基于藥效學(xué)及正交試驗優(yōu)選雙貫清感滴丸的提取工藝△

逯雙，陳明月，曹廣尚，楊培民

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟南 250011)

基于藥效學(xué)及正交試驗優(yōu)選雙貫清感滴丸的提取工藝△

逯雙1，陳明月1，曹廣尚2*，楊培民2*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟南 250011)

目的：優(yōu)選復(fù)方組分中藥雙貫清感滴丸的提取工藝。方法：以反映該制劑抗流感病毒的藥效學(xué)指標(biāo)比較雙貫清感滴丸的水提和不同濃度的乙醇提取工藝，繼以主要指標(biāo)成分金絲桃苷、綿馬貫眾素含量綜合評分，采用正交試驗考察雙貫清感滴丸優(yōu)選工藝的乙醇濃度、溶劑用量、提取時間和提取次數(shù)。結(jié)果：根據(jù)抗流感病毒的藥效學(xué)指標(biāo)肺指數(shù)、肺指數(shù)抑制率以及理化指標(biāo)金絲桃苷、綿馬貫眾素的含量，可得雙貫清感滴丸最佳提取工藝為加10倍量75%乙醇，回流提取2次，每次1 h。結(jié)論：結(jié)合藥效學(xué)優(yōu)選的雙貫清感滴丸提取工藝穩(wěn)定可行，對保障制劑療效具有指導(dǎo)性意義。

雙貫清感滴丸；藥效學(xué)指標(biāo)；正交試驗；提取工藝

雙貫清感滴丸組方源于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院名老中醫(yī)臨床經(jīng)驗，由綿馬貫眾、貫葉金絲桃等藥味組成，是以“復(fù)方組分中藥”研究模式，采用現(xiàn)代分離純化技術(shù)制備的具有清熱、解毒、透表之功能，用于邪毒所致時行感冒的復(fù)方組分中藥。

傳統(tǒng)提取工藝研究多采用方中有效成分含量為指標(biāo)，而中藥制劑成分復(fù)雜，其物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，僅以化學(xué)成分作為參考指標(biāo)并不能全面評價制劑工藝[1-2]，因此本課題基于抗流感病毒作用的藥效學(xué)指標(biāo)[3-5]，對目前常用的提取方式傳統(tǒng)水煎煮和現(xiàn)代醇提取進行優(yōu)選，并以處方中綿馬貫眾素和金絲桃苷的含量作為主要理化指標(biāo)[6-9]，采用正交試驗進一步篩選雙貫清感滴丸的提取工藝，為本品的臨床療效提供保障。

1 儀器與材料

Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；LC-600B型數(shù)控超聲波清洗機(山東濟寧魯超超聲設(shè)備有限公司)；XMTD-4000型電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；AB135-S型電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)。

健康昆明種小白鼠40只，體重18～22 g，雌雄各半，由山東大學(xué)動物實驗中心提供。流感病毒亞甲型，鼠肺適應(yīng)株FM1，由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，-70 ℃冰箱保存，經(jīng)復(fù)蘇后在雞胚中傳代備用。

金絲桃苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111521-201507)；綿馬貫眾素對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號：10438-070234)；乙腈(美國Fisher公司，色譜純)；水為重蒸水；其余試劑均為分析純。

貫葉金絲桃、綿馬貫眾藥材均由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部提供，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院馬傳江副主任藥師鑒定分別為藤黃科植物貫葉金絲桃HypericumperforatumL.的干燥地上部分、鱗毛藤科植物綿馬貫眾DryopteriscrassirhizomaNakai的干燥根莖和葉柄殘基。

2 方法與結(jié)果

2.1 水提液和醇提液的制備

中藥所含成分復(fù)雜，包括有效成分、輔助成分及無效成分，根據(jù)物質(zhì)性質(zhì)不同，采用不同提取方法提取后所含的中藥成分也不盡相同。因此，篩選中藥的提取溶劑以達到最佳藥效尤其重要。本課題基于抗流感病毒作用的藥效學(xué)指標(biāo)，對目前最常用的提取方式傳統(tǒng)水煎煮和現(xiàn)代乙醇提取進行優(yōu)選，并設(shè)計不同濃度的乙醇提取，以考察提取溶劑對藥效的影響。故按處方比例稱取綿馬貫眾、貫葉金絲桃兩味藥材共4份，分別加12倍量水、8倍量60%乙醇、8倍量75%乙醇、8倍量90%乙醇，煎煮/回流提取2次，每次2 h，合并煎煮液濃縮至1 g·mL-1的溶液。

