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    酸棗仁中蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析△

    2017-09-21 08:11:05張秋紅于姍姍李磊
    中國現(xiàn)代中藥 2017年7期

    張秋紅,于姍姍,李磊

    (1.濟南市食品藥品檢驗檢測中心,山東 濟南 250102;2.濟南市食品藥品檢驗檢測中心,山東 濟南 250102;3.濟南市第四人民醫(yī)院,山東 濟南 250000)

    酸棗仁中蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析△

    張秋紅1*,于姍姍2,李磊3

    (1.濟南市食品藥品檢驗檢測中心,山東 濟南 250102;2.濟南市食品藥品檢驗檢測中心,山東 濟南 250102;3.濟南市第四人民醫(yī)院,山東 濟南 250000)

    目的:比較不同產(chǎn)地及生炒酸棗仁的蛋白質(zhì)電泳結(jié)果,分析它們之間的共性和差異。方法:本實驗采用垂直平板聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)的技術(shù)對40個不同酸棗仁樣品進行分析評價。結(jié)果:根據(jù)電泳指紋圖譜整理分析的數(shù)據(jù)得到對酸棗仁的初步聚類分析結(jié)果。結(jié)論:聚丙烯酰胺凝膠電泳可以大致定性區(qū)別不同產(chǎn)地的酸棗仁樣品。

    酸棗仁;蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳;聚類分析

    2015版《中華人民共和國藥典》收載酸棗仁為鼠李科植物酸棗ZiziphusjujubaMill.var.Spinosa(Bunge) Hu ex H.F.Chou的干燥成熟種子。酸棗仁味甘、酸,性平。歸肝、膽、心經(jīng)。用于虛煩不眠,驚悸多夢,體虛多汗,津傷口渴[1]。酸棗仁為養(yǎng)心安神藥,生活中常被用作鎮(zhèn)靜、安眠、益肝類藥品和相關(guān)保健食品的原料之一[2-3]。酸棗仁主產(chǎn)于山東、河北、陜西、遼寧、河南等地,內(nèi)蒙古、甘肅、山西、安徽等地亦產(chǎn),山東酸棗資源十分豐富,是我國酸棗仁的主要產(chǎn)區(qū)之一,素有“東棗仁”之稱,產(chǎn)量大、質(zhì)量優(yōu),主要產(chǎn)于蒙陰、平邑、沂水、青州、臨朐、萊蕪、歷城、淄博、牟平等縣(市)[4]。酸棗仁中包含的化學(xué)成分有:脂肪酸、皂苷、黃酮類化合物、生物堿、氨基酸等其他成分[5-7],《中華人民共和國藥典》將酸棗仁皂苷A和斯皮諾素兩個化學(xué)成分作為指標(biāo)性成分來監(jiān)測酸棗仁質(zhì)量[8]。

    酸棗仁營養(yǎng)成分中脂肪占24.10%,蛋白質(zhì)占0.80%,碳水化合物占61.00%,蛋白質(zhì)是酸棗仁的主要成分之一。蛋白質(zhì)作為基因的直接穩(wěn)定產(chǎn)物,能反映生物DNA組成上的差異。種子蛋白是植物體中有高強度基因表達的一類,且能在種子內(nèi)積累大量而不降解的蛋白質(zhì),其電泳譜帶具有高度穩(wěn)定性、專一性和疊加性。種子蛋白作為遺傳標(biāo)記常被用于品種鑒定及植物繁育系統(tǒng)的鑒別[9-10]。而聚丙烯酞胺凝膠電泳(PAGE)有機械性能好、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、幾乎無滲電作用、樣品重復(fù)性高、樣品不易擴散、用量少、分辨率高、孔徑可調(diào)節(jié)等優(yōu)點,PACE應(yīng)用范圍廣可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等物質(zhì)的分離[11]。本實驗利用聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法對山東省內(nèi)、省外和一些進口的酸棗仁及其偽品的蛋白質(zhì)進行了分析,以便為酸棗仁的質(zhì)量控制研究提供輔助方法[12-16]。

