馬齒莧水提物不同組分促進(jìn)小鼠小腸推進(jìn)活性篩選△

袁淑青，吳春珍，胡高達(dá)，張奇，劉英

(國(guó)藥集團(tuán) 國(guó)藥健康產(chǎn)業(yè)研究院有限公司，上海 201203)

馬齒莧水提物不同組分促進(jìn)小鼠小腸推進(jìn)活性篩選△

袁淑青，吳春珍，胡高達(dá)，張奇，劉英*

(國(guó)藥集團(tuán) 國(guó)藥健康產(chǎn)業(yè)研究院有限公司，上海 201203)

目的：為了揭示馬齒莧藥材中具有潤(rùn)腸通便功能的藥效物質(zhì)。方法：采用水提醇沉的方法制備馬齒莧總多糖和生物堿，并使用三氯甲烷和正丁醇的混合液脫除多糖中蛋白質(zhì)得到脫蛋白多糖，再使用AB-8大孔吸附樹脂分離上清液中低極性成分和高極性成分。制備洛哌丁胺致腸蠕動(dòng)抑制模型小鼠，采用碳墨推進(jìn)法，通過測(cè)定馬齒莧各活性組分模型小鼠小腸推進(jìn)的百分率及脫蛋白多糖正常小鼠小腸推進(jìn)百分率進(jìn)行篩選和評(píng)價(jià)。結(jié)果：制備得到馬齒莧多糖、馬齒莧脫蛋白多糖、馬齒莧生物堿、水提醇沉上清液中低極性成分和高級(jí)性成分；小鼠小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，馬齒莧多糖及脫蛋白多糖對(duì)腸蠕動(dòng)抑制模型小鼠的小腸推進(jìn)有促進(jìn)作用，而且馬齒莧脫蛋白多糖對(duì)正常小鼠、模型小鼠小腸推進(jìn)均有促進(jìn)作用，且呈良好的量效關(guān)系。結(jié)論：馬齒莧藥材中具有潤(rùn)腸通便功能的藥效物質(zhì)為多糖成分。

齒莧；活性組分；脫蛋白多糖；小腸推進(jìn)

《中藥大辭典》中記載[1]，馬齒莧PortulacaoleraceaL.為馬齒莧科馬齒莧屬植物馬齒莧的全草，又名五行草、長(zhǎng)壽菜等，適應(yīng)性強(qiáng)，分布廣泛。大量研究發(fā)現(xiàn)，馬齒莧中含有多種生理活性物質(zhì)，包括多糖類、有機(jī)酸類、黃酮類、生物堿類、萜類、氨基酸、維生素以及礦物質(zhì)等[2-5]?，F(xiàn)代藥理研究表明[6-9]，馬齒莧具有抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤以及潤(rùn)腸通便等功能。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明，馬齒莧水提物具有潤(rùn)腸通便功能，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。因此，本研究進(jìn)一步考察馬齒莧粗多糖、脫蛋白多糖、生物堿、水洗脫組分和醇洗脫組分對(duì)小鼠腸推進(jìn)的影響，以揭示其潤(rùn)腸通便的藥效物質(zhì)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1.2 材料

馬齒莧(上海雷允上藥業(yè)有限公司，批號(hào)：LY1408039)；鹽酸洛哌丁胺(西安楊森制藥有限公司，規(guī)格：2 mg，批號(hào)：140313152)；通便膠囊(浙江金諾康生物制藥有限公司，規(guī)格：0.45 g，批號(hào)：G20130569)；羧甲基纖維素鈉(重慶力宏精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：4040109)；活性炭粉(西隴化工股份有限公司，批號(hào)：20150230)；AB-8型大孔吸附樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)；工業(yè)乙醇、丙酮、無水乙醚、鹽酸、氫氧化鈉、氨水、三氯甲烷(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

昆明種小鼠(清潔級(jí)，雄性，18～22 g)，購(gòu)自上海復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，許可證號(hào)碼為SCXK(滬)2014-0004。

