藍(lán)莓果實(shí)中花青素類成分的超聲波提取工藝研究△

楊莉，李珂珂，李沙沙，陳書笑，陶麗，弓曉杰

(1.大連大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 大連 116622；2.大連大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116622)

藍(lán)莓果實(shí)中花青素類成分的超聲波提取工藝研究△

楊莉1，李珂珂2*，李沙沙2，陳書笑1，陶麗2，弓曉杰2*

(1.大連大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 大連 116622；2.大連大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116622)

目的：研究超聲波提取法提取藍(lán)莓中花青素類成分的工藝方法。方法：采用正交試驗(yàn)，選用L9(34)正交表考察超聲波提取法提取時(shí)，提取液的甲醇比例、提取液的鹽酸含量、提取時(shí)間和料液比對(duì)藍(lán)莓中花青素類成分提取率的影響?；ㄇ嗨氐目偤坑肏PLC法測(cè)定。結(jié)果：超聲波提取法提取花青素類成分影響因素的大小順序?yàn)辂}酸含量>甲醇比例>提取時(shí)間>料液比，最佳提取工藝條件為提取液80%甲醇-水溶液，提取液含鹽酸0.2%，料液比1 ∶25(g ∶mL)，提取時(shí)間50 min。結(jié)論：采用優(yōu)化的工藝條件穩(wěn)定可行，藍(lán)莓中花青素類成分的含量為5.12 mg·g-1。

藍(lán)莓；花青素；超聲波提取；正交試驗(yàn)

藍(lán)莓，又名藍(lán)漿果、越橘，為杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬Vaccinium多年生灌木果樹(shù)。藍(lán)莓果實(shí)風(fēng)味獨(dú)特，除富含維生素、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)等常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分以外，還富含花青素，并且種類豐富?；ㄇ嗨赜址Q花色素，是一類水溶性黃酮類化合物，廣泛存在于被子植物中[1-2]?；ㄇ嗨刈鳛橐环N天然食用色素，具有較好的營(yíng)養(yǎng)及藥理作用。目前研究表明，藍(lán)莓中花青素類成分具有抗糖尿病作用[3-4]、抗腫瘤作用[5-6]及保護(hù)心血管作用[7]等，因此未來(lái)在醫(yī)藥應(yīng)用方面，藍(lán)莓花青素將具有很大的發(fā)展前景。

花青素類成分常見(jiàn)的提取方法有溶劑浸提法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法等，超聲波法作為一種簡(jiǎn)便快捷的提取方法，已廣泛應(yīng)用于提取實(shí)驗(yàn)[8-9]。本文采用超聲波提取法，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化藍(lán)莓中花青素的提取工藝，預(yù)期為從藍(lán)莓果實(shí)中獲得較高含量的花青素類成分提供方法參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀[Agilent 1260，Agilent Zorbax Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，美國(guó)安捷倫科技公司]；超聲波清洗機(jī)(SB-5200DTD，寧波新芝生物科技股份有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELA N-1100，上海愛(ài)朗儀器有限公司)；低溫冷卻液循環(huán)泵(DLSB-5/20，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；電子天平[ME204/02，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。

1.2 試藥

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷 (Cy-glc)(北京恒元啟天化工技術(shù)研究院)；甲醇(色譜純，美國(guó)TEDIA 公司)；純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)；甲醇、丙酮、甲酸、鹽酸(分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；無(wú)水乙醇(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；蒸餾水為雙蒸水。

藍(lán)莓果實(shí)(北陸)采自遼寧省大連市亮甲店鎮(zhèn)藍(lán)莓種植基地，4 ℃保存。

2 方法和結(jié)果

2.1 總花青素含量的測(cè)定

總花青素含量的測(cè)定采用高效液相色譜法(HPLC)。色譜條件為流速：0.8 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：520 nm；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：A相為6%甲酸-水，B相為甲醇。洗脫條件：0 min：10%B；30 min：25%B；40 min：45%B。

以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(見(jiàn)圖1中色譜峰1)為對(duì)照品，花青素總量以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的含量表示。按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總花青素濃度[10]?；ㄇ嗨乜偭坑?jì)算式：