    1 儀器、試劑與材料

    1.1 儀器

    FA2004型電子天平;超聲清洗機(南京先歐儀器制造有限公司);SK-1型快速混勻旋渦機(中國深圳國華儀器廠 );LGR16-W 型高速冷凍離心機(北京醫(yī)用離心機廠);BCD-215T BDZ型冰箱(青島海爾);微量進樣器;KE0053471型移液器(10~100 μL);移液器(100~1000 μL);普通注射器;DYCZ-24A 型電泳儀槽(北京六一儀器廠);DYY-8B型穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀(北京六一儀器廠);凝膠成像系統(tǒng)(BioSens SC 805);酸度計。

    1.2 材料

    樣品由濟南市食品藥品檢驗中心張秋紅老師提供,真品鑒定為酸棗ZiziphusjujubaMill.var.Spinosa(Bunge) Hu ex H.F.Chou的干燥成熟種子,實驗樣品的產(chǎn)地、處理方法、采收時間等信息見表1。

    表1 酸棗仁樣品信息

    1.3 試劑

    丙烯酰胺(Amresco0341-500G);雙丙烯酰胺(Amresco 0172);過硫酸銨;蔗糖(分析純,天津市勵特吉爾環(huán)保技術(shù)研究所,批號:2001.7.10);Tris(三羥甲基氨基甲烷,分析純,北京益利精細化學(xué)品有限公司,批號:940302);甘氨酸;瓊脂粉;TEMED(即四甲基乙二胺,上海展云化工有限公司,批號:1204055);溴酚藍;冰醋酸;考馬斯亮藍(R250);甲醇。分離膠緩沖液(pH 8.9),分離膠貯存液,0.56%過硫酸銨溶液,濃縮膠緩沖液(pH 6.7),濃縮膠貯存液,40%蔗糖溶液,電極緩沖液(pH 8.3),4%瓊脂液,脫色液均需按常規(guī)方法配制。所有試劑均為分析純。

    2 方法

    2.1 樣品與試劑的制備

    2.1.1 試劑的制備

    2.1.1.1 分離膠緩沖液 精密稱取Tris 36.6 g調(diào)節(jié)pH至8.9,定容至100 mL。

    2.1.1.2 分離膠貯液 精密稱取丙烯酰胺28 g和雙丙烯酰胺0.74 g,定容至100 mL。

    2.1.1.3 0.56%過硫酸銨 精密稱取過硫酸銨0.28 g,定容至50 mL。

    2.1.1.4 濃縮膠緩沖液 精密稱取Tris 2.99 g調(diào)節(jié)pH至6.7,定容至50 mL。

    2.1.1.5 濃縮膠貯液 精密稱取丙烯酰胺5 g和雙丙烯酰胺1.25 g,定容至50 mL。

    2.1.1.6 40%蔗糖溶液 精密稱取蔗糖40 g,定容至100 mL。

    2.1.1.7 電極緩沖液(pH 8.3) 精密稱取Tris 0.6 g、甘氨酸2.88 g,加純凈水1000 mL備用。

    2.1.1.8 考馬斯亮藍(R250)染色液 精密稱取考馬斯亮藍(R250)1 g,加少量甲醇溶解,用含20%甲醇和7%醋酸的水溶液稀釋至1000 mL。

    2.1.1.9 脫色液 甲醇100 mL、冰醋酸35 mL,加純凈水至500 mL。

    2.1.2 樣品的制備 精密稱定酸棗仁細粉各0.500 0 g,分別加入1 mL提取液(稀釋至5倍的濃縮膠緩沖液pH 8.9),研磨成勻漿狀,冰浴超聲提取15 min,冷凍離心,取清液,與等體積40%蔗糖溶液混合,作為供試品溶液,置冰箱內(nèi)冷藏。

    2.2 電泳槽安裝與凝膠制備

    將安裝好的兩塊電泳槽下方,注入瓊脂封底。按比例配置分離膠液80 mL,超聲脫氣10 min后加入TEMED 150 μL,混勻,立即緩緩注入已安裝好的兩塊凝膠模中,用膠頭滴管均勻地滴數(shù)滴純凈水于膠液上表面。待分離膠凝固,形成膠與水層之間的清晰的界面,用濾紙吸凈多余水分。取按比例配置濃縮膠膠液20 mL,超聲脫氣混勻10 min后加入TEMED 50 μL,注入兩塊凝膠模子中。分別插上樣品槽模板,待濃縮膠變?yōu)槿榘咨怪比〕鰳悠凡勰0?。凝膠的配制參見表2。

