基于ITS2序列的朱砂根及其混偽品分子鑒定△

陳新連，周建國，馬雙姣，姚輝，林余霖，王瑀

(中草藥物質(zhì)基礎與資源利用教育部重點實驗室 中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所，北京 100193)

基于ITS2序列的朱砂根及其混偽品分子鑒定△

陳新連，周建國，馬雙姣，姚輝，林余霖，王瑀*

(中草藥物質(zhì)基礎與資源利用教育部重點實驗室 中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所，北京 100193)

目的：應用ITS2序列對朱砂根及其混偽品進行鑒定研究，為中藥臨床準確用藥、市場規(guī)范化管理等提供依據(jù)和保障。方法：對朱砂根及其混偽品進行DNA提取、PCR擴增ITS2序列、雙向測序，對序列進行比對、計算遺傳距離。結(jié)果：朱砂根ITS2序列長度為217 bp，種內(nèi)有10個變異位點，有9種單倍型，平均G+C含量為59.1%，除變種紅涼傘外，朱砂根與其各混偽品的種間最小遺傳距離均大于朱砂根種內(nèi)最大遺傳距離，所以利用ITS2序列可以鑒別朱砂根及其混偽品。結(jié)論：實驗結(jié)果表明ITS2序列可以鑒別朱砂根及其混偽品，但對于其與變種的關系需進一步研究。

朱砂根；鑒別；ITS2序列；DNA條形碼；混偽品

中藥材朱砂根為紫金?？浦参镏焐案鵄rdisiacrenataSims的干燥根。本品根簇生于略膨大的根莖上，呈略彎曲的圓柱形，表面灰棕色或棕褐色，有多數(shù)縱皺紋和橫環(huán)狀斷裂痕，皮部與木部易分離。質(zhì)硬而脆，易折斷，斷面不平坦，皮部厚，約占斷面的1/3～1/2，類白色或粉紅色，外側(cè)有紫紅色斑點散在，習稱“朱砂點”，木部黃白色，不平坦。氣微，味微苦，有刺舌感，有解毒消腫、活血止痛、祛風除濕之功效[1]。朱砂根為民間常用中草藥之一，根、葉可用于跌打風濕、消化不良、咽喉炎及月經(jīng)不調(diào)等癥。果可食，亦可榨油，油可供制肥皂。朱砂根也可作觀賞植物，在園藝方面的品種較多[2]。此外，其在抗炎抑菌、抗腫瘤、抗生育、抗HIV、抑制血小板聚集、降低血壓等方面也有很好的療效[3-7]。

在第四次全國中藥資源普查中發(fā)現(xiàn)，朱砂根野生資源目前較為豐富，主要分布于長江中、下游的重慶、四川、貴州、云南、廣東和廣西等地，藥用方面基本全部來源于野生朱砂根[8]。朱砂根常與其同屬植物混在一起使用[9-10]，同時，由于牡丹皮和山豆根市場價格較高，三者的外部形態(tài)相似，有不法商販將朱砂根混在牡丹皮、山豆根中使用[10-12]，牡丹皮是毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的根皮，為清熱涼血、活血化瘀之藥[1]，山豆根是豆科植物越南槐SophoratonkinensisGagnep.的根及根莖，有清熱解毒、消腫利咽的作用[1]。此混偽現(xiàn)象嚴重影響了臨床的安全用藥和藥材的規(guī)范化管理、流通。中藥材的傳統(tǒng)鑒別方法較難區(qū)分此類混偽品，且過度依賴專業(yè)人員的主觀判斷，而DNA條形碼鑒定技術(shù)是利用基因組中一段公認相對較短的序列進行特異性物種識別鑒定，可有效彌補傳統(tǒng)鑒別的局限，其自2003年被提出后就受到國際廣泛關注[13]。該技術(shù)物種鑒定效率高，且技術(shù)方法簡單，穩(wěn)定性好、可重復性強，不受外界環(huán)境以及樣品形態(tài)和材料部位的限制，顯著提高了鑒定的效率與準確性。其中，對于植物類藥材，ITS2序列具有很高通用性，易于擴增、測序，且長度適宜，約230 bp，同時也具有足夠的變異以區(qū)分不同的物種，絕大多數(shù)中藥材可以通過ITS2序列進行鑒定[14-15]。本研究應用ITS2序列對朱砂根及其混偽品進行鑒定研究，以期為其臨床用藥安全提供依據(jù)。

1 材料

朱砂根樣品包括基原植物樣本、藥材樣本、種子樣本、復核樣本和對照藥材等，采自廣東、江西、湖北、安徽、四川等地，種子樣本來自國家藥用植物種質(zhì)資源庫。此外，還從GenBank下載了部分物種的ITS2序列，所有下載序列應用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)方法在NCBI(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/)和中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)(http：//www.tcmbarcode.cn/china/)進行驗證，確保準確可靠。具體的樣本信息見表1。

