珍珠水解液的美白作用機(jī)理研究

鄧云云，王笑月，李才廣，孟宏，董銀卯，李麗*

(1.海南京潤珍珠生物技術(shù)股份有限公司，海南 ?？?570100；2.北京工商大學(xué) 理學(xué)院，北京 100048)

珍珠水解液的美白作用機(jī)理研究

鄧云云1，王笑月2，李才廣1，孟宏2，董銀卯2，李麗2*

(1.海南京潤珍珠生物技術(shù)股份有限公司，海南 海口 570100；2.北京工商大學(xué) 理學(xué)院，北京 100048)

目的：通過人的黑色素細(xì)胞實驗研究珍珠水解液的美白作用機(jī)理。方法：NaOH法測定黑色素細(xì)胞黑色素含量，實時熒光定量PCR法(RT-PCR)測定珍珠水解液對影響黑色素合成的相關(guān)基因酪氨酸酶基因(TYR)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(TRP1)及影響黑色素轉(zhuǎn)運的相關(guān)基因小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)。結(jié)果：濃度為0.25%、0.5%、0.75%的珍珠水解液可以抑制黑色素細(xì)胞的黑色素合成，3種濃度下的珍珠水解液均可抑制相關(guān)基因TRP1 mRNA的表達(dá)，0.25%濃度下可抑制TYR、TRP1及MITF的mRNA的表達(dá)。結(jié)論：珍珠水解液主要通過抑制黑色素合成過程中TRP1 mRNA的表達(dá)，從而抑制黑色素合成而發(fā)揮美白功效。

珍珠水解液；酪氨酸酶基因；酪氨酸酶相關(guān)蛋白1；小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子；黑色素含量；美白機(jī)制

珍珠是由珍珠貝科動物馬氏珍珠貝Pteriamartensii和蚌科動物三角帆蚌Hyriopsiscumingii和褶紋冠蚌Cristariaplicata的外套膜受刺激后的分泌物聚集而成，有安神定驚、明目消翁、解毒生肌的功能，主治驚悸失眠、驚風(fēng)癲痛、目赤翳障、瘡瘍不斂[1-2]。珍珠粉富含人體需要的多種蛋白質(zhì)及角蛋白肽類、多種氨基酸、24種微量元素和鈣等多種有效成分，具有抗疲勞、明顯降低過氧化酯作用，從而起到養(yǎng)顏護(hù)膚、延緩衰老之功效[3]，因而常被用作高級補(bǔ)養(yǎng)品和高檔化妝品的原料[4-5]。

研究表明，珍珠可通過抑制酪氨酸酶而發(fā)揮美白作用[6]，但對其具體的美白作用機(jī)制尚不明確。目前關(guān)于珍珠對皮膚美白功效的研究還處于起步階段，本文首次將樣品作用于人黑色素細(xì)胞模型，研究珍珠水解液抑制黑色素合成的作用機(jī)制，為其作為化妝品功效添加劑應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 細(xì)胞

1.2 供試品珍珠水解液制備

珍珠水解液工藝：珍珠粉 →乳酸化 →酸解珍珠液 →離心分離 →珍珠蛋白→ 酶解珍珠液。將離心分離時得到的酸解珍珠液與酶解珍珠液混合即可得到全成分的水解珍珠液。

1.3 試劑

DMEM培養(yǎng)基(gibco，批號：8115216)，胰蛋白酶-EDTA(gibco，批號：1676922)，雙抗混合液(gibco，批號：1697547)，PBS緩沖液(HyClone，批號：NAH1449)，MTT(Sigma)，DMSO(Amresco)，RNA提取試劑盒(Takara)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)，熒光染料(Takara)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，批號：150209)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 儀器耗材

無菌操作臺(北京世安科林凈化技術(shù)有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(ThermoScientific)，高速離心機(jī)(Eppendof)，倒置顯微鏡(Olympus)，酶標(biāo)儀(Tecan)，M3讀板儀(Molecular Device)，離心機(jī)(Thermo)，熒光定量PCR儀(BioRad)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

采用保護(hù)性耕作方式能夠改善土壤環(huán)境條件，提升土壤中的有機(jī)碳和活性有機(jī)碳含量，比傳統(tǒng)耕作方式更有利于植物生長。通過本次試驗研究，可以更好地認(rèn)識保護(hù)性耕作措施對于改善土壤條件和提高有機(jī)碳含量的效果，從而推廣保護(hù)性耕作措施，提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)水平。