2 方法

2.1 馬齒莧各組分制備

2.1.1 粗多糖的制備 取馬齒莧藥材200 g，加入15倍體積蒸餾水，浸泡4 h，回流提取2次，每次1.5 h，經(jīng)200目濾膜過濾、合并濾液、減壓濃縮制得水提濃縮液。在濃縮液中緩慢加入95%工業(yè)乙醇，使醇含量達(dá)到80%左右，置于4 ℃的冰箱中沉淀分離24 h，分別抽濾分離收集上清液與離心分離下層沉淀。沉淀物依次經(jīng)無水乙醇、丙酮和無水乙醚洗滌數(shù)次，以除去殘留色素等雜質(zhì)，真空干燥，制得馬齒莧粗多糖，計(jì)算得率。

2.1.2 脫蛋白多糖的制備 取適量馬齒莧粗多糖，用蒸餾水溶解、混勻，按照料液體積比為3∶1加入三氯甲烷和正丁醇(6∶1)的混合液，振搖，離心，取水相，重復(fù)上述步驟5次，得到精制多糖上清液，減壓濃縮后，冷凍干燥，制得脫蛋白多糖，計(jì)算得率。

權(quán)重分配的合理與否將直接影響到評(píng)價(jià)結(jié)果的準(zhǔn)確性［5］。根據(jù)評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)普查工作戰(zhàn)略目標(biāo)的重要性應(yīng)分別賦予不同的權(quán)重。采用AHP法［6］，通過一致性檢驗(yàn)的即為該權(quán)重；未通過一致性檢驗(yàn)的指標(biāo)反饋給專家，重新進(jìn)行兩兩對(duì)比，直到所有的指標(biāo)的權(quán)重都通過一致性檢驗(yàn)。最后將所有專家得出的權(quán)重求權(quán)重算術(shù)平均值，得出的指標(biāo)體系的權(quán)重的結(jié)果見表1。

2.1.3 生物堿的制備 取馬齒莧水提醇沉上清液，用36%～38%鹽酸溶液調(diào)節(jié)其pH為3～4，攪拌均勻，抽濾，收集濾液。用10%氨水溶液調(diào)節(jié)濾液pH為9～10，攪拌均勻，用三氯甲烷進(jìn)行萃取，重復(fù)2次，合并三氯甲烷萃取液，減壓回收三氯甲烷，制得馬齒莧生物堿，計(jì)算得率。

2.1.4 水洗脫組分和醇洗脫組分的制備 取適量馬齒莧水提醇沉上清液，稀釋至一定濃度，超聲使均勻；調(diào)節(jié)吸附柱內(nèi)液面高度，一次性加入上樣液，上樣流速為5 mL·min-1，上樣液緩慢浸入大孔吸附樹脂至液面貼近樹脂平面，分別用5倍柱體積蒸餾水和70%乙醇洗脫，洗脫速度為10 mL·min-1，合并洗脫液，經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥，制得AB-8水洗脫組分和70%乙醇洗脫組分，計(jì)算得率。

2.2 藥物配制

2.2.1 10%碳墨混懸液的配制 稱取羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)2 g，加蒸餾水150 mL煮沸至透明，稱取活性碳粉20 g加入上述溶液中煮沸3次，待溶液涼后定容到200 mL，于冰箱中4 ℃保存，用前搖勻。

2.2.2 洛哌丁胺混懸液的配制 洛哌丁胺劑量為10 mg·kg-1。將膠囊內(nèi)容物研碎呈粉末后用1% CMC-Na溶液配制0.5 mg·mL-1的混懸液，充分搖勻后使用。