表1 朱砂根及其混偽品樣品信息表

2 方法

2.1 DNA提取

將根類樣品用75%乙醇棉擦拭干凈，取約40 mg樣品，取變色硅膠干燥基原植物葉片樣品約20 mg，朱砂根的種子呈球形，直徑約為6～9 mm，在靠近種皮的位置取樣約40 mg，磨碎，用植物基因組提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取總DNA，加裂解液，葉片樣品65 ℃水浴2 h，其余樣品56 ℃水浴8～12 h，主要原理是通過使細胞壁、細胞膜溶解破裂，DNA暴露，再經(jīng)過多步除雜、沉淀、清洗、吹干、洗脫等過程，去除酚類、蛋白質(zhì)、RNA等，最終得到較為純凈的總DNA備用。

2.2 PCR擴增及測序擴增

選用25 μL體系，參照Chen等的研究方法[16]，所用引物為正向ITS2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′和反向ITS3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′，用12.5 μL 2×Taq Master Mix(北京艾德萊生物科技有限公司)，正反向引物各取1 μL，DNA模板2 μL，用8.5 μL ddH2O補足體積至25 μL。擴增程序：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；56 ℃，30 s；72 ℃，45 s，40個循環(huán)；72 ℃，10 min。擴增完成后，用凝膠成像儀在紫外光下觀察其電泳后在瓊脂糖凝膠中的條帶亮度，并與Marker AL2000(北京艾德萊生物科技有限公司)對比來判斷擴增情況，包括目的條帶的有無、估算產(chǎn)物濃度及序列長度[17]。最后將PCR產(chǎn)物送往中國農(nóng)業(yè)科學院開放實驗室進行雙向測序。

2.3 數(shù)據(jù)處理獲得的測序結(jié)果

應用CodonCode Aligner 5.1.5進行拼接，去除低質(zhì)量區(qū)，然后基于隱馬爾科夫進行ITS2序列注釋，最后用MEGA6.0 (MolecularEvolutionary Genetics Analysis) 進行種內(nèi)種間變異位點、遺傳距離的分析?；诒菊n題組自行編寫的代碼[18-19]，將朱砂根及其主要混偽品牡丹皮、山豆根的主導單倍型ITS2序列轉(zhuǎn)換為DNA條形碼和二維DNA條形碼圖片。

3 結(jié)果與分析

本研究獲得朱砂根ITS2序列48條，長度為217 bp，G+C含量為58.5%～60.2%，平均G+C含量為59.1%，種內(nèi)變異位點10個，有9個單倍型，主導單倍型占50%，朱砂根種內(nèi)變異位點具體信息見表2。

表2 朱砂根ITS2序列種內(nèi)變異位點

注：*表示與第一行堿基相同，-表示堿基缺失。

朱砂根主導單倍型(以ZHSG0005為例)與其同屬植物ITS2序列比對長度為217 bp，共有25個變異位點，詳細信息見圖1。朱砂根與其混偽品種間序列比對長度為249 bp，有142個變異位點。

朱砂根種內(nèi)及其與各混偽品間的K2P距離請見表3。由表3可以看出，除變種紅涼傘外，朱砂根與其他各混偽品的種間最小遺傳距離均大于種內(nèi)最大遺傳距離，因此用ITS2序列可以區(qū)分鑒別開。

注：.表示與第一行堿基相同。圖1 朱砂根主導單倍型與其同屬植物ITS2序列種間變異位點

表3 朱砂根種內(nèi)及其與各混偽品的K2P距離

朱砂根及其主要混偽品牡丹皮、山豆根的藥材飲片圖片、主導單倍型ITS2序列DNA條形碼和二維DNA條形碼圖片見圖2。其中DNA條形碼和二維DNA條形碼圖片中以不同顏色代表不同的核苷酸，數(shù)字表示堿基序列長度，右側(cè)部分二維碼圖片為物種拉丁名和DNA條形碼序列轉(zhuǎn)換而成，形象化展示各物種的DNA條形碼。通過移動終端(如手機等)上的二維碼掃描軟件可以識讀獲得物種拉丁名及ITS2序列信息，可通過移動終端上的網(wǎng)頁瀏覽器登錄中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)(www.tcmbarcode.cn)進行物種鑒定。

圖2 朱砂根、牡丹皮和山豆根藥材圖片及其對應基原的DNA條形碼和二維DNA條形碼圖片

4 討論

根類藥材細胞中含大量次生代謝產(chǎn)物，如多糖和多酚，這些物質(zhì)在DNA提取過程中與DNA共沉淀，形成黏稠的膠狀物難以溶解或產(chǎn)生褐變[20]；同時，種子類樣品富含油脂、酚類、多糖類等物質(zhì)，會干擾DNA的提取，所以提取時應適當增大取樣量，增大裂解液的用量，延長水浴時間，盡可能提取較高質(zhì)量的DNA，利于實驗的進行，在研磨前加大聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)的用量，并在加裂解液前用核分離液[100 mmol·L-1Tris-HCL(pH 8.0)，20 mmol·L-1EDTA(pH 8.0)，0.7 mmol·L-1NaCl，2% PVP-40，0.4%β-巰基乙醇]多次洗滌、離心至上清液不呈黏稠狀。之前就有很多研究者在實驗時進行過相似的處理[21-23]。

