HPLC同時(shí)測定不同產(chǎn)地半枝蓮中8個(gè)黃酮類成分的含量

王治陽，安華

(河南省中醫(yī)藥研究院 附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450003)

HPLC同時(shí)測定不同產(chǎn)地半枝蓮中8個(gè)黃酮類成分的含量

王治陽*，安華

(河南省中醫(yī)藥研究院 附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450003)

目的：建立同時(shí)測定不同產(chǎn)地半枝蓮中野黃芩苷、黃芩苷、野黃芩素、異野黃芩素、木犀草素、芹菜素、黃芩素和漢黃芩素含量的高效液相色譜法。方法：采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-0.1%甲酸水為流動相，梯度洗脫，檢測波長：350 nm，流速：1.0 mL·min-1，柱溫：25 ℃。結(jié)果：半枝蓮藥材中野黃芩苷、黃芩苷、野黃芩素、異野黃芩素、木犀草素、芹菜素、黃芩素和漢黃芩素分別在7.23～72.32、3.28～32.76、2.35～23.53、2.54～25.37、1.77～17.65、2.26～22.57、1.95～19.48 、3.52～35.24 μg呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r在0.998 3～0.999 9，平均加樣回收率為98.9%～99.9%。結(jié)論：該方法簡單、快速，為半枝蓮的質(zhì)量控制提供了參考。

半枝蓮；黃酮類；含量測定；高效液相色譜法

半枝蓮ScutellariabarbataD.Don為唇形科植物半枝蓮的干燥全草，具有清熱解毒、散瘀止血、利尿消腫等功效，用于治療熱毒癰腫、水腫、肺癰、腸癰、毒蛇咬傷、黃疸等[1-4]。半枝蓮黃酮是從半枝蓮中提取分離的黃酮類化合物，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、抗氧化和改善記憶障礙等多種藥理活性[5-7]。喬春峰等[8]采用兩種流動相系統(tǒng)對半枝蓮中野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素和芹菜素的含量進(jìn)行了測定。為了尋求更簡單、更全面的半枝蓮黃酮類成分的分析方法，本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測定不同產(chǎn)地半枝蓮中8個(gè)黃酮類成分野黃芩苷、黃芩苷、野黃芩素、異野黃芩素、木犀草素、芹菜素、黃芩素和漢黃芩素的高效液相色譜法。該法簡單快速，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，為半枝蓮藥材栽培及相關(guān)制劑的質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent ZORBAX色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；AS10200超聲處理器(天津特賽恩斯儀器有限公司)；Sartorius BT25S型電子分析天平(德國賽多利斯科技有限公司)；Bp21lD型電子天平(賽多利斯公司)；乙腈、甲酸為色譜純；水(超純水)，使用前均經(jīng)0.45 μm濾膜濾過；其余試劑均為分析純。

1.2 試藥

對照品野黃芩苷 (批號：110715-201318)、黃芩苷(批號：115265-201318)、野黃芩素(批號：110726-201318)、異野黃芩素(批號：111321-201318)、木犀草素(批號：1157135-201318)、芹菜素(批號：115624-201318)、黃芩素(批號：111595-201306)、漢黃芩素(批號：111514-201304)，均購自中國食品藥品檢定研究院。半枝蓮分別購自北京北大維信生物科技有限公司(產(chǎn)地：北京，批號：1157135-201318)、安徽威爾曼制藥有限公司(產(chǎn)地：安徽亳州)、湖南鑫和醫(yī)藥有限責(zé)任公司(產(chǎn)地：湖南長沙)、鄭州邦正醫(yī)藥有限公司(產(chǎn)地：河南鄭州)、成都青山利康藥業(yè)有限公司(產(chǎn)地：四川成都)、江蘇九泰醫(yī)藥有限公司(產(chǎn)地：江蘇江陰)、甘肅省平?jīng)鍪须]東藥業(yè)有限責(zé)任公司(產(chǎn)地：甘肅平?jīng)?和云南省久泰藥業(yè)有限公司(產(chǎn)地：云南麗江)，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)劉明鵬副教授鑒定為半枝蓮ScutellariabarbataD.Don的干燥全草。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脫(0→15 min，20%A；15→25 min，40%A；25→35 min，60%A；35→60 min，80%A)；流速：1.0 mL·min-1，檢測波長：350 nm，柱溫：25 ℃，進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取野黃芩苷、黃芩苷、野黃芩素、異野黃芩素、木犀草素、芹菜素、黃芩素和漢黃芩素對照品適量，分別用甲醇制成質(zhì)量濃度分別為72.32、32.76、23.53、25.37、17.65、22.57、19.48、35.24 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取半枝蓮粉末(20～40目) 1.0 g，置100 mL容量瓶中，加入70%的甲醇水70 mL，稱重，超聲(功率：600 W，頻率：40 kHz)提取45 min，放置至室溫，再次稱重，加70%甲醇水補(bǔ)足失去的重量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