選擇對數(shù)生長期的黑色素細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基傳代，置于培養(yǎng)箱37 ℃、5% CO2環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。

2.2 人源黑色素細(xì)胞細(xì)胞活率的測定

采用MTT法測定黑色素細(xì)胞活率。收集對數(shù)生長期黑色素細(xì)胞，以9000 個/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)過夜。分別加入終濃度為0.1% mg·mL-1的熊果苷，終濃度為0.25%、0.5%、0.75%的珍珠水解液，以未處理組作為細(xì)胞對照組，每組設(shè)3個復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束后，加入MTT，繼續(xù)孵育4 h后棄掉孔內(nèi)舊培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀490 nm波長下測定各孔吸光度(A)值。

細(xì)胞活率=(測定孔A值-空白對照A值)/(細(xì)胞對照組A值-空白對照A值)×100%

2.3 黑色素測定

取對數(shù)生長期黑色素細(xì)胞，以1×105個·mL-1的密度接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每瓶5 mL，培養(yǎng)過夜。分別加入終濃度為0.1% mg·mL-1的熊果苷，終濃度為0.25%、0.5%、0.75%的珍珠水解液，以未處理組作為細(xì)胞對照組。培養(yǎng)48 h后，棄掉培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，加入1M NaOH(10%DMSO)，刮取收集細(xì)胞，放入80oC水浴30 min，取上清液加入96孔板，M3讀板儀于475 nm讀取吸光度值。

黑色素含量變化=(測定孔A值-空白對照A值)/(細(xì)胞對照組A值-空白對照A值)

2.4 基因TYR和TRP1及MITF的熒光定量PCR檢測

首先以2×105孔的接種密度，接種細(xì)胞至6 孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育過夜；待6 孔板中細(xì)胞鋪板率達(dá)到50%左右時，進(jìn)行給藥。實驗設(shè)立給藥組與對照組，每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗組加入終濃度為0.25%、0.5%、0.75%的珍珠水解液，對照組加入培養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱分別孵育培養(yǎng)48 h。孵育培養(yǎng)結(jié)束后，棄掉培養(yǎng)液，每孔加入1 mL Trizol，吹打裂解細(xì)胞后，收樣。提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行熒光定量PCR 檢測。

本研究中使用的引物的序列如下表所示：

表1 熒光定量PCR的引物序列

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 供試品對人源黑色素細(xì)胞細(xì)胞活率及黑色素含量的影響

珍珠水解液在0.25%、0.5%、0.75%作用下，對黑色素細(xì)胞活率無明顯影響，可使黑色素細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)黑色素含量有所降低，如表2。

實驗數(shù)據(jù)如表2所示，珍珠水解液在0.25%、0.5%、0.75%作用下，對人源黑色素細(xì)胞無毒作用；與對照組比較，陽性對照組和樣品組均可使黑色素細(xì)胞內(nèi)黑色素含量有所降低，且陽性對照組和0.75%濃度的珍珠水解液的效果差異具有非常顯著性意義(P<0.01)。

3.2 熒光定量PCR檢測結(jié)果

根據(jù)熒光定量PCR檢測步驟開展檢測，檢測結(jié)果如表3。

實驗數(shù)據(jù)如表2所示，48 h后，與對照組相比，體積分?jǐn)?shù)為0.25%的珍珠水解液對人源黑色素細(xì)胞內(nèi)TYR、TRP1和MITF mRNA的表達(dá)均有非常顯著性的抑制作用(P<0.01)；體積分?jǐn)?shù)為0.5%、0.75%的珍珠水解液對人源黑色素細(xì)胞內(nèi)TYR和MITF mRNA的表達(dá)無明顯的影響，但卻抑制了TRP1 mRNA的表達(dá)，且差異具有非常顯著性意義(P<0.01)。