Z總=C總× d/W

(1)

式中：Z為花青素總含量(mg·g-1)；C為花青素總濃度(mg·mL-1)；d為花青素提取液總體積(mL)；W為藍(lán)莓樣品質(zhì)量(g)。

2.2 提取方法的確定

本實(shí)驗(yàn)首先選用超聲法及回流法兩種提取方法，通過(guò)對(duì)比提取物在HPLC中的圖譜特征，比較兩種提取方法的優(yōu)劣。

超聲提取法的提取條件：準(zhǔn)確稱取2 g干燥至恒重的藍(lán)莓果于250 mL錐形瓶中，按照料液比1∶10加入20 mL含0.2%鹽酸的甲醇，40 ℃、300 W下超聲提取30 min，抽濾，濾渣以上述操作重復(fù)提取一次，合并兩次濾液。將上述濾液在40 ℃下于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮，用甲醇定容至10 mL容量瓶中，得樣品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣10 μL進(jìn)行HPLC分析。色譜圖見(jiàn)圖1A。

回流法的提取條件：準(zhǔn)確稱取2 g干燥至恒重的藍(lán)莓果于250 mL圓底燒瓶中，加入20 mL含0.2%鹽酸的甲醇，70 ℃下回流提取30 min，抽濾，濾渣以上述操作重復(fù)提取一次，合并兩次濾液，冷卻至室溫。將上述濾液在40 ℃于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮，用甲醇定容至10 mL容量瓶中，得樣品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣10 μL進(jìn)行HPLC分析。色譜圖見(jiàn)圖1B。

注：A.超聲法；B.回流法；峰1為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷。圖1 超聲法和回流法得到藍(lán)莓提取物的色譜圖

對(duì)比圖1A和圖1B可知，盡管兩者提取出的花青素種類差別不大，但超聲法提取時(shí)，得到的花青素類化合物的峰面積要明顯大于回流法，進(jìn)一步計(jì)算其含量，超聲法提取時(shí)得到的總花青素含量為4.26 mg·g-1，回流法提取時(shí)得到的總花青素含量為1.58 mg·g-1，因此超聲法比較適合提取藍(lán)莓花青素類化合物。

2.3 提取溶劑的選擇

準(zhǔn)確稱取2 g干燥至恒重的藍(lán)莓果于250 mL錐形瓶中，分別按照料液比1∶10加入20 mL含0.2%鹽酸的甲醇、無(wú)水乙醇、蒸餾水、丙酮，40 ℃、300 W下超聲提取30 min，抽濾，濾渣以上述操作重復(fù)提取一次，合并兩次濾液。將上述濾液在40 ℃于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮，用甲醇定容至10 mL容量瓶中，得樣品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣10 μL進(jìn)行HPLC分析。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同提取溶劑對(duì)藍(lán)莓花青素提取含量的影響

2.4 提取次數(shù)的選擇

準(zhǔn)確稱取2 g干燥至恒重的藍(lán)莓果于250 mL錐形瓶中，按照料液比1∶10加入20 mL含0.2%鹽酸的甲醇，40 ℃、300 W下超聲提取30 min，抽濾，得濾液。分別以上述操作提取1次、2次及3次，合并濾液。將上述濾液在40 ℃于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮，用甲醇定容至10 mL容量瓶中，所得溶液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣10 μL進(jìn)行HPLC分析。

根據(jù)測(cè)定的結(jié)果，提取1次即可提取出絕大部分花青素(4.86 mg·g-1)，提取2次基本提取完全(5.06 mg·g-1)，提取3次，花青素總量與2次時(shí)基本相同，因此，綜合考量時(shí)間、成本、效果等多方面因素，本實(shí)驗(yàn)選擇超聲波提取次數(shù)為2次。

2.5 單因素試驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)分別考察了提取液濃度、提取液酸度、提取時(shí)間、料液比這4種因素在超聲波提取時(shí)對(duì)花青素提取量的影響。

