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    珍珠水解液的美白作用機(jī)理研究

    2017-09-21 08:11:09鄧云云王笑月李才廣孟宏董銀卯李麗
    中國(guó)現(xiàn)代中藥 2017年7期

    鄧云云,王笑月,李才廣,孟宏,董銀卯,李麗*

    (1.海南京潤(rùn)珍珠生物技術(shù)股份有限公司,海南 ???570100;2.北京工商大學(xué) 理學(xué)院,北京 100048)

    珍珠水解液的美白作用機(jī)理研究

    鄧云云1,王笑月2,李才廣1,孟宏2,董銀卯2,李麗2*

    (1.海南京潤(rùn)珍珠生物技術(shù)股份有限公司,海南 海口 570100;2.北京工商大學(xué) 理學(xué)院,北京 100048)

    目的:通過(guò)人的黑色素細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究珍珠水解液的美白作用機(jī)理。方法:NaOH法測(cè)定黑色素細(xì)胞黑色素含量,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(RT-PCR)測(cè)定珍珠水解液對(duì)影響黑色素合成的相關(guān)基因酪氨酸酶基因(TYR)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(TRP1)及影響黑色素轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)基因小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)。結(jié)果:濃度為0.25%、0.5%、0.75%的珍珠水解液可以抑制黑色素細(xì)胞的黑色素合成,3種濃度下的珍珠水解液均可抑制相關(guān)基因TRP1 mRNA的表達(dá),0.25%濃度下可抑制TYR、TRP1及MITF的mRNA的表達(dá)。結(jié)論:珍珠水解液主要通過(guò)抑制黑色素合成過(guò)程中TRP1 mRNA的表達(dá),從而抑制黑色素合成而發(fā)揮美白功效。

    珍珠水解液;酪氨酸酶基因;酪氨酸酶相關(guān)蛋白1;小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子;黑色素含量;美白機(jī)制

    珍珠是由珍珠貝科動(dòng)物馬氏珍珠貝Pteriamartensii和蚌科動(dòng)物三角帆蚌Hyriopsiscumingii和褶紋冠蚌Cristariaplicata的外套膜受刺激后的分泌物聚集而成,有安神定驚、明目消翁、解毒生肌的功能,主治驚悸失眠、驚風(fēng)癲痛、目赤翳障、瘡瘍不斂[1-2]。珍珠粉富含人體需要的多種蛋白質(zhì)及角蛋白肽類、多種氨基酸、24種微量元素和鈣等多種有效成分,具有抗疲勞、明顯降低過(guò)氧化酯作用,從而起到養(yǎng)顏?zhàn)o(hù)膚、延緩衰老之功效[3],因而常被用作高級(jí)補(bǔ)養(yǎng)品和高檔化妝品的原料[4-5]。

    研究表明,珍珠可通過(guò)抑制酪氨酸酶而發(fā)揮美白作用[6],但對(duì)其具體的美白作用機(jī)制尚不明確。目前關(guān)于珍珠對(duì)皮膚美白功效的研究還處于起步階段,本文首次將樣品作用于人黑色素細(xì)胞模型,研究珍珠水解液抑制黑色素合成的作用機(jī)制,為其作為化妝品功效添加劑應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與儀器

    1.1 細(xì)胞

    1.2 供試品珍珠水解液制備

    珍珠水解液工藝:珍珠粉 →乳酸化 →酸解珍珠液 →離心分離 →珍珠蛋白→ 酶解珍珠液。將離心分離時(shí)得到的酸解珍珠液與酶解珍珠液混合即可得到全成分的水解珍珠液。

    1.3 試劑

    DMEM培養(yǎng)基(gibco,批號(hào):8115216),胰蛋白酶-EDTA(gibco,批號(hào):1676922),雙抗混合液(gibco,批號(hào):1697547),PBS緩沖液(HyClone,批號(hào):NAH1449),MTT(Sigma),DMSO(Amresco),RNA提取試劑盒(Takara),反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara),熒光染料(Takara),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司,批號(hào):150209),其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.4 儀器耗材

    無(wú)菌操作臺(tái)(北京世安科林凈化技術(shù)有限公司);CO2培養(yǎng)箱(ThermoScientific),高速離心機(jī)(Eppendof),倒置顯微鏡(Olympus),酶標(biāo)儀(Tecan),M3讀板儀(Molecular Device),離心機(jī)(Thermo),熒光定量PCR儀(BioRad)。

    2 方法

    2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

    采用保護(hù)性耕作方式能夠改善土壤環(huán)境條件,提升土壤中的有機(jī)碳和活性有機(jī)碳含量,比傳統(tǒng)耕作方式更有利于植物生長(zhǎng)。通過(guò)本次試驗(yàn)研究,可以更好地認(rèn)識(shí)保護(hù)性耕作措施對(duì)于改善土壤條件和提高有機(jī)碳含量的效果,從而推廣保護(hù)性耕作措施,提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)水平。