2.2 初步藥效學(xué)優(yōu)選

取昆明種小鼠50只，雌雄各半，隨機分為7組[10-11]，每組10只，分別編號為正常對照組、模型組、病毒唑組、水提取組、60%乙醇提取組、75%乙醇提取組和90%乙醇提取組。用乙醚淺麻醉小鼠后，正常對照組以0.9%氯化鈉溶液滴鼻，每只50 μL，其余各組選用流感病毒鼠肺適應(yīng)株FM1，以15個LD50病毒濃度，每只50 μL滴鼻感染小鼠。感染4 h后給小鼠灌胃給藥，水提液和醇提液劑量為10 mL·kg-1，病毒唑組給藥劑量為70 mg·kg-1，正常對照組給予相同體積的蒸餾水，每日1次，連續(xù)5 d。末次給藥2 h后，頸椎脫臼處死小鼠，稱量體重，解剖摘取全肺稱重，計算肺指數(shù)與肺指數(shù)抑制率，結(jié)果見表1。

(1)

肺指數(shù)抑制率=

表1 雙貫藥材不同提取工藝對小鼠感染病毒肺指數(shù)的影響

注：與正常對照組比較，##P<0.01；與病毒對照組比較，*P<0.05，**P<0.01;“—”表示無。

小鼠感染流感病毒5 d后處死，解剖發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠肺部病變明顯，其肺指數(shù)與正常對照組比較具有顯著性差別(P<0.01)，表明此模型成立。病毒唑組、水提取組及乙醇提取組對抗小鼠肺炎病變均有明顯抑制作用，3個濃度的乙醇提取液組之間無顯著性差異，但相對水提液組對FM1所致小鼠肺臟損傷均具有明顯保護作用(P<0.01)。不同提取方式導(dǎo)致藥物不同有效成分的溶出，從而有藥效不同程度的顯現(xiàn)。藥效學(xué)結(jié)果顯示，3個濃度的乙醇提取組效果明顯優(yōu)于水提組，說明藥物有效成分更易溶解在乙醇中而發(fā)揮藥效，而75%乙醇提取組抗流感效果最好，因此初步確定以75%乙醇進行提取，并在此基礎(chǔ)上繼續(xù)進行工藝參數(shù)優(yōu)選。

2.3 正交試驗設(shè)計

優(yōu)選乙醇對貫葉金絲桃、綿馬貫眾的提取工藝，采用正交試驗，分別以金絲桃苷、綿馬貫眾素的含量為指標(biāo)，對乙醇濃度、溶劑倍量、提取時間及提取次數(shù)進行考察。見表2。

按處方比例稱取貫葉金絲桃、綿馬貫眾藥材飲片，按照正交試驗設(shè)計因素水平表進行試驗，以乙醇回流提取，合并提取液，濾過，回收乙醇，濃縮成稠膏狀，減壓干燥，即得干浸膏。

表2 正交設(shè)計因素水平表

2.3.1 指標(biāo)成分的測定

2.3.1.1 色譜條件 kromasil C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液(16∶84)；檢測波長為360 nm(檢測金絲桃苷)；流動相為乙腈-三氯甲烷-異丙醇-0.5%磷酸(52∶8∶30∶10)；檢測波長285 nm；柱溫25 ℃(檢測綿馬貫眾素)；流速為1.0 mL·min-1；進樣量10 μL；柱溫為25 ℃。

2.3.1.2 對照品溶液的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取金絲桃苷對照品5.15 mg、綿馬貫眾素對照品5.96 mg，分別加入甲醇、三氯甲烷稀釋置25 mL容量瓶中，搖勻即得金絲桃苷及綿馬貫眾素對照品儲備液。

分別精密吸取兩種對照品溶液1、2、3、4、5、6 mL，分別置于10 mL容量瓶中，甲醇定容分別制備不同濃度的對照品混合溶液，按照以上色譜條件進樣，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對照品的進樣量(X)為橫坐標(biāo)，分別得金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=7 759.2X-532.09，r=0.999 0，線性范圍0.206～1.236 μg；綿馬貫眾素標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=2 615 494.75X+6 885.04，r=0.999 9，線性范圍0.238 4～1.430 4 μg。

