潺槁樹根皮化學(xué)成分及其抗糖尿病靶點篩選研究△

吳悠楠，董琳，李祎瑩，譚銀豐，金燕，李友賓*，張小坡*

(1.海南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，海南 海口 571199；2.海南醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，海南 ?？?571199)

潺槁樹根皮化學(xué)成分及其抗糖尿病靶點篩選研究△

吳悠楠1，董琳1，李祎瑩2，譚銀豐1，金燕1，李友賓1*，張小坡1*

(1.海南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，海南 ?？?571199；2.海南醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，海南 海口 571199)

目的：對潺槁樹根皮化學(xué)成分進(jìn)行研究，并探索化合物降糖作用靶點。方法：采用硅膠、Sephadex LH-20等柱色譜以及半制備HPLC進(jìn)行分離，選擇14個與糖代謝相關(guān)靶點蛋白，采用分子對接技術(shù)探索化合物降糖作用的靶點。結(jié)果：從潺槁樹根皮中得到6個化合物，經(jīng)波譜學(xué)方法鑒定為N-反式-阿魏酰酪胺(1)、N-順式-阿魏酰酪胺(2)、N-反式-芥子酰酪胺(3)、錫蘭肉桂醇(4)、波爾定堿(5)、新木姜子堿(6)。分子對接結(jié)果表明，化合物5、6與蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)結(jié)合度最高。結(jié)論：化合物1～4為首次從該屬植物分離得到，化合物5、6可能通過調(diào)控PTP1B發(fā)揮功效。

潺槁樹根皮；化學(xué)成分；降糖靶點

潺槁樹Litseaglutinosa系樟科(Lauraceae)木姜子屬(Litsea)植物，主產(chǎn)于海南、廣西、廣東等我國嶺南地區(qū)。潺槁樹作為民間藥物，具有清熱解毒的功效[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，潺槁樹根皮提取物具有抗糖尿病作用[2]。化學(xué)成分研究表明，該植物中含有生物堿、木脂素、黃酮類成分[3-4]。為探索潺槁樹根皮中抗糖尿病的活性成分，本論文對潺槁樹根皮的化學(xué)成分進(jìn)行研究，從中得到6個化合物，分別鑒定為：N-反式-阿魏酰酪胺(1)、N-順式-阿魏酰酪胺(2)、N-反式-芥子酰酪胺(3)、錫蘭肉桂醇(4)、波爾定堿(5)、新木姜子堿(6)?；衔?～4首次從該屬植物中分離得到。已有文獻(xiàn)報道波爾定堿、新木姜子堿具有降血糖作用[5-6]，但未見其作用靶點的報道。本研究通過采用分子對接技術(shù)，將兩個化合物分別與14個與糖代謝相關(guān)的靶點進(jìn)行分子對接。結(jié)果表明，兩個化合物與蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)對接打分最高，提示波爾定堿、新木姜子堿可能通過調(diào)控PTP1B發(fā)揮功效。

1 儀器與材料

BRUKERAVⅢ600型核磁共振儀；超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；薄層色譜預(yù)制板(青島海洋化工廠)；柱色譜硅膠(100～200目，200～300目，青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20(Healthcare 公司)；LC-10AD二元低壓半制備液相色譜儀；Agilent半制備色譜柱(Phenyl，25.0 cm×2.5 mm，5μm)；普通試劑均為分析純(廣州化學(xué)試劑廠)；氘代試劑(中國科學(xué)院武漢波譜公司)。分子對接采用Discovery Studio 4.5軟件(BIOVIA公司)。

所用藥材于2016年5月采自海南省文昌市銅鼓嶺，經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院曾念開教授鑒定為樟科木姜子屬植物潺槁樹Litseaglutinosa的根皮。