2.5.1 提取液濃度的影響 選甲醇為提取溶劑，甲醇濃度依次為100%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 提取液中甲醇濃度對(duì)藍(lán)莓花青素提取含量的影響

由圖3可知，花青素總提取含量隨著甲醇濃度的減小先減小后增大再減小，當(dāng)甲醇濃度為80%時(shí)達(dá)到最大值，最終選擇甲醇濃度是80%作為最佳條件。

2.5.2 提取液鹽酸含量的影響 提取液中鹽酸的含量依次為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 提取液中鹽酸含量對(duì)藍(lán)莓花青素提取含量的影響

由圖4可知，隨著鹽酸濃度的增大，花青素的提取率基本呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在鹽酸含量為0.2%時(shí)總含量達(dá)到最大值，隨后花青素提取率開(kāi)始下降，分析原因可能是酸度過(guò)大，破壞花青素自身結(jié)構(gòu)導(dǎo)致，因此選擇提取液中鹽酸的最佳濃度為0.2%。

2.5.3 提取時(shí)間的影響 提取時(shí)間分別選擇20、25、30、35、40、45、50、55、60 min。結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 不同提取時(shí)間對(duì)藍(lán)莓花青素提取含量的影響

由圖5可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，花青素總量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在45 min時(shí)為最大得率，隨后開(kāi)始下降。原因可能為超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，超聲波的剪切作用導(dǎo)致花青素結(jié)構(gòu)遭到破壞[11]。因此，超聲波條件下提取的最佳時(shí)間為45 min。

2.5.4 料液比的影響 本實(shí)驗(yàn)所考察的料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35及1∶45。結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 料液比對(duì)花青素提取含量的影響

由圖6可知，當(dāng)料液比為較小值1∶5時(shí)，花青素提取率較低，當(dāng)料液比增大到1∶20時(shí)，提取率達(dá)到最高，之后隨著料液比繼續(xù)增加，提取率有所降低。這可能是由于液料比越大，植物細(xì)胞內(nèi)外的濃度差越大，傳質(zhì)推動(dòng)力也就越大，有效成分?jǐn)U散到細(xì)胞外的速度越大，越有利于花青素的析出，所以隨著料液比的增大，提取率開(kāi)始是增大的。而當(dāng)溶劑太多時(shí)，輻射出的超聲波被溶劑大量吸收，不能被藍(lán)莓完全吸收，藍(lán)莓的提取效果越來(lái)越差。

2.6 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的考察結(jié)果，對(duì)提取液甲醇濃度(%)、鹽酸含量(%)、超聲時(shí)間(min)、料液比(g∶mL)進(jìn)行4個(gè)因素3個(gè)水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，藍(lán)莓超聲提取最佳工藝組合為A2B2C3D3，即甲醇濃度為80%，鹽酸含量為0.2%，時(shí)間為50 min，料液比1∶25。結(jié)果與單因素試驗(yàn)有所偏差，這是由于各因素之間有交互作用引起的。由極差分析可知，超聲提取時(shí)影響花青素含量因素的主次順序?yàn)锽>A>C>D，即鹽酸含量的影響最大，其余依次為甲醇濃度、時(shí)間，料液比的影響最小。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

按最佳組合做平行實(shí)驗(yàn)，3次測(cè)量所測(cè)得藍(lán)莓中花青素含量為5.12 mg·g-1，高于正交試驗(yàn)中的最高組合第5號(hào)實(shí)驗(yàn)結(jié)果5.06 mg·g-1，這說(shuō)明實(shí)驗(yàn)所確定的最佳提取工藝條件是可靠的。

2.8 總花青素含量測(cè)定的方法學(xué)考察

2.8.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 將花青素對(duì)照品矢車菊素-3-O-葡萄糖苷配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照2.1的色譜條件，測(cè)定各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的線性關(guān)系方程：Y=19 845X-103.66，相關(guān)系數(shù)r為0.999 5，線性范圍為0.007 5 ～0.21 mg·mL-1。