    選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的黑色素細(xì)胞,經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化,用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基傳代,置于培養(yǎng)箱37 ℃、5% CO2環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。

    2.2 人源黑色素細(xì)胞細(xì)胞活率的測(cè)定

    采用MTT法測(cè)定黑色素細(xì)胞活率。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期黑色素細(xì)胞,以9000 個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板,培養(yǎng)過(guò)夜。分別加入終濃度為0.1% mg·mL-1的熊果苷,終濃度為0.25%、0.5%、0.75%的珍珠水解液,以未處理組作為細(xì)胞對(duì)照組,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,置于培養(yǎng)箱37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)48 h,培養(yǎng)結(jié)束后,加入MTT,繼續(xù)孵育4 h后棄掉孔內(nèi)舊培養(yǎng)基,加入二甲基亞砜溶解結(jié)晶,酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度(A)值。

    細(xì)胞活率=(測(cè)定孔A值-空白對(duì)照A值)/(細(xì)胞對(duì)照組A值-空白對(duì)照A值)×100%

    2.3 黑色素測(cè)定

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期黑色素細(xì)胞,以1×105個(gè)·mL-1的密度接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶,每瓶5 mL,培養(yǎng)過(guò)夜。分別加入終濃度為0.1% mg·mL-1的熊果苷,終濃度為0.25%、0.5%、0.75%的珍珠水解液,以未處理組作為細(xì)胞對(duì)照組。培養(yǎng)48 h后,棄掉培養(yǎng)基,PBS洗滌1次,加入1M NaOH(10%DMSO),刮取收集細(xì)胞,放入80oC水浴30 min,取上清液加入96孔板,M3讀板儀于475 nm讀取吸光度值。

    黑色素含量變化=(測(cè)定孔A值-空白對(duì)照A值)/(細(xì)胞對(duì)照組A值-空白對(duì)照A值)

    2.4 基因TYR和TRP1及MITF的熒光定量PCR檢測(cè)

    首先以2×105孔的接種密度,接種細(xì)胞至6 孔板中,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育過(guò)夜;待6 孔板中細(xì)胞鋪板率達(dá)到50%左右時(shí),進(jìn)行給藥。實(shí)驗(yàn)設(shè)立給藥組與對(duì)照組,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為0.25%、0.5%、0.75%的珍珠水解液,對(duì)照組加入培養(yǎng)液,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱分別孵育培養(yǎng)48 h。孵育培養(yǎng)結(jié)束后,棄掉培養(yǎng)液,每孔加入1 mL Trizol,吹打裂解細(xì)胞后,收樣。提取RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA后,進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)。

    本研究中使用的引物的序列如下表所示:

    表1 熒光定量PCR的引物序列

    2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    3 結(jié)果

    3.1 供試品對(duì)人源黑色素細(xì)胞細(xì)胞活率及黑色素含量的影響

    珍珠水解液在0.25%、0.5%、0.75%作用下,對(duì)黑色素細(xì)胞活率無(wú)明顯影響,可使黑色素細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)黑色素含量有所降低,如表2。

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表2所示,珍珠水解液在0.25%、0.5%、0.75%作用下,對(duì)人源黑色素細(xì)胞無(wú)毒作用;與對(duì)照組比較,陽(yáng)性對(duì)照組和樣品組均可使黑色素細(xì)胞內(nèi)黑色素含量有所降低,且陽(yáng)性對(duì)照組和0.75%濃度的珍珠水解液的效果差異具有非常顯著性意義(P<0.01)。

    3.2 熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

    根據(jù)熒光定量PCR檢測(cè)步驟開展檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果如表3。

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表2所示,48 h后,與對(duì)照組相比,體積分?jǐn)?shù)為0.25%的珍珠水解液對(duì)人源黑色素細(xì)胞內(nèi)TYR、TRP1和MITF mRNA的表達(dá)均有非常顯著性的抑制作用(P<0.01);體積分?jǐn)?shù)為0.5%、0.75%的珍珠水解液對(duì)人源黑色素細(xì)胞內(nèi)TYR和MITF mRNA的表達(dá)無(wú)明顯的影響,但卻抑制了TRP1 mRNA的表達(dá),且差異具有非常顯著性意義(P<0.01)。