    表2 蛋白質(zhì)電泳凝膠的配制

    2.3 上樣與電泳

    用微量進樣器吸取樣品提取液10 μL,緩緩注入濃縮膠樣品槽內(nèi),其中0~20號樣品為第一組,21~40號樣品為第二組,采用平行條件點于兩塊凝膠電泳板。在負極槽電極緩沖液以溴酚藍指示劑示蹤,電泳開始時穩(wěn)流40 mA,待溴酚藍指示劑到達兩膠交界處時即樣品進入分離膠后,穩(wěn)流50 mA。待指示劑行至分離膠與濃縮膠界線以下9 cm時,關(guān)閉電源,停止電泳。電泳過程為防止溫度過高,整個過程應(yīng)在冰箱內(nèi)低溫下進行。

    2.4 染色與脫色

    打開電泳槽,取出凝膠板后,切去瓊脂與濃縮膠,保留分離膠,并標(biāo)記前沿。隨即將凝膠浸于考馬斯亮藍染色液中,室溫下染色1 h,取出,傾去染色液,用蒸餾水洗去凝膠表面附著的染料,脫色液漂洗數(shù)次,直至譜帶背景清晰。將凝膠板保存于7%醋酸溶液中。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 結(jié)果

    將脫去底色的電泳凝膠照相得到酸棗仁的蛋白質(zhì)電泳圖譜,結(jié)果見圖1;經(jīng)BioSens軟件分析,蛋白質(zhì)條帶在各凝膠指紋圖譜中的分布結(jié)果見圖2。

    圖1 酸棗仁樣品蛋白質(zhì)電泳圖譜

    3.2 分析

    根據(jù)電泳結(jié)果計算出每個品種各譜帶的Rf值,用0、1表示電泳譜帶的有無,在相同值位置上有蛋白質(zhì)譜帶的記為1,無帶記為0,結(jié)果見表3。采用NTSYSpc 2.10e統(tǒng)計分析軟件進行聚類分析,獲得聚類分析圖,見圖3[17-19]。

    圖2 酸棗仁蛋白質(zhì)電泳(Pro-PAGE)指紋圖譜

    表3 酸棗仁樣品蛋白條帶的Rf值

    圖3 酸棗仁蛋白質(zhì)電泳圖譜聚類圖

    4 討論與結(jié)論

    酸棗仁的蛋白質(zhì)電泳指紋圖譜出現(xiàn)較為明顯的峰帶15種,各個樣品共有峰說明酸棗仁種內(nèi)蛋白質(zhì)種類的一致性,其他峰的有無和峰形明顯不同,則體現(xiàn)了酸棗仁樣品之間的差異性。

    由酸棗仁聚類分析圖可以看出,所有樣品的相似性系數(shù)為0.53,真品酸棗仁與偽品兵豆(豆科兵豆屬)染色之后外形相似,兩者均是離瓣花亞綱植物種子,容易混淆,部分不法藥商在酸棗仁中混入偽品兵豆以假亂真,不僅影響酸棗仁藥效,還擾亂了藥材市場秩序。聚類分析得出酸棗仁與兵豆的差異系數(shù)是0.47,所以蛋白質(zhì)電泳可以初步鑒定酸棗仁真?zhèn)?;中國產(chǎn)地的酸棗仁樣品相似性系數(shù)是0.578;山東除了7個地區(qū)酸棗仁外,剩余大部分地區(qū)(77%)酸棗仁之間的相似性系數(shù)為0.64;山東泰安、萊蕪的酸棗仁與河北、山西、河南等部分省外酸棗仁共性較大,相似性系數(shù)達到0.665,可能與品種引進種植或者土壤性質(zhì)有關(guān)系;山東酸棗仁與中國其他地區(qū)產(chǎn)的酸棗仁差異程度為0.422;進口酸棗仁間的相似程度較高,達到0.76,且其蛋白譜帶顏色最淺,指紋圖譜峰形最少,明顯區(qū)別于國產(chǎn)酸棗仁,也說明進口酸棗仁蛋白種類及含量均低于國產(chǎn)酸棗仁。一些同產(chǎn)地酸棗仁炒制之后與原有生品出現(xiàn)差異,一些蛋白質(zhì)峰帶消失,說明酸棗仁炒制處理可能會破壞部分蛋白質(zhì),若想盡可能保護利用酸棗仁蛋白質(zhì),則不宜作炒制處理,盡量使用生品。酸棗仁染色之后與原生品產(chǎn)生差異,所以染色也可能會影響酸棗仁蛋白質(zhì)的穩(wěn)定保存。17號是從市場購入,產(chǎn)地未知,根據(jù)以上酸棗仁聚類分析圖結(jié)果,可以推斷其可能是山東產(chǎn)地的酸棗仁[20-21]。