2 提取與分離

潺槁樹根皮(7.0 kg)粉碎后，用70%乙醇水回流提取，提取3次，每次2 h。減壓回收溶劑，至無乙醇味。加水適量，石油醚(5 L)萃取3次，除去脂溶性成分，繼而用正丁醇(5 L)萃取3次，減壓濃縮后得到正丁醇萃取物(80 g)。正丁醇萃取物進(jìn)行硅膠柱色譜分離，采用二氯甲烷-甲醇(1∶0，85∶15，80∶20，50∶50)梯度洗脫，經(jīng)合并后得到流分Fr.A～Fr.H。Fr.A采用硅膠柱色譜分離，流動相為二氯甲烷-丙酮(9∶1)，再進(jìn)行凝膠柱色譜，流動相為甲醇，最后經(jīng)反相高效液相制備色譜分離，流動相為甲醇-水(65∶35)，得到化合物1(8.0 mg)、2(12.5 mg)、3(10.0 mg)。Fr.B采用硅膠柱色譜分離，流動相為二氯甲烷-丙酮(85∶15)，再進(jìn)行凝膠柱色譜，流動相為甲醇，最后經(jīng)反相高效液相制備色譜分離，流動相為甲醇-水(55∶45)，得到化合物4(8.6 mg)、5(535.5 mg)、6(628.0 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末，碘化鉍鉀反應(yīng)陽性，ESIm/z314.2 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ：7.26 (1H，d，J=15.6 Hz，H-7′)，7.10 (1H，d，J=2.4 Hz，H-2′)，6.96 (2H，d，J=8.0 Hz，H-2，6)，6.93 (1H，dd，J=8.0，2.4 Hz，H-6′)，6.75 (1H，d，J=8.0 Hz，H-5′)，6.65 (2H，d，J=8.0 Hz，H-3，5)，6.38 (1H，J=15.6 Hz，H-8′)，3.78 (3H，s，-OCH3)，3.41 (2H，t，J=7.2 Hz，H-7)，2.62 (2H，t，J=7.2 Hz，H-8)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ：165.7 (C-9′)，156.0 (C-4)，148.8 (C-4′)，148.3 (C-3′)，139.3 (C-7′)，129.8 (C-2，6)，129.5 (C-1)，121.9 (C-6′)，119.4 (C-8′)，116.0 (C-5′)，111.2 (C-2′)，115.6 (C-3，5)，57.0 (-OCH3)，41.0 (C-8)，34.4 (C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的一致[7]，故化合物1鑒定為N-反式-阿魏酰酪胺，為首次從該屬植物分離得到。

化合物2：白色粉末，碘化鉍鉀反應(yīng)陽性，ESIm/z314.4 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ：7.05 (1H，d，J=2.4 Hz，H-2′)，6.94 (2H，d，J=8.0 Hz，H-2，6)，6.93 (1H，dd，J=8.0，2.4 Hz，H-6′)，6.68 (1H，d，J=8.0 Hz，H-5′)，6.63 (2H，d，J=8.0 Hz，H-3，5)，6.45 (1H，d，J=11.2 Hz，H-7′)，5.70 (1H，J=11.2 Hz，H-8′)，3.78 (3H，s，-OCH3)，3.41 (2H，t，J=7.2 Hz，H-7)，2.62 (2H，t，J=7.2 Hz，H-8)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ：166.6 (C-9′)，156.0 (C-4)，147.8 (C-4′)，147.3 (C-3′)，137.3 (C-7′)，129.9 (C-2，6)，128.6 (C-1)，126.7 (C-6′)，121.5 (C-8′)，115.2 (C-5′)，114.2 (C-2′)，115.6 (C-3，5)，57.0 (-OCH3)，41.0 (C-8)，34.3 (C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的一致[8]，故化合物2鑒定為N-順式-阿魏酰酪胺，為首次從該屬植物分離得到。

化合物3：白色粉末，碘化鉍鉀反應(yīng)陽性，ESIm/z328.5 [M+H]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ：7.27 (1H，d，J=15.6 Hz，H-7′)，6.98 (2H，d，J=8.0 Hz，H-2，6)，6.80 (2H，s，H-2′，6′)，6.65 (2H，d，J=8.0 Hz，H-3，5)，6.42 (1H，J=15.6 Hz，H-8′)，3.75 (6H，s，-OCH3)，3.41 (2H，t，J=7.2 Hz，H-7)，2.62 (2H，t，J=7.2 Hz，H-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的一致[9]，故化合物3鑒定為N-反式-芥子酰酪胺，為首次從該屬植物分離得到。

化合物4：白色晶體，mp 138～140 ℃，ESIm/z407.1 [M+Na]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ：0.85，0.90，0.92 (各3H，J=6.6 Hz，19，20，15-CH3)，0.75 (3H，s，16-CH3)，1.18 (3H，s，17-CH3)，3.67 (1H，dd，J=9.6，3.6 Hz，H-1)，1.68 (1H，d，J=15.6 Hz，H-14a)，2.28 (1H，d，J=15.6 Hz，H-14b)，1.61 (1H，d，J=13.2 Hz，H-10a)，1.72 (1H，d，J=13.2 Hz，H-10b)，1.80 (1H，m，H-18)，1.95 (1H，m，H-2)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ：71.2 (C-1)，32.8 (C-2)，28.7 (C-3)，26.6 (C-4)，84.1 (C-5)，86.1 (C-6)，97.3 (C-7)，88.9 (C-8)，49.6 (C-9)，43.3 (C-10)，101.2 (C-11)，65.0 (C-12)，81.2 (C-13)，49.4 (C-14)，18.5 (C-15)，11.6 (C-16)，9.8 (C-17)，34.2 (C-18)，18.9 (C-19)，19.3 (C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[10]，故化合物4鑒定為錫蘭肉桂醇，為首次從該屬植物分離得到。