2.2.3 受試物溶液配制 將通便膠囊內(nèi)容物1.1 g、馬齒莧粗多糖1.3 g、馬齒莧脫蛋白多糖0.9 g、生物堿0.003 g、水洗組分0.03 g、醇洗組分0.06 g，分別用10%碳墨混懸液配成相應(yīng)濃度，充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.3 馬齒莧各組分對(duì)腸蠕動(dòng)抑制模型小鼠小腸推進(jìn)的影響

取雄性昆明種小鼠(18～22 g)，隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、粗多糖組、脫蛋白多糖組、生物堿組、水洗組分組、醇洗組分組，每組10只。實(shí)驗(yàn)前各組小鼠禁食不禁水20 h，正常組灌胃給予1% CMC-Na溶液，其余各組均灌胃給予鹽酸洛哌丁胺溶液(10 mg·kg-1)，給藥體積均為20 mL·kg-1，30 min后，正常組和模型組灌胃給予10%碳墨混懸液，其余各組小鼠均灌胃給予含相應(yīng)濃度受試樣品的10%碳墨混懸液，給藥體積均為0.5 mL/只，各受試溶液組小鼠的給藥劑量均相當(dāng)于《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定人用最大生藥劑量的50倍；25 min后，脫頸椎處死動(dòng)物，測(cè)量腸管長(zhǎng)度為“小腸總長(zhǎng)度”，從幽門至墨汁前沿為“墨汁推進(jìn)長(zhǎng)度”，按公式(1)計(jì)算墨汁推進(jìn)率。

(1)

2.4 脫蛋白多糖對(duì)正常小鼠小腸推進(jìn)影響的量效關(guān)系

取雄性昆明種小鼠(18～22 g)，隨機(jī)分為正常組、陽(yáng)性對(duì)照組、脫蛋白多糖低劑量組(0.4 g·kg-1)、脫蛋白多糖中劑量組(0.8 g·kg-1)、脫蛋白多糖高劑量組(1.6 g·kg-1)，每組10只。實(shí)驗(yàn)前各組小鼠禁食不禁水20 h，正常組灌服10%碳墨混懸液，脫蛋白多糖各組灌胃給予含相應(yīng)濃度受試樣品的10%碳墨混懸液，給藥體積均為0.5 mL/只，25 min后脫頸椎處死動(dòng)物，按前述方法測(cè)定腸管長(zhǎng)度，并計(jì)算墨汁推進(jìn)率。

2.5 脫蛋白多糖對(duì)腸蠕動(dòng)抑制模型小鼠小腸推進(jìn)影響的量效關(guān)系

取雄性昆明種小鼠(18～22 g)，隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、脫蛋白多糖低劑量組(0.4 g·kg-1)、脫蛋白多糖中劑量組(0.8 g·kg-1)、脫蛋白多糖高劑量組(1.6 g·kg-1)，每組10只。實(shí)驗(yàn)前各組小鼠禁食不禁水20 h，正常組灌胃給予1% CMC-Na溶液，其余各組均灌胃給予鹽酸洛哌丁胺溶液(10 mg·kg-1)，給藥體積均為20 mL·kg-1，30 min后，正常組和模型組灌胃給予10%碳墨混懸液，其余各組小鼠均灌胃給予含相應(yīng)濃度受試樣品的10%碳墨混懸液，給藥體積均為0.5 mL/只，25 min后、脫頸椎處死動(dòng)物，按前述方法測(cè)定腸管長(zhǎng)度，并計(jì)算墨汁推進(jìn)率。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

3 結(jié)果

3.1 馬齒莧各活性組分制備

按照2.1中方法制備馬齒莧粗多糖得率為20.5%(以生藥計(jì))，脫蛋白多糖為14.0%(以生藥計(jì))，生物堿得率為0.04%(以生藥計(jì))，水洗組分和醇洗組分得率分別為0.49%(以生藥計(jì))和0.94%(以生藥計(jì))。

