析探針，分別于給藥前及給藥后每隔30 min收集透析液，連續(xù)收集24 h。通過2.2項(xiàng)下建立的LC-MS條件測定透析液中烏頭堿的含量。運(yùn)用DAS3.0軟件進(jìn)行非房室模型擬合，計(jì)算烏頭堿在大鼠皮膚局部的藥時(shí)曲線下面積(AUC)、平均滯留時(shí)間(MRT)、達(dá)峰藥物濃度(Cmax)和達(dá)峰時(shí)間(Tmax)等藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 LC-MS測定透析液中烏頭堿含量的方法學(xué)考察

3.1.1 專屬性考察 根據(jù)2.2.4項(xiàng)下的色譜及質(zhì)譜條件，分別將對(duì)照品、供試品和空白陰性溶液進(jìn)樣檢測，比較三者的LC-MS圖譜。結(jié)果如圖1、2所示，烏頭堿和內(nèi)標(biāo)的出峰時(shí)間處無雜質(zhì)干擾，峰型良好。在現(xiàn)行檢測條件下，可以進(jìn)一步進(jìn)行樣品分析。

3.1.2 基質(zhì)效應(yīng)考察 參照質(zhì)控樣品的濃度，以Ringer’s液溶解的高、中、低濃度烏頭堿溶液進(jìn)樣后測定的峰面積為分子，以對(duì)應(yīng)濃度對(duì)照品溶液進(jìn)樣后測定的峰面積為分母，計(jì)算烏頭堿的基質(zhì)效應(yīng)。同時(shí)，平行取5份內(nèi)標(biāo)溶液，測定內(nèi)標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果如表2所示，烏頭堿和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)較小，均無明顯離子增強(qiáng)或抑制現(xiàn)象，不影響烏頭堿的含量測定。

注：A.空白；B.對(duì)照品；C.供試品。圖1 內(nèi)標(biāo)(普羅帕酮)LC-MS圖

注：A.空白；B.對(duì)照品；C.供試品。圖2 烏頭堿LC-MS圖

表2 烏頭堿基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果

3.1.3線性關(guān)系考察及線性范圍和定量下限 分別取不同濃度的烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)透析液系列樣品進(jìn)樣，以烏頭堿與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為Y，以烏頭堿的濃度為X，采用加權(quán)(w=1/X2)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算。結(jié)果表明，烏頭堿在0.5～5000 ng·mL-1線性關(guān)系良好，線性回歸方程為Y=0.362 8X-0.004 5，r=0.999 3，定量下限(LLOQ)為0.5 ng·mL-1。

3.1.4 日內(nèi)及日間精密度和準(zhǔn)確度考察 分別取高、中、低濃度的烏頭堿質(zhì)控樣品，每組平行5份，樣品處理后連續(xù)進(jìn)樣3 d，計(jì)算精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果如表3所示，不同濃度的烏頭堿樣品日內(nèi)及日間精密度和準(zhǔn)確度良好，準(zhǔn)確度均在±5%內(nèi)，精密度質(zhì)量均小于5%。

3.1.5 回收率考察 分別取高、中、低濃度的烏頭堿質(zhì)控樣品，每組平行5份，以質(zhì)控樣品與空白透析液混合進(jìn)樣后測定的峰面積為分子，以對(duì)應(yīng)濃度對(duì)照品溶液與空白透析液混合后直接進(jìn)樣測定的峰面積為分母，計(jì)算烏頭堿的提取回收率。同樣，平行取5份內(nèi)標(biāo)溶液，測定內(nèi)標(biāo)物的回收率。結(jié)果如表4所示，烏頭堿和內(nèi)標(biāo)的回收率均大于90%，RSD均小于5%，平行性良好。

表3 日內(nèi)及日間精密度和準(zhǔn)確度考察結(jié)果

表4 回收率考察結(jié)果

3.1.6 穩(wěn)定性考察 分別取高、中、低濃度的烏頭堿質(zhì)控樣品，每組平行5份，在下述條件下考察烏頭堿的穩(wěn)定性：室溫放置8 h，反復(fù)凍融3次，-20 ℃放置15 d。結(jié)果如表5所示，上述條件對(duì)烏頭堿的含量測定均無顯著影響，準(zhǔn)確度均在±5%內(nèi)。