紅涼傘是朱砂根的變種，朱砂根種內(nèi)最大遺傳距離(0.031 3)大于紅涼傘與朱砂根的種間最小遺傳距離(0)，因而無法從ITS2序列水平鑒別這兩種植物。根據(jù)《中國植物志》記載，二者作為單獨的兩個種是不恰當?shù)模式o予歸并[2]。《中國植物志》記錄兩者植物形態(tài)上的主要區(qū)別是，變種的葉背、花梗、花萼及花瓣均帶紫紅色，有的植株葉兩面均為紫紅色，兩者在植株外形無太大差異，僅顏色不同，從標本上看，尤其是在野外采集記錄不詳而標本壓制不得當時，二者更是無法區(qū)別，而活的植株中，顏色的深淺也有過渡，并且二者在藥用性能方面基本一致[2]。在最新版的《Flora of China》中，紅涼傘已合并至朱砂根。對于朱砂根與其變種的鑒別，目前還沒有找到合適的方法，答國政等[24]基于ITS2序列對紫金牛屬矮地茶藥材進行基因識別研究時，也發(fā)現(xiàn)朱砂根和紅涼傘在NJ樹中混為一支，無法鑒別分開。徐玲玲等[25]基于核ITS與葉綠體trnL-F序列對12種紫金牛屬植物的種間關系與變異進行的研究，為朱砂根與其同屬其他植物鑒定提供了啟示。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，應用葉綠體全基因組篩選特異性DNA序列[26]對二者進行區(qū)分，或?qū)⑷~綠體全基因組作為超級條形碼對二者的關系進行深入的研究。

藥用植物栽培過程中，種子是最基礎、最重要的起點[27]，本實驗對朱砂根不同產(chǎn)地種子進行了鑒別研究，為朱砂根的規(guī)范化栽培、種子質(zhì)量標準的制訂提供了很好的依據(jù)。此外，本實驗方法簡單易掌握，適用于較多物種及其混偽品的鑒定。它從分子角度入手，植物的遺傳物質(zhì)相對穩(wěn)定，較少甚至不受到材料部位、外界環(huán)境的影響，逐漸擺脫了對于專業(yè)鑒定人員的依賴，使物種鑒定標準化、簡單化。此外，本研究轉(zhuǎn)成的二維DNA條形碼圖片，讀者可以通過多種二維碼掃描軟件(如微信“掃一掃”功能、“快拍二維碼”等)識讀到對應物種的拉丁名和ITS2序列。本研究利用DNA條形碼對朱砂根及其混偽品進行鑒定，對于物種鑒定有重要的啟示與指導意義，對于其在臨床準確安全用藥和規(guī)范藥材市場流通等方面提供了重要依據(jù)。

致謝：感謝中國中醫(yī)科學院中藥研究所對部分樣品進行復核，感謝國家藥用植物種質(zhì)資源庫提供種子樣本。

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MolecularIdentificationofArdisiaeCrenataeRadixandItsAdulterantsBasedonITS2Sequence

CHEN Xinlian，ZHOUJianguo，MAShuangjiao，YAOHui，LINYulin，WANGYu*

(TheKeyLaboratoryofBioactiveSubstancesandResourcesUtilizationofChineseHerbalMedicine，MinistryofEducation，InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China)

Objective：This research aims to identify Ardisiae Crenatae Radix and its adulterants accurately using the ITS2 sequence.It will provide the foundation for its clinical medication and accurate market standardized management.Methods：Ardisia Crenatae Radix and its adulterants were identified and distinguished by ITS2 barcode，one marker of DNA barcoding.Genomic DNA ofArdisiacrenataand its adulterants were extracted and then the ITS2 regions were obtained by PCR amplification and sequenced bidirectionally.The ITS2 sequences were aligned and the genetic distances were computed using MEGA 6.0 in accordance with the Kimura 2-parameter (K2P) model.Results：The length ofA.crenatasequence is 217 bp and the average G+C content was 59.1%.There were ten variable sites of the ITS2 regions ofA.crenataand 48 ITS2 sequences ofA.crenataincluded nine haplotypes.Except forA.crenatavar.bicolor，the maximum intra-specific K2P genetic distance of Ardisiae Crenatae Radix and its adulterants was less than the minimum inter-specific K2P genetic distance.Conclusion：The experimental results indicated that the ITS2 sequence could be a good marker to identify Ardisia Crenatae Radix and its adulterants.But the relationship ofA.crenataandA.crenatavar.bicolorneed to be further studied.

Ardisiae Crenatae Radix；identification；ITS2 sequence；DNA barcoding；adulterants

國家科技支撐計劃(2011BAI07B08)；中國醫(yī)學科學院醫(yī)學與健康科技創(chuàng)新工程(2016-I2M-3-016)

] 王瑀，副主任技師，研究方向：中藥資源；Tel：(010)57833199，E-mail：ywang@implad.ac.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.7.008

2017-03-23)

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