3 結(jié)果

3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別取2.2項(xiàng)下制備的混合對照品溶液和供試品溶液各10 μL，按上述色譜條件測定。結(jié)果供試品中野黃芩苷、黃芩苷、野黃芩素、異野黃芩素、木犀草素、芹菜素、黃芩素和漢黃芩素之間分離度良好，且無雜質(zhì)干擾，結(jié)果見圖1。

注：A.對照品；B.供試品;1.野黃芩苷；2.黃芩苷；3.野黃芩素；4.異野黃芩素；5.木犀草素；6.芹菜素；7.黃芩素；8.漢黃芩素。圖1 半枝蓮及對照品HPLC圖

3.2 線性關(guān)系考察

分別精密量取2.2.1項(xiàng)下的混合對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，用70%甲醇水定容到1 mL容量瓶中(量取1.0 mL的樣品未定容)，搖勻，即為不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。分別精密吸取各10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以峰面積(Y)對濃度(X)進(jìn)行回歸分析，得野黃芩苷、黃芩苷、野黃芩素、異野黃芩素、木犀草素、芹菜素、黃芩素和漢黃芩素的回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r)見表1。

表1 野黃芩苷等8種成分的線性關(guān)系考察

3.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取2.2.1項(xiàng)下的對照品溶液，按上述色譜條件重復(fù)測定6次，結(jié)果野黃芩苷、黃芩苷、野黃芩素、異野黃芩素、木犀草素、芹菜素、黃芩素和漢黃芩素峰面積的RSD分別為1.17%、0.68%、0.79%、1.24%、0.76%、1.70%、0.97%和0.78%(n=6)，表明儀器精密度良好。

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取同一批產(chǎn)地河南鄭州的半枝蓮干燥粉末(20～40目)，按2.2.2項(xiàng)下方法操作，制備供試品溶液。依上述色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣10 μL，測得野黃芩苷、黃芩苷、野黃芩素、異野黃芩素、木犀草素、芹菜素、黃芩素和漢黃芩素峰面積的RSD分別為1.24%、0.85%、1.06%、1.26%、0.98%、1.27%、1.46%、0.89%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批產(chǎn)地河南鄭州的半枝蓮粉末(20～40目)6份，按2.2.2項(xiàng)下方法操作，制備供試品溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，測得野黃芩苷、黃芩苷、野黃芩素、異野黃芩素、木犀草素、芹菜素、黃芩素和漢黃芩素平均含量的RSD分別為1.37%、0.96%、0.82%、1.03%、0.86%、1.43%、1.68%、1.52%(n=6)，表明本方法重復(fù)性良好。