3.2 微透析采樣條件的確立

3.2.1 微透析流速對(duì)體內(nèi)回收率的影響 探針植入平衡2 h后，分別在1.0、1.5、2.0、2.5 μL·min-1流速下灌注含有烏頭堿(500 ng·mL-1)的Ringer’s液。每個(gè)流速收集5份樣品，每份樣品收集40 μL，分別測定透析液(C1)和含藥Ringer’s液(C2)中烏頭堿的含量，按公式RL=(C2-C1)/C2×100%計(jì)算體內(nèi)相對(duì)損失率(RL)，按公式RR=C1/C2×100%計(jì)算回收率(RR)。結(jié)果如表6所示，隨著流速的增加，體內(nèi)相對(duì)損失率逐漸減少，回收率增加。綜合考慮，1.5 μL·min-1的流速較為合理。

表5 穩(wěn)定性考察結(jié)果(n=5)

表6 微透析流速對(duì)體內(nèi)回收率的影響

3.2.2 藥物濃度對(duì)體內(nèi)回收率的影響 探針植入平衡2 h后，以1.5 μL·min-1的流速分別灌注含有烏頭堿質(zhì)量濃度為100、500、1000、2000、5000 ng·mL-1的Ringer’s液。每個(gè)流速收集5份樣品，每份樣品收集45 μL，分別計(jì)算體內(nèi)相對(duì)損失率和回收率。結(jié)果表明，不同濃度下烏頭堿的體內(nèi)回收率平均值為19.27%，RSD=3.27%。說明在100～5000 ng·mL-1內(nèi)，烏頭堿的濃度對(duì)探針回收率無明顯影響。

3.2.3 體內(nèi)回收率的穩(wěn)定性考察 以1.5 μL·min-1的流速分別灌注含烏頭堿為500 ng·mL-1的Ringer’s液，每30 min收集1次透析液，連續(xù)灌流24 h。結(jié)果表明，24 h內(nèi)烏頭堿的體內(nèi)回收率平均值為79.78%，RSD=4.46%。說明24 h內(nèi)烏頭堿的體內(nèi)回收率無明顯變化，半透膜穩(wěn)定性良好。

3.3 烏頭堿在SD大鼠皮膚局部的藥代動(dòng)力學(xué)過程

玉龍散中烏頭堿在大鼠皮膚局部的經(jīng)時(shí)曲線如圖3所示。烏頭堿的AUC為18 973.27 h·ng·mL-1，MRT為14.97 h，Cmax為2 976.38 ng·mL-1，Tmax為11.76 h。

圖3 烏頭堿在大鼠皮膚局部的藥物濃度-時(shí)間曲線(n=6)

4 討論

烏頭堿的含量測定方法包括高效液相色譜法(HPLC)、液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)等。LC-MS體現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢的互補(bǔ)，將色譜對(duì)復(fù)雜樣品的高分離能力，與MS具有高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對(duì)分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來，在藥物分析尤其是生物樣品定量分析中得到了廣泛的應(yīng)用。如黎曉麗等[5]采用LC-MS測定了微透析樣品中6種烏頭類生物堿的含量。李國衛(wèi)等[6]采用LC-MS分析了制川烏單煎液及烏頭湯中烏頭類生物堿成分的差異，對(duì)各成分的MS2和MS3譜圖進(jìn)行了解析。辛楊等[7]利用LC-MS分析了干姜對(duì)烏頭類生物堿在大鼠腸內(nèi)吸收的影響。朱玲英等[8]利用LC-MS體外分析了肝勻漿液中烏頭堿及其代謝產(chǎn)物的含量和變化。陶長戈等[9]利用LC-MS研究了靜脈注射給藥后烏頭堿在大鼠體內(nèi)的毒代動(dòng)力學(xué)過程。本文成功建立了LC-MS測定微透析液中烏頭堿含量的方法。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法穩(wěn)定可靠，重現(xiàn)性良好，可用于測定微透析樣品中烏頭堿的含量。