    表2 珍珠水解液對(duì)于人源黑色素細(xì)胞細(xì)胞活率及黑色素含量的影響

    注:與對(duì)照組相比,**表示P<0.01,*表示P<0.05。

    表3 珍珠水解液對(duì)人源黑色素細(xì)胞中TYR、TRP1和MITF mRNA表達(dá)的影響

    注:與對(duì)照組相比,**表示P<0.01,*表示P<0.05。

    4 討論

    珍珠,含有多種活性成分,自古就是美容養(yǎng)顏之佳品[5]。但目前關(guān)于珍珠美白的作用機(jī)理尚未有研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立了人的黑色素細(xì)胞模型,通過(guò)對(duì)黑色素合成相關(guān)基因的檢測(cè),闡述珍珠水解液的美白作用機(jī)理。結(jié)果顯示,測(cè)試濃度下珍珠水解液具有較高的安全性,能夠在保持細(xì)胞生長(zhǎng)的前提下抑制黑色素的生長(zhǎng);同時(shí),在0.25%、0.5%、0.75%測(cè)試濃度下,珍珠水解液對(duì)黑色素合成關(guān)鍵酶TRP1的基因表達(dá)均具有顯著抑制作用,在0.25%測(cè)試濃度下,珍珠水解液對(duì)TYR、TRP1、MITF的基因表達(dá)均具有顯著的抑制作用。

    酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(TRP1)和轉(zhuǎn)錄因子(MITF)均為參與黑色素合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵酶。TYR是黑色素合成的關(guān)鍵酶,該酶催化黑色素合成早期限速反應(yīng)[7]。首先通過(guò)羥基化作用將酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槎喟?,然后多巴又被該酶氧化為多巴醌,最后在半胱氨酸的參與下,多巴醌被化學(xué)修飾為3-半光酰多巴和5-半光酰多巴,正是這兩種物質(zhì)氧化并聚合成褐黑色素。隨著反應(yīng)的進(jìn)行,半胱氨酸逐步被消耗,多巴醌在酪氨酸酶的作用下形成多巴色素,接著多巴色素失去羧基并通過(guò)一系列的氧化和聚合反應(yīng)形成另一種暗褐色的色素二羥吲哚(DHI)。與此同時(shí),由于多巴色素互變異構(gòu)酶(DCT)的存在使得部分多巴色素的羥基通過(guò)一系列的氧化與聚合反應(yīng)形成第三種黑色素形式——二羥吲哚羧酸(DHICA),這種黑色素顏色較淺,呈棕褐色。至此,黑色素合成完全結(jié)束。TRP1是第一個(gè)克隆成功的色素基因,是黑色素細(xì)胞中含量最為豐富的糖蛋白,定位于黑色素小體膜,在黑色素合成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[8]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,TRP1的突變影響鼠棕黑色素的表達(dá),這一過(guò)程是通過(guò)影響多巴氧化酶和/或DHICA氧化酶來(lái)實(shí)現(xiàn)的[9]。小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)作為黑色素細(xì)胞最重要的轉(zhuǎn)錄因子,在皮膚黑色素生成過(guò)程中,MITF作為分子開關(guān),可調(diào)控TRPs家族的表達(dá),參與黑色素的生成[10]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,珍珠水解液可通過(guò)抑制黑色素合成中的關(guān)鍵酶尤其是TRP1的基因表達(dá)而發(fā)揮美白作用。

    本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果為珍珠水解液作為美白的化妝品功效添加劑提供科學(xué)依據(jù)。

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    Skin-whiteningMechanismofMargaritaLiquid

    DENG Yunyun1,WANGXiaoyue2,LICaiguang1,MENGhong2,DONGyinmao2,LIli2*

    (1.HainanJingrunBiotechnologyCo.Ltd.,Haikou570100,China;2.BeijingTechnologyandBusinessUniversity,Beijing100048,China)

    Objective:To study skin-whitening mechanism of Margarita liquid by in vitro melanoma cells tests.Methods:The skin-whitening activities were evaluated by measuring human melanocytes melanin synthesis inhibition activity,and Real-time PCR(RT-PCR)method was further used to evaluate the expression of microphthalmia-associated transcription factor (MITF),tyrosinase-related protein 1 (TRP1) and Tyrosinase(TYR)mRNA.Results:0.25%,0.5% and 0.75% concentration of Margarita liquid could significantly decreased human melanocytes melanin synthesis,all the three concentrations of Margarita liquid could decrease the expression of TRP1 mRNA,and 0.25% concentration of Margarita liquid could decrease the expression of TYR、TRP1 and MITF mRNA.Conclusion:Margarita liquid was detected to have skin-whitening activity through in vitro Human melanoma cells tests,it could be used as a skin-whitening cosmetic additive.

    Margarita liquid;TYR;TRP1;MITF;melanin content;whitening mechanism

    ] 李麗,副教授,研究方向:化妝品植物功效原料與配方技術(shù);Tel:(010)68987110,E-mail:lili2212@163.com

    10.13313/j.issn.1673-4890.2017.7.017

    2016-09-30)

    *[

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