2.3.1.3 供試品溶液的制備 取浸膏粉約1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密稱定，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，補足失重，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2 結(jié)果 按照L9(34)正交設(shè)計表的條件進行試驗，以金絲桃苷、綿馬貫眾含量為指標(biāo)成分進行綜合評分，優(yōu)選最佳工藝。金絲桃苷、綿馬貫眾素作為雙貫滴丸的主要指標(biāo)成分，通過比較發(fā)現(xiàn)，兩種指標(biāo)成分在75%的乙醇提取物中含量較其他濃度乙醇提取組中要高，這與75%乙醇提取組具有較好的抗流感病毒作用一致，說明理化性質(zhì)指標(biāo)綿馬貫眾素及金絲桃苷含量與其體現(xiàn)的藥效學(xué)指標(biāo)可能具有一定程度的正相關(guān)性。

因處方中以貫葉金絲桃及綿馬貫眾為主，故將金絲桃苷、綿馬貫眾素權(quán)重系數(shù)分別定為0.5和0.5?？偡?(金絲桃苷含量/金絲桃苷最高含量×0.5+綿馬貫眾素含量/綿馬貫眾素最高含量×0.5)×100%。實驗結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 正交試驗結(jié)果

表4 方差分析

注：F0.05(2，2)=19.00；F0.01(2，2)=99.00。

直觀分析表明，在所選因素水平范圍內(nèi)，對主要成分提取率影響順序為A>D>B>C。方差分析表明，乙醇濃度(A)和提取次數(shù)(D)對提取的影響均具有顯著性，溶劑倍數(shù)(B)和提取時間(C)對提取影響不顯著。綜合各因素水平及方差分析得出最佳提取工藝為A2B3C2D2，結(jié)合提取完全因素，考慮到節(jié)約能源等實際生產(chǎn)情況，最終確定最佳提取工藝為A2B2C1D2，即10倍量75%乙醇，回流提取2次，每次1 h。

2.3.3 驗證試驗 為驗證優(yōu)選工藝的可靠性及穩(wěn)定性，按處方比例稱取藥材共3份，每份150 g，按上述優(yōu)選最優(yōu)提取工藝進行驗證試驗，按2.2.1項下方法測定指標(biāo)成分含量，結(jié)果綿馬貫眾素總提取量分別為72.96、72.91、73.02 mg·g-1，貫葉金絲桃提取量分別為1.43、1.45、1.42 mg·g-1，表明該優(yōu)選工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論

中藥成分復(fù)雜、靶點多、作用機制不明了、物質(zhì)基礎(chǔ)不明確的性質(zhì)決定了單純的化學(xué)成分指標(biāo)并不能代表中藥的整體性質(zhì)。中藥有效成分提取后藥性也可能與原中藥具有很大差異，因此，單純的理化評價對中藥制劑提取具有很大的局限性。藥效學(xué)指標(biāo)可體現(xiàn)制劑所含成分的綜合作用，與臨床作用接近，直接比較不同提取工藝產(chǎn)物的藥效差異，對療效更具評價力。將理化指標(biāo)與藥效學(xué)指標(biāo)綜合[11-12]，評價制劑提取工藝，使中藥制劑工藝研究更具科學(xué)性和合理性。

故在雙貫清感滴丸工藝研究中，根據(jù)本方的臨床用途，首先結(jié)合抗流感病毒的藥效學(xué)研究對復(fù)方的水提和不同濃度的乙醇提取工藝進行優(yōu)選，結(jié)果表明，不同濃度的乙醇提取組藥效均優(yōu)于水煎組，因此本處方乙醇提取有利于藥效成分的發(fā)揮，揭示生產(chǎn)工藝選用合適的溶劑提取以保障制劑的療效。在此基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計以理化性質(zhì)的多指標(biāo)綜合評分優(yōu)化雙貫清感滴丸的醇提工藝，通過對比不同濃度乙醇提取的藥效學(xué)及其有效成分的含量，發(fā)現(xiàn)二者存在一定的相關(guān)性，即理化性質(zhì)指標(biāo)綿馬貫眾素及金絲桃苷含量與其體現(xiàn)的藥效學(xué)指標(biāo)呈正相關(guān)性，揭示以有效成分的含量作為藥效學(xué)代用指標(biāo)的可能性，確保篩選出的提取工藝更合理明確。綜合藥效學(xué)研究及正交設(shè)計篩選提取工藝，既兼顧中藥傳統(tǒng)的應(yīng)用方式，又克服中藥提取僅靠理化性質(zhì)出發(fā)的不足，以藥效評價來確保中藥提取工藝的先進性和有效性，兼顧復(fù)方指標(biāo)成分提取效率及藥效，對于傳統(tǒng)中藥處方的臨床療效與工藝優(yōu)選具有一定指導(dǎo)意義。