表2 珍珠水解液對于人源黑色素細(xì)胞細(xì)胞活率及黑色素含量的影響

注：與對照組相比，**表示P<0.01，*表示P<0.05。

表3 珍珠水解液對人源黑色素細(xì)胞中TYR、TRP1和MITF mRNA表達(dá)的影響

注：與對照組相比，**表示P<0.01，*表示P<0.05。

4 討論

珍珠，含有多種活性成分，自古就是美容養(yǎng)顏之佳品[5]。但目前關(guān)于珍珠美白的作用機(jī)理尚未有研究報道。本實驗建立了人的黑色素細(xì)胞模型，通過對黑色素合成相關(guān)基因的檢測，闡述珍珠水解液的美白作用機(jī)理。結(jié)果顯示，測試濃度下珍珠水解液具有較高的安全性，能夠在保持細(xì)胞生長的前提下抑制黑色素的生長；同時，在0.25%、0.5%、0.75%測試濃度下，珍珠水解液對黑色素合成關(guān)鍵酶TRP1的基因表達(dá)均具有顯著抑制作用，在0.25%測試濃度下，珍珠水解液對TYR、TRP1、MITF的基因表達(dá)均具有顯著的抑制作用。

酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(TRP1)和轉(zhuǎn)錄因子(MITF)均為參與黑色素合成和轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵酶。TYR是黑色素合成的關(guān)鍵酶，該酶催化黑色素合成早期限速反應(yīng)[7]。首先通過羥基化作用將酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槎喟?，然后多巴又被該酶氧化為多巴醌，最后在半胱氨酸的參與下，多巴醌被化學(xué)修飾為3-半光酰多巴和5-半光酰多巴，正是這兩種物質(zhì)氧化并聚合成褐黑色素。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，半胱氨酸逐步被消耗，多巴醌在酪氨酸酶的作用下形成多巴色素，接著多巴色素失去羧基并通過一系列的氧化和聚合反應(yīng)形成另一種暗褐色的色素二羥吲哚(DHI)。與此同時，由于多巴色素互變異構(gòu)酶(DCT)的存在使得部分多巴色素的羥基通過一系列的氧化與聚合反應(yīng)形成第三種黑色素形式——二羥吲哚羧酸(DHICA)，這種黑色素顏色較淺，呈棕褐色。至此，黑色素合成完全結(jié)束。TRP1是第一個克隆成功的色素基因，是黑色素細(xì)胞中含量最為豐富的糖蛋白，定位于黑色素小體膜，在黑色素合成過程中發(fā)揮重要作用[8]。在動物實驗中，TRP1的突變影響鼠棕黑色素的表達(dá)，這一過程是通過影響多巴氧化酶和/或DHICA氧化酶來實現(xiàn)的[9]。小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)作為黑色素細(xì)胞最重要的轉(zhuǎn)錄因子，在皮膚黑色素生成過程中，MITF作為分子開關(guān)，可調(diào)控TRPs家族的表達(dá)，參與黑色素的生成[10]。本實驗研究結(jié)果表明，珍珠水解液可通過抑制黑色素合成中的關(guān)鍵酶尤其是TRP1的基因表達(dá)而發(fā)揮美白作用。

本實驗研究結(jié)果為珍珠水解液作為美白的化妝品功效添加劑提供科學(xué)依據(jù)。

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Skin-whiteningMechanismofMargaritaLiquid

DENG Yunyun1，WANGXiaoyue2，LICaiguang1，MENGhong2，DONGyinmao2，LIli2*

(1.HainanJingrunBiotechnologyCo.Ltd.，Haikou570100，China；2.BeijingTechnologyandBusinessUniversity，Beijing100048，China)

Objective：To study skin-whitening mechanism of Margarita liquid by in vitro melanoma cells tests.Methods：The skin-whitening activities were evaluated by measuring human melanocytes melanin synthesis inhibition activity，and Real-time PCR(RT-PCR)method was further used to evaluate the expression of microphthalmia-associated transcription factor (MITF)，tyrosinase-related protein 1 (TRP1) and Tyrosinase(TYR)mRNA.Results：0.25%，0.5% and 0.75% concentration of Margarita liquid could significantly decreased human melanocytes melanin synthesis，all the three concentrations of Margarita liquid could decrease the expression of TRP1 mRNA，and 0.25% concentration of Margarita liquid could decrease the expression of TYR、TRP1 and MITF mRNA.Conclusion：Margarita liquid was detected to have skin-whitening activity through in vitro Human melanoma cells tests，it could be used as a skin-whitening cosmetic additive.

Margarita liquid；TYR；TRP1；MITF；melanin content；whitening mechanism

] 李麗，副教授，研究方向：化妝品植物功效原料與配方技術(shù)；Tel：(010)68987110，E-mail：lili2212@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.7.017

2016-09-30)

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