3.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的半枝蓮粉末(產(chǎn)地河南鄭州)約0.1 g，共6份。分別精密加入含野黃芩苷0.512 mg·mL-1、黃芩苷0.243 mg·mL-1、野黃芩素0.176 mg·mL-1，異野黃芩素0.183 mg·mL-1，木犀草素0.076 mg·mL-1、芹菜素0.106 mg·mL-1、黃芩素0.086 mg·mL-1、漢黃芩素0.212 mg·mL-1的對照品溶液0.8、1.0、1.2 mL，各2份。按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣測定各成分含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 半枝蓮中8種成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表2(續(xù))

3.7 樣品的含量測定

精密稱取不同產(chǎn)地的半枝蓮粉末(20～40目篩)各3份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣10 μL測定，分別計(jì)算其含量，結(jié)果見表3。

表3 半枝蓮樣品含量測定結(jié)果(n=3)

4 討論

4.1 供試品溶液的制備

本實(shí)驗(yàn)在制備供試品溶液時(shí)對“超聲提取45 min”和“加熱回流提取2 h”進(jìn)行了比較，結(jié)果所測各成分含量無明顯差異，但“加熱回流提取2 h”所測雜質(zhì)較多，因此選擇提取效率高、操作簡單且耗能少的超聲提取法用來制備供試品溶液。在超聲提取條件下，本文考察提取時(shí)間20、45、90 min，超聲提取20 min所得木犀草素和黃芩素的含量較低；而提取時(shí)間為45、90 min時(shí)所測各成分的含量無明顯差異，但提取時(shí)間為90 min時(shí)雜質(zhì)較多，因此超聲提取時(shí)間選擇45 min。本實(shí)驗(yàn)另考察不同提取溶劑(無水乙醇、70%乙醇水、50%乙醇水、甲醇、70%甲醇水和50%甲醇水)，發(fā)現(xiàn)用70%甲醇水作為提取溶劑各成分分離效果最好，且測得含量較高。因此，采用70%甲醇水作為提取溶劑。

4.2 流動相及其比例的選擇

本實(shí)驗(yàn)分別考察了不同比例的“甲醇-水”和“乙腈-水”系統(tǒng)作流動相，調(diào)整不同比例，發(fā)現(xiàn)各峰形對稱性均不好，野黃芩素、異野黃芩素和漢黃芩素不能達(dá)到基線分離。考慮到pH值對分離效果的影響，考察了“甲醇-0.1%甲酸水”、“乙腈-0.1%甲酸水”和“乙腈-0.4%磷酸水”，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脫(0→15 min，20%A；15→25 min，40%A；25→35 min，60%A；35→60 min，80%A)分離度良好，峰形較好，無雜質(zhì)干擾，基線較平整，保留時(shí)間合適。

4.3 檢測波長的選擇

取上述8個(gè)對照品，于200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，野黃芩苷、野黃芩素、黃芩素和漢黃芩素在322 nm吸收良好，黃芩苷、木犀草素、芹菜素在362 nm吸收較好，異野黃芩素在348 nm為最大吸收波長。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的不同檢測波長(275 nm[9]，350 nm[10]，315 nm[11])進(jìn)樣進(jìn)行色譜比較。當(dāng)波長為350 nm時(shí)各成分的峰形對稱好，基線平穩(wěn)，分離度高。

4.4 小結(jié)

本文采用HPLC測定半枝蓮中野黃芩苷、黃芩苷、野黃芩素、異野黃芩素、木犀草素、芹菜素、黃芩素和漢黃芩素含量，并比較不同產(chǎn)地半枝蓮中有效成分的差異。從表3可以看出，不同產(chǎn)地半枝蓮中野黃芩苷、黃芩苷、野黃芩素、異野黃芩素、木犀草素、芹菜素、黃芩素和漢黃芩素的含量差異很大，以安徽亳州、河南鄭州和甘肅平?jīng)龊肯鄬^高。此方法簡單快速，靈敏度高，具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，為半枝蓮藥材及其相關(guān)制劑的質(zhì)量控制提供了方法和依據(jù)，同時(shí)研究不同產(chǎn)地的半枝蓮品質(zhì)的差異為半枝蓮栽培提供參考。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：109-110.