3.2 馬齒莧各活性組分對(duì)腸蠕動(dòng)抑制模型小鼠小腸推進(jìn)的影響

表1數(shù)據(jù)表明，模型組小鼠的小腸推進(jìn)率顯著低于正常組(P<0.01)，說明小鼠腸蠕動(dòng)抑制模型制備成功；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的小腸推進(jìn)率顯著高于模型組(P<0.05)，粗多糖組與脫蛋白多糖小腸推進(jìn)率顯著高于模型組(P<0.01)。

表1 馬齒莧各活性組分對(duì)腸蠕動(dòng)抑制模型小鼠小腸推進(jìn)的影響

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 脫蛋白多糖對(duì)正常小鼠腸推進(jìn)影響的量效關(guān)系

表2結(jié)果顯示脫蛋白多糖中、高劑量組與正常組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，表明脫蛋白多糖有促進(jìn)正常小鼠小腸推進(jìn)的作用，且促進(jìn)作用隨著劑量增大而增強(qiáng)，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。

表2 脫蛋白多糖對(duì)正常小鼠小腸推進(jìn)影響的量效關(guān)系

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.4 脫蛋白多糖對(duì)腸蠕動(dòng)抑制模型小鼠腸推進(jìn)影響的量效關(guān)系

表3結(jié)果表明，與正常組相比，模型組小鼠的小腸推進(jìn)率顯著降低(P<0.01)，證明小鼠腸蠕動(dòng)抑制模型復(fù)制成功；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的小腸推進(jìn)率顯著增加(P<0.05)，馬齒莧脫蛋白多糖低、中、高劑量組小鼠的小腸推進(jìn)率均顯著高于模型組，且促進(jìn)小腸推進(jìn)作用呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系。

表3 脫蛋白多糖對(duì)腸蠕動(dòng)抑制模型小鼠腸推進(jìn)影響的量效關(guān)系

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

有研究證實(shí)[10-11]，馬齒莧可修復(fù)潰瘍性結(jié)腸炎(UC)模型小鼠的組織損傷，緩解功能性胃腸病患者的各種臨床癥狀等。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，馬齒莧水提物可促進(jìn)小鼠腸推進(jìn)，目前文獻(xiàn)沒有報(bào)道馬齒莧潤(rùn)腸通便的物質(zhì)基礎(chǔ)，也沒有報(bào)道馬齒莧多糖具有促進(jìn)小腸推進(jìn)作用。

通過本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，馬齒莧脫蛋白多糖對(duì)正常小鼠也具有一定的促進(jìn)小腸推進(jìn)作用，對(duì)腸蠕動(dòng)抑制模型小鼠小腸推進(jìn)促進(jìn)作用更加顯著。另外，馬齒莧脫蛋白多糖的腸推進(jìn)的促進(jìn)作用呈良好的量效關(guān)系。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[12-13]，黑木耳多糖可促進(jìn)正常小鼠的腸胃運(yùn)動(dòng)，并拮抗新斯的明所致腸胃功能亢進(jìn)；鎖陽(yáng)多糖對(duì)小鼠腸推進(jìn)具有明顯的促進(jìn)作用，并且可以拮抗由阿托品引起的小鼠腸蠕動(dòng)的抑制。文獻(xiàn)沒有報(bào)道馬齒莧多糖，特別是馬齒莧脫蛋白多糖對(duì)小鼠小腸推進(jìn)的促進(jìn)作用，有關(guān)小腸推進(jìn)的促進(jìn)作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究的發(fā)現(xiàn)為評(píng)價(jià)馬齒莧的潤(rùn)腸通便功能提供依據(jù)，也揭示了馬齒莧多糖為馬齒莧潤(rùn)腸通便的物質(zhì)基礎(chǔ)，為開發(fā)馬齒莧潤(rùn)腸通便藥物或保健品奠定了藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

[1] 南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典(上冊(cè))[M].2版.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2006：398-400.

[2] Liang X，Li L，Tian J，et al.A rapid extraction and analysis method for the simultaneous determination of 26 bioflavonoids inPortulacaoleraceaL.[J].Phytochemical Analysis，2014，25(6)：537-543.