化合物5：無定形粉末，碘化鉍鉀陽性，ESIm/z360.2 [M+Na]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ：7.84 (1H，s，H-11)，6.70 (1H，s，H-8)，6.48 (1H，s，H-3)，3.77 (3H，s，10-OCH3)，3.56 (3H，s，1-OCH3)，2.92 (1H，m，H-7a)，2.88 (1H，m，H-4b)，2.86 (1H，m，H-5a)，2.75 (1H，dd，J=12.0，2.0 Hz，H-6a)，2.38 (3H，s，N-CH3)，2.28 (1H，m，H-5b)，2.22 (1H，m，H-7b)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ：149.5 (C-2)，146.5 (C-10)，146.3 (C-9)，143.0 (C-1)，130.1 (C-7a)，129.2 (C-3a)，126.6 (C-1a)，125.9 (C-1b)，123.2 (C-11a)，115.7 (C-8)，114.7 (C-3)，112.4 (C-11)，62.7 (C-6a)，53.3 (C-5)，59.7 (1-OCH3)，56.2 (10-OCH3)，44.2 (N-CH3)，34.2 (C-7)，29.0 (C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[11]，故化合物5鑒定為波爾定堿。

化合物6：結(jié)晶性粉末，碘化鉍鉀陽性，mp 189～191 ℃，ESIm/z346.0 [M+Na]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ：7.86 (1H，s，H-11)，6.72 (1H，s，H-8)，6.54 (1H，s，H-3)，3.78 (1H，dd，J=13.2，3.6 Hz，H-6a)，3.80 (3H，s，10-OCH3)，3.60 (3H，s，1-OCH3)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ：153.4 (C-2)，149.8 (C-9)，148.8 (C-1)，146.3 (C-10)，128.8 (C-7a)，128.6 (C-3a)，128.4 (C-1b)，124.8 (C-1a)，122.1 (C-11a)，117.0 (C-8)，116.2 (C-11)，113.9 (C-3)，64.6 (C-6a)，61.2 (1-OCH3)，56.8 (10-OCH3)，42.6 (C-5)，34.9 (C-7)，28.8 (C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[12]，故化合物6鑒定為新木姜子堿。

4 靶點的準(zhǔn)備與對接

查詢國內(nèi)外的文獻(xiàn)報道選取與糖代謝相關(guān)的關(guān)鍵靶點作為研究對象，分別有14個靶點，包括：過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα，IK71)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ，IK74)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K，1E7V)、蛋白激酶 A(PKA，3L9L)、蛋白激酶B(AKT，4EKL)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α，2AZ5)、胰島素受體底物1(IRS1，IK3A)、胰島素受體底物2(IRS2，3BU5)、磷酸腺苷活化蛋白激酶α(AMPKα，3AQV)、有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK，4QNY)、促分裂原活化蛋白激酶2(MEK2，1TVO)、促分裂原活化蛋白激酶2(MEK2，1S9I)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1(ERK1，2ZOQ)、抑癌基因(LKB1，2WTK)、蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B，2QBQ)，括號內(nèi)代表化合物的英文名稱和PDB號。從蛋白質(zhì)PDB結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫下載得到14個靶點的三維晶體結(jié)構(gòu)并保存為PDB格式。利用Discovery Studio(4.5)軟件Flexible Docking模塊對靶點蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)處理，具體操作是提取配體去除水分子及其他配體為蛋白質(zhì)加氫并進(jìn)行能量優(yōu)化選擇，其余參數(shù)均為默認(rèn)設(shè)置。將每個化合物分別與14個靶點按默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行分子對接。