表1 藍(lán)莓花青素提取的正交試驗(yàn)因素水平表

表2 藍(lán)莓花青素提取的正交試驗(yàn)結(jié)果

2.8.2 檢出限和定量限 將所配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液按照2.1中的色譜條件進(jìn)樣10 μL，調(diào)整進(jìn)樣濃度至信噪比分別為3和10，其相應(yīng)濃度即為所求，最終測(cè)得檢出限為0.30 μg·mL-1，定量限為0.75 μg·mL-1。

2.8.3 精密度 精確移取花青素對(duì)照品溶液，按照2.1中的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算峰面積值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果其RSD值為0.91%，表明該方法精密度較高。

2.8.4 穩(wěn)定性 取同一個(gè)藍(lán)莓樣品溶液，按照2.1中的色譜條件每隔2 h進(jìn)樣一次，同一天內(nèi)共進(jìn)樣5次，計(jì)算日內(nèi)精密度；每天進(jìn)樣一次，連續(xù)進(jìn)樣5 h，計(jì)算日間精密度。結(jié)果表明，日內(nèi)精密度試驗(yàn)的RSD值為0.85%，日間精密度試驗(yàn)的RSD值為1.02%，表明所測(cè)樣品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.8.5 準(zhǔn)確度 分別取1 mL已知濃度的藍(lán)莓樣品溶液3份，分別加入1 mL不同濃度的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對(duì)照品溶液，混合后按照2.1中的色譜條件進(jìn)樣3次，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果表明，平均回收率為99.97%，RSD值為1.81%,說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度較高。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選用4種溶劑對(duì)藍(lán)莓果實(shí)總花青素進(jìn)行提取，篩選出最佳提取劑為甲醇，并通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)研究了甲醇提取液濃度、鹽酸含量、提取時(shí)間、料液比這4個(gè)因素對(duì)藍(lán)莓花青素提取含量的影響。在實(shí)驗(yàn)考察的4種因素中，影響主次順序?yàn)椋蝴}酸含量>甲醇提取液濃度>時(shí)間>料液比，得到的最佳提取工藝條件為：甲醇濃度80%、鹽酸含量0.2%、提取時(shí)間50 min、料液比1∶25。此工藝方法簡(jiǎn)單、成本較低、可操作性強(qiáng)，可以應(yīng)用于藍(lán)莓花青素的工業(yè)提取，具有一定的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。

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StudyonUltrasonicExtractionofAnthocyaninsfromBlueberryFruit

YANG Li1，LIKeke2*，LIShasha2，CHENShuxiao1，TAOLi2，GONGXiaojie2*

(1.CollegeofEnvironmentalandChemicalEngineering，DalianUniversity，Dalian116622，China；2.CollegeofMedical，DalianUniversity，Dalian116622，China)

Objective：To study the method of extraction of anthocyanins from blueberry by ultrasonic extraction.Methods：Taking the ratio of methanol solvent，the ratio of added hydrochloric acid，the time of extraction and liquid to feed ratio as indexes，L9(34) orthogonal test was adopted to investigate the extraction of blueberry anthocyanins.The total content of anthocyanins was determined by HPLC.Results：The order of the influencing factors of ultrasonic extraction of anthocyanins from high to low was as follows：the content of hydrochloric acid，the ratio of methanol and the extraction time and liquid to feed ratio.Optimal ultrasonic extraction conditions were as follow：80% methanol-water as solvent which contained 0.2% hydrochloric acid，liquid to feed ratio was 25∶1(mL∶g)，50 min per time.Conclusion：The developed extraction process was stable and feasible，the content of anthocyanins in blueberry fruit was 5.12 mg·g-1.

Blueberry；anthocyanin；ultrasonic extraction；orthogonal test

遼寧省科技廳科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目(2014204007)；遼寧省優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(LR2013058)；遼寧省自然科學(xué)基金(2015020657)；國(guó)家自然科學(xué)基金 (81603272)

] 弓曉杰，教授，研究方向：中藥新藥開(kāi)發(fā)，E-mail：gxjclr@163.com；李珂珂，博士，研究方向：活性天然產(chǎn)物分離與活性篩選，E-mail：like905219@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.7.022

2017-03-13)

*[