[2] Wei L H，Lin J M，Wu G W，et al. Scutellaria barbata D.Don induces G1/S arrestviamodulation of p53 and Akt pathways in human colon carcinoma cells[J].Oncol Reports，2013 (4)：69-78.

[3] 盧小路，徐海波，石夢瑩，等.半枝蓮?fù)ㄟ^Hedgehog信號通路抑制結(jié)腸腫瘤干細(xì)胞自我更新[J].中藥藥理與臨床，2015，44(1)：144-147.

[4] Bardakci H，Skaltsa H，Milosevic-Ifantis T，et al.Antioxidant activities of severalScutellariataxaand bioactive phytoconstituents fromScutellariahastifoliaL.[J].Ind Crops Prod，2015，23(77)：196-203.

[5] 陳紅梅，謝翎.響應(yīng)面法優(yōu)化半枝蓮黃酮提取工藝及體外抗氧化性分析[J].食品科學(xué)，2016，37(2)：96-98.

[6] Liu H L，Chen B H，Kao T H，et al.Carotenoids composition inScutellariabarbataD.Don as detected by high performance liquid chromatography-diode array detection-mass spectrometry-atmospheric pressure chemical ionization[J].J Funct Foods，2014，8(5)：100-103.

[7] Marsh Z，Yang T H，Nopo-Olazabal L，et al.Effect of light，methyl jasmonate and cyclodextrin on production of phenolic compounds in hairy root cultures ofScutellarialateriflora[J].Phytochemistry，2014，107(11)：50-58.

[8] 喬春峰，韓全斌，宋景政，等.RP-HPLC測定半枝蓮藥材中4種主要黃酮類成分的含量[J].中國藥學(xué)雜志，2006，41(17)：1342-1344.

[9] Rao Y K，Geethangili M，F(xiàn)ang S H，et al.Antioxidant and cytotoxic activities of naturally occurring phenolic and related compounds：a comparative study[J].Food Chem Toxicol，2007，45：1770-1776.

[10]董琳，關(guān)薇薇，盛琳，等.HPLC同時(shí)測定裸花紫珠中4種黃酮[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20(3)：52-55.

[11]孟姝，林玉蓮，都述虎.HPLC同時(shí)測定利膽片中綠原酸和黃芩苷的含量[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，21(10)：78-79.

SimultaneousDeterminationof8FlavonoidsComponentsinScutellariabarbatabyHPLC

WANG Zhiyang*，ANHua

(HospitalAffiliatedHenanTraditionalChineseMedicineInstitute，Zhengzhou450003,China)

Objective：To establish an HPLC method for simultaneous determination of scutellarin，baicalein，scutellarein，isoscutellrein，luteolin，apigenin，baicalein，wogonin inScutellariabarbataextract from different sources.Methods：An Agilent ZORBAX SB- C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) column was used，the mobile phase consisted of acetointrile-0.1% methanoic acidwater for gradient elution，the flow rate was 1.0 mL·min-1，the detection wavelength was set at 274 nm and the column temperature was 25 ℃.Results：The linear ranges of scutellarin，baicalein，scutellarein，isoscutellrein，luteolin，apigenin，baicalein，wogonin were 7.23-72.32 μg，3.28-32.76 μg，2.35-23.53 μg，2.54-25.37 μg，1.77-17.65 μg，2.26-22.57 μg，1.95-19.48 μg and 3.52-35.24 μg，respectively，the correlation coefficient was between 0.998 3 and 0.999 9.the recovery (n=9) were 98.9%-99.9%.Conclusion：The established method is simple and rapid for the determination and quality control ofS.barbata.

Scutellariabarbata；flavonoids；determination；HPLC

] 王治陽，主管藥師，研究方向：中藥炮制；Tel：(0371)66331318，E-mail：2136825137@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.7.014

2016-11-20)

*[