5 分子對接結(jié)果

Flexible Docking模塊先對蛋白活性口袋的側(cè)鏈產(chǎn)生多個構(gòu)象，然后將配體對接到受體的活性口袋當(dāng)中，最后對得到的配體-受體復(fù)合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化。Flexible Docking最大的優(yōu)勢在于準(zhǔn)確，可以精細(xì)地研究配體-受體的相互作用信息。通過將波爾定堿、新木姜子堿與14個靶點對接，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩個化合物與PTP1B蛋白結(jié)合較好，提示這些成分的功效可能與調(diào)控PTP1B密切相關(guān)。波爾定堿與PTP1B對接示意圖見圖1。

圖1 波爾定堿與PTP1B蛋白結(jié)合示意圖

6 討論

本論文報道了從潺槁樹根皮中分離得到6個化合物，其中4個為首次從該屬植物分離得到。另外，文獻(xiàn)報道波爾定堿、新木姜子堿具有抗糖尿病作用，然而它們的作用靶點并不清楚。通過采用分子對接的方法，首次發(fā)現(xiàn)這兩個化合物與PTP1B對接程度最高。波爾定堿、新木姜子堿的抗糖尿病作用極可能與調(diào)控PTP1B相關(guān)。

[1] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999.

[2] 張闿珍，王刃余，謝振家，等.潺稿治療糖尿病86例臨床分析[J].福建中醫(yī)藥，1985，16(4)：13-14.

[3] Pan J Y，Zhang S，Wu J，et al.Litseaglutinan A and lignans fromLitseaglutinosa[J].Helv Chim Acta，2010，93：951-957.

[4] Wang Y S，Huang R，Lu H，et al.A new 2′-oxygenated flavone glycoside fromLitseaglutinosa(Lour.) C.B.Rob.[J].Biosci Biotechnol Biochem，2010，74(3)：652-654.

[5] Chi T S，Lee S S，Su M J.Antihyperglycemic effect of aporphines and their derivatives in normal and diabetic rats[J].Planta Med，2006，72：1175-1180.

[6] Lin C J，Chen C H，Liu F W，et al.Inhibition of intestinal glucose uptake by aporphines and secoaporphies[J].Life Sci，2006，79：144-153.

[7] 陳湛娟，劉秀萍，畢和平.山蒼子枝的化學(xué)成分研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與化工，2013，33(4)：97-100.

[8] 余文怡，鄧亮，李蘭，等.云南地方晾曬煙化學(xué)成分研究[J].昆明學(xué)院學(xué)報，2015，37(6)：25-27.

[9] 李云志，宮錚，馬超，等.豆瓣綠的酰胺類化學(xué)成分[J].中國中藥雜志，2010，35(4)：468-469.

[10]趙凱，姜勇，薛培鳳，等.國產(chǎn)肉桂的化學(xué)成分研究[J].中草藥，2013，44(17)：2358-2363.

[11]張水英，郭強(qiáng)，曹愿，等.豆豉姜的生物堿類成分研究[J].中國中藥雜志，2014，39(20)：3964-3968.

[12]張君增，方起程.山橿化學(xué)成分的研究[J].中草藥，1994，25(11)：565-568.

ChemicalConstituentsfromBarkofLitseaglutinosaandTheirAntidiabeticTargets

WU Younan1，DONGLin1，LIYiying2，TANYinfeng1，JINYan1，LIYoubin1*，ZHANGXiaopo1*

(1.SchoolofPharmaceuticalScience，HainanMedicalUniversity，Haikou，571199，China；2.SchoolofBasicandLifeSciences，HainanMedicalUniversity，Haikou，571199，China)

Objective：To study the chemical constituents from the bark ofLitseaglutinosaand to investigate their antidiabetic targetsinsilico.Methods：Silica gel and Sephedex LH-20 column chromatographies as well as semi-preparative HPLC were applied to isolate and purify the compounds.Molecular docking was used to evaluate the binding activities of the ligands and the 14 selected proteins.Results：Six compounds were obtained and identified asN-trans-feruloyltyramine (1)，N-cis-feruloyltyramine (2)，N-trans-sinapoyltyramine (3)，cinnzeylanol (4)，boldine (5)，laurolitsine (6).Molecular docking results showed that compounds5and6banded well with PTP1B.Conclusion：Compounds1-4were isolated from genusL.glutinosafor the first time.Compounds5and6may exert their biological activities through regulating PTP1B.

Bark ofLitseaglutinosa；chemical constituents；targets of hypoglycemia

國家自然科學(xué)基金(81202994)

] 李友賓，研究員，研究方向：南藥黎藥的開發(fā)，E-mail：liyoubinli@sohu.com；張小坡，教授，研究方向：南藥黎藥的開發(fā)，E-mail：z_xp1412@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.7.010

2016-11-14)

*[