[3] Liang X，Tian J，Li L，et al.Rapid determination of eight bioactive alkaloids inPortulacaoleraceaL.by the optimal microwave extraction combined with positive-negative conversion multiple reaction monitor (+/- MRM) technology[J].Talanta，2014，120：167-172.

[4] Petropoulos S Α，Karkanis A，F(xiàn)ernandes，et al.Chemical composition and yield of six genotypes of common purslane (PortulacaoleraceaL.)：An alternative source of omega-3 fatty acids[J].Plant Foods for Human Nutrition，2015，70(4)：420-426.

[5] Zhou Y X，Xin H L，Rahman K，et al.PortulacaoleraceaL.：A review of phytochemistry and pharmacological effects[J].BioMed Research International,2015.DOI: 10.1155/2015/925631.

[6] Noreen S，Hussain I，Tariq M I，et al.PortulacaoleraceaL.as a prospective candidate inhibitor of hepatitis C virus NS3 serine protease[J].Viral immunology，2015，28(5)：282-289.

[7] Lei X，Li J，Liu B，et al.Separation and Identification of Four New Compounds with Antibacterial Activity fromPortulacaoleraceaL[J].Molecules，2015，20(9)：16375-16387.

[8] 李鳳林，余蕾.馬齒莧多糖降血糖與血脂作用研究[J].中國(guó)食品添加劑，2011 (1)：64-68.

[9] Zhao R，Gao X，Cai Y，et al.Antitumor activity ofPortulacaoleraceaL.polysaccharides against cervical carcinoma in vitro and in vivo[J].Carbohydrate polymers，2013，96(2)：376-383.

[10]時(shí)鴻超，李雪梅，趙敏.馬齒莧對(duì)胃腸道功能的保護(hù)作用[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2014，20(6)：70-71.

[11]劉力，張歡.馬齒莧對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜病理形態(tài)的影響[J].陜西中醫(yī)，2010 (11)：1549-1551.

[12]張文婷，賈寧，王琦.黑木耳多糖對(duì)小鼠小腸推進(jìn)及胃排空的影響[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012 (8)：62-63.

[13]李蘭城.鎖陽(yáng)多糖對(duì)小鼠胃排空、小腸推進(jìn)功能的影響[J].北方藥學(xué)，2013，10(9)：43-44.

PreparationofActiveIngredientsfromPortulacaoleraceaandScreeningofTheirActivitiesonIntestinalPropulsion

YUAN Shuqing，WUChunzhen，HUGaoda，ZHANGQi，LIUYing*

(SinopharmHealthIndustryResearchCo.Ltd，Shanghai201203，China)

Objective：To elucidate the pharmacodynamic substances of smoothing intestine and relieving constipation inPortulacaoleracea.Methods：The water extraction and alcohol precipitation method was used to prepare the total polysaccharides and alkaloids，and a mixture of chloroform andn-butanol used to obtain removing protein polysaccharides.Meanwhile，the low polarity components and high polarity components were prepared by AB-8 macroporous resin.The loperamide-induced peristaltic inhibition model in mice was reproduced by measurement of carbon ink propulsion and used to screen the ingredients.Results：five active components fromP.oleraceaL were obtained and only total polysaccharides and removing protein polysaccharides showed to be potent on intestinal propulsion in mice，in which the removing protein polysaccharides were more potent.Conclusion：The pharmacodynamic substances of smoothing intestine and relieving constipation inP.oleraceaare polysaccharide components.

Portulacaoleracea；active components；removing protein polysaccharides；intestinal propulsion

上海市衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會(huì)資助項(xiàng)目(ZY3-FWMS-1-1001-KYJS-49，2014—2016)

] 劉英，碩士生導(dǎo)師，研究員，研究方向：藥理研究；Tel：(021)2057000-8787，E-mail：liuyingsipi@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.7.015

2016-11-01)

*[