通?？梢詮捏w內(nèi)和體外研究藥物的透皮吸收機(jī)制。但是，體外研究雖然可以初步了解效應(yīng)成分的透皮能力，卻無法真實(shí)反映藥物的經(jīng)皮吸收全過程。傳統(tǒng)的體內(nèi)研究則無法滿足動(dòng)態(tài)、精確定量的實(shí)驗(yàn)要求。微透析采樣不僅在國外得到了廣泛應(yīng)用，在國內(nèi)也越來越多地被用來進(jìn)行中藥外用制劑的透皮吸收分析，具有活體取樣、動(dòng)態(tài)觀察、定量分析、對(duì)組織損傷小、取樣少、方便、快捷、可連續(xù)監(jiān)測且易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，可減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用量，降低個(gè)體差異[10-11]。黎曉麗等[5]運(yùn)用微透析技術(shù)研究了制川烏—白芍配伍對(duì)6種酯性生物堿局部藥動(dòng)學(xué)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，微透析采樣聯(lián)合液質(zhì)聯(lián)用分析技術(shù)可以用于烏頭堿透皮吸收過程的研究。但是，制烏頭中烏頭堿的Tmax為(1±0.71)h，MRT為(2.71±0.36)h。藥對(duì)配伍后，Tmax與MRT雖有所減少，仍與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異較大。這可能與玉龍散的制備工藝、使用方法、在臨床中需要緩釋的用藥目的有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)成功建立了微透析技術(shù)用于烏頭堿體內(nèi)采樣的方法，采用本文的灌流液和流速，既可以保證烏頭堿的體內(nèi)回收率，同時(shí)又可以滿足LC-MS對(duì)樣品分析的要求。通過本文的研究，初步明確了玉龍散中烏頭堿在皮膚局部的透皮吸收過程，為制劑工藝優(yōu)化、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高以及新藥藥效學(xué)評(píng)價(jià)提供了實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。

[1] 梁麗誼，黎建顏.追風(fēng)透骨膠囊聯(lián)合玉龍散外敷治療腰痛的療效觀察[J].今日藥學(xué)，2016，26(7)：509-511.

[2] 范偉鋒，陳衍堯，朱秋賢，等.玉龍散外敷對(duì)椎動(dòng)脈型頸椎病血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，35(8)：47-49.

[3] 江麗嬌，梁瑞媚，梁麗誼，等.玉龍散與活血散緩解骨科慢性疼痛效果對(duì)比觀察[J].護(hù)理學(xué)報(bào)，2013，20(6)：56-58.

[4] 李丹鳳，邱沈虹，杜雪蓮，等.玉龍散外敷治療腰椎間盤突出癥腰腿疼痛的效果觀察[J].護(hù)理學(xué)報(bào)，2013，20(13)：51-53.

[5] 黎曉麗，吳璐，吳維剛，等.在體皮膚微透析法研究制川烏白芍配伍對(duì)6種酯型生物堿局部藥動(dòng)學(xué)的影響[J].中國中藥雜志，2016，41(5)：948-954.

[6] 李國衛(wèi)，吳成鳳，桂蜀華.配伍對(duì)烏頭湯中烏頭堿型生物堿的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21(10)：5-8.

[7] 辛楊，皮子鳳，宋鳳瑞，等.利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析干姜對(duì)烏頭類生物堿在大鼠腸內(nèi)吸收的影響[J].化學(xué)學(xué)報(bào)，2012，70(5)：551-560.

[8] 朱玲英，沈紅，武潔.LC-MS/MS法體外測定肝勻漿液中烏頭堿及其代謝產(chǎn)物[J].藥物分析雜志，2012，32(11)：1923-1928.

[9] 陶長戈，李文軍，彭成.烏頭堿在大鼠體內(nèi)的毒代動(dòng)力學(xué)研究[J].湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，13(3)：21-23.

[10]韓金釗，胡晉紅.微透析技術(shù)在皮膚藥理學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國新藥雜志，2011，20(14)：1273.

[11]董冉冉，王萌，劉志東，等.微透析技術(shù)在中藥成分體內(nèi)分析研究中的應(yīng)用[J].中草藥，2015，46(20)：3117-3124.

PharmacokineticsofAconitineinRatsTreatedwithYuLongSanbyMicrodialysis

LI Huaiguo*，LIZihong，LIUDongwen，ZHENGFanghao

(FoshanHospitalofTCM，F(xiàn)oshan528000，China)

Objective：To investigate the pharmacokinetics of aconitine in rats treated with Yu Long San by microdialysis.Methods：The suitable microdialysis sampling technical conditions of aconitine were developed by investigating the velocity，the concentration of aconitine and other factors.The rat plasma samples were collected by microdialysis sampling technique.The concentration of aconitine was determined by LC-MS.Results：The suitable conditions of microdialysis for ephedrine were the velocity of 1.5 μL·min-1，sample interval for 30 min.The AUC was 18 973.27 h×ng·mL-1，MRT was 14.97h，Cmaxwas 2 976.38 ng·mL-1，Tmaxwas 11.76 h.Conclusion：Microdialysis is suitable for studying the pharmacokinetics of aconitine in rats treated with Yu Long San.

Yu Long San；aconitine；microdialysis

2014年佛山市醫(yī)學(xué)類科技攻關(guān)項(xiàng)目(2014AB00330)

] 李懷國，副主任藥師，研究方向：中藥新藥研發(fā)；Tel：(0757)81092310，E-mail：2402811567@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.7.016

2017-01-14)

*[