    根據(jù)蛋白質(zhì)電泳圖譜中譜帶顏色的深淺可以粗略判斷酸棗仁中蛋白質(zhì)含量多少,酸棗仁炒制或者染色處理之后,它們的蛋白圖譜顏色與原來相比變淺,可見其蛋白含量減少了;從產(chǎn)地看,進口酸棗仁電泳圖譜顏色明顯比國產(chǎn)酸棗仁的淺,說明國產(chǎn)酸棗仁質(zhì)量一般優(yōu)于進口酸棗仁。

    蛋白質(zhì)是植物基因表達的產(chǎn)物,不同的品種具有不同的蛋白質(zhì)譜帶模式,用Pro-PAGE電泳指紋圖譜可以有效地鑒別植物的品種。種子蛋白穩(wěn)定且具有豐富的遺傳多樣性,可為許多中藥材品種的分析提供輔助依據(jù)。

    本實驗藥材提取方法簡單,使用凝膠板較小的DYCZ-24D型電泳槽得到的蛋白質(zhì)譜帶不清晰,換用凝膠板較大DYCZ-24A型電泳槽之后蛋白質(zhì)譜帶分離較好。另外酸棗仁是種子類藥材,含有很多的油脂成分會干擾種子蛋白質(zhì)的提取,對蛋白電泳實驗產(chǎn)生不利影響。已有文獻對瓜蔞種子蛋白6種提取方法作出比較:蛋白質(zhì)提取液提取法、TCA-丙酮法提取蛋白含量較高,但雜質(zhì)多,電泳譜帶嚴(yán)重展寬而且明顯拖尾;Tris-丙酮法提取的蛋白質(zhì)種類缺失嚴(yán)重;直接提取法提取蛋白含量少,但雜質(zhì)少,電泳譜帶清晰,離心2次譜帶更加清晰;所以水溶液直接提取法最適合用于聚丙烯酰胺凝膠電泳,而蛋白質(zhì)提取液提取法提出蛋白質(zhì)含量最高[22],故本實驗采用最簡單的水溶液直接提取法。實驗結(jié)果表明本實驗方法可定性分析酸棗仁蛋白質(zhì)、粗略判斷蛋白質(zhì)含量以區(qū)別不同產(chǎn)地酸棗仁,但其準(zhǔn)確度不高,有待找出更為準(zhǔn)確的實驗方法。

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    AnalysisofProteininSemenZiziphiSpinosaebyPolyacryamideGelElectophoresis

    ZHANG Qiuhong1,YUShanshan2*,LILei3

    (1.JinanCenterforFoodandDrugControl,Jinan250102,China;2.JinanCenterforFoodandDrugControl,Jinan250102,China3.TheFourthPeople′sHospitalofJinanCity,Jinan250000,China)

    Objective:To compare the protein of different kinds of Semen Ziziphi Spinosae by PAGE,and analyze their common ground and differentiation.Methods:Polyacryamide gel eletrophoresis was employed to analyze and evaluate 40 specimens of Semen Ziziphi Spinosae.Results:The elementary hierarchical cluster analysis results were obtained on the basis of pro-PAGE.Conclusion:Pro-PAGE can be used to rough qualitative distinguishing of Semen Ziziphi Spinosae specimens from different habitats.

    Semen Ziziphi Spinosae;Pro-PAGE;hierarchical cluster analysis

    山東省中醫(yī)藥管理局山東省中醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究項目(2011-241)

    ] 張秋紅 碩士,副主任中藥師,研究方向:中藥質(zhì)量控制與資源研究;E-mail:Zhangqh9886@126.com

    10.13313/j.issn.1673-4890.2017.7.013

    2017-01-13)

    *[

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