[1] 黃永亮，吳純潔，何曉燕.中藥提取工藝評價指標(biāo)的研究進展[J].中藥與臨床，2012，3(5)：49-52.

[2] 謝秀瓊.對中藥制劑工藝研究評價指標(biāo)的淺見[J].中藥新藥與臨床藥理，1999，10(4)：197-198.

[3] 李罡.中藥復(fù)方功效與藥效學(xué)指標(biāo)的相關(guān)分析[D].北京：中國中醫(yī)科學(xué)院，2006.

[4] 賈曉斌，黃洋，陳斌，等.藥效學(xué)結(jié)合正交試驗優(yōu)選通脈顆粒抗心肌缺血成分的提取工藝研究[J].中國中藥雜志，2011，36(2)：154-157.

[5] 于蓓蓓，呂凌，于宗淵，等.藥效學(xué)結(jié)合正交試驗優(yōu)選黃芩提取工藝[J].中國中藥雜志，2013，38(24)：4314-4318.

[6] 肖國君，葉利明，吳純潔，等.HPLC法測定綿馬貫眾中綿馬貫眾素的含量[J].藥物分析雜志，2005，25(5)：502-504.

[7] 劉釗，安熙強，斯建勇，等.綿馬貫眾的活性成分研究[J].西部醫(yī)學(xué)，2011，23(12)：2300-2302.

[8] 林萍，易宏偉，張斐.金絲桃苷藥理作用研究進展[J].中國現(xiàn)代中藥，2012，14(10)：23-26.

[9] 張成偉，周亞球，陳磊.金絲桃苷藥理作用研究進展[J].安徽醫(yī)藥，2007，11(11)：961-963.

[10]楊培民，曹廣尚.藥效學(xué)結(jié)合正交實驗優(yōu)選重樓克感滴丸的提取工藝[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2016，34(1)：11-13.

[11]周雪夢，陸春妮，亓文寶，等.清開靈和雙黃連口服液體內(nèi)抗禽流感病毒作用[J].中草藥，2011，42(7)：1351-1356.

ExtractionProcessofShuangguanQingganDroppingPillsBasedonOrthogonalDesignandPharmacodynamicIndex

LU Shuang1，CHENMingyue1，CAOGuangshang2*，YANGPeimin2*

(1.CollegeofPharmacy，ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250355，China；2.AffiliatedhospitalofShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250011，China)

Objective：To optimize the extraction of compositions in the compound prescription of Chinese herbs of Shuangguan Qinggan dropping pills.Methods：Based on the pharmacodynamics indexes of anti-influenza virus effect，the process of water extraction and alcohol extraction with different concentrations in Shuangguan Qinggan dropping Pills was compared.Employing the content of Hyperoside and Dryocrassine as the main index ingredients to comprehensive score，the effects of ethanol concentration，solvent volume，extraction times and extraction time on the extracting process were investigated by using orthogonal design.Results：According to the pharmacodynamics indexes of anti-influenza virus with lung index and the inhibition ratio of lung index，as well as the in dex ingredients of hyperoside and dryocrassine，the optimum extraction process was as follows：adding 10 times amount of 75% alcohol，refluxing and extracting for 2 times，1 h each time.Conclusion：The extraction process with pharmacodynamics optimization shows good stability，which could ensure the therapeutic effect.

Shuangguan Qinggan dropping pills；pharmacodynamics indexes；orthogonal design；extraction process

山東省高校中醫(yī)藥抗病毒協(xié)同創(chuàng)新中心資助項目(編號：XTCX2014C-02)

] 曹廣尚，主管藥師，研究方向：中藥制劑研發(fā)，Tel:(0531)68617919，E-mail：cgs198041@163.com；楊培民，教授、主任藥師，研究方向：中藥制劑研究開發(fā)，E-mail：jnypm7777@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.7.023

2016-09-01)

*[