基于“形態(tài)+分子”方法對疑似靈芝屬樣品的基原探究△

董曉曼，王亞君，查良平，蔣超，金艷，趙玉洋，袁媛*

(1.安徽中醫(yī)藥大學 藥學院，安徽 合肥 230012；2.道地藥材國家重點實驗室培育基地 中國中醫(yī)科學院 中藥資源中心，北京 100700；3.國家納米科學中心，北京 100190)

·基礎研究·

基于“形態(tài)+分子”方法對疑似靈芝屬樣品的基原探究△

董曉曼1，2，王亞君3，查良平1，蔣超2，金艷2，趙玉洋2，袁媛2*

(1.安徽中醫(yī)藥大學 藥學院，安徽 合肥 230012；2.道地藥材國家重點實驗室培育基地 中國中醫(yī)科學院 中藥資源中心，北京 100700；3.國家納米科學中心，北京 100190)

目的：為疑似“靈芝”屬樣品基原探究提供性狀和分子鑒定證據(jù)。方法：在基于傳統(tǒng)形態(tài)特征初步鑒定基礎上，對疑似靈芝屬兩樣品ZZ和SS的rDNA-ITS區(qū)序列進行PCR擴增，經(jīng)克隆測序后，與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進行BlastN比對，樣品及最相似物種ITS序列對齊后使用MEGA 6.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果：測序得到樣品ZZ和SS的rDNA-ITS區(qū)序列分別為752、753個堿基，與已發(fā)表極硬紅皮孔菌(Pyrrhodermaadamantinum) rDNA-ITS 區(qū)序列相似度達99.0%，并在系統(tǒng)發(fā)育樹中與極硬紅皮孔菌聚為一支，而與紫芝、樹舌靈芝遺傳距離較遠。結合樣品ZZ和SS的子實體形態(tài)和掃描電鏡觀察鑒定結果判斷其為極硬紅皮孔菌。結論：基于rDNA-ITS區(qū)序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構建藥用真菌分子鑒定方法，為疑似樣品基原鑒定提供理論依據(jù)和技術支持。

分子鑒定；極硬紅皮孔菌；ITS序列

藥用真菌含有多種有效成分，具有抗腫瘤[1]、免疫調(diào)節(jié)[2]、抗菌[3]、抗病毒[4]、解毒保肝[5]、抗氧化[6]等多種藥理活性。在市場上藥用真菌常存在“同名異物”或“以假亂真”現(xiàn)象，因此對其基原準確鑒定是保證中藥臨床用藥安全的重要基礎。目前藥用真菌主要依賴傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定，包括對子實體等宏觀形態(tài)特征及孢子、菌絲等微觀特征的觀察。由于真菌形態(tài)特征復雜且隨著分布地域變化較大，即同一物種的外部形態(tài)會隨分布區(qū)域的不同發(fā)生較大變異，如野生赤芝在中國的分布由北向南逐漸減少，且形態(tài)、顏色以及內(nèi)部結構均有所變化，海南的赤芝多不像北方那樣典型，通常菌蓋較小、菌柄細長[7]，這體現(xiàn)了赤芝種群間的變化；另一方面，部分真菌樣品采集后即不育且很難采集到孢子，因而喪失了部分鑒定特征。上述諸因素均限制了傳統(tǒng)形態(tài)學方法在藥用真菌鑒定中的應用。

由于DNA分子標記不受環(huán)境因素、生物體發(fā)育階段、器官組織差異的影響，且個體中的任一體細胞均含有相同的遺傳信息，因而具有微量、準確、特異性好的優(yōu)點，被廣泛用于真菌物種鑒定[8-10]。近年來，已有利用rDNA-ITS序列對大型真菌等進行分類鑒定、純培養(yǎng)菌種鑒定和分子系統(tǒng)發(fā)育研究的報道[11-16]。

本研究分別在湖南省采集了兩個樣品，在野外調(diào)查中根據(jù)子實體的形態(tài)特征，對這兩個樣品進行初步鑒定，其中湖南省株洲市淦田縣東沖村樣品可能為靈芝科靈芝屬紫芝Ganodermasinense，湘鄉(xiāng)市梅橋鎮(zhèn)井峰村采得樣品可能為靈芝科靈芝屬樹舌靈芝Ganodermaapplanatum。在前期野外鑒定的基礎上，進一步通過對子實體和孢子的微觀特征觀測，發(fā)現(xiàn)其與《中國真菌志》中記載的紫芝與樹舌靈芝特征不一致，并對樣品ITS序列進行擴增和分析，建立了“形態(tài)+分子”結合的鑒定方法判斷兩樣品基原，以期為藥用真菌疑似樣品鑒定提供技術支持。

1 材料

1.1 樣品

供試樣品采自湖南省，新鮮子實體采集后去除表面泥沙雜物，子實體的采集信息及編號見表1。

1.2 試劑

pEASYTM-T5 Zero Cloning vector和Trans1-T1感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司；瓊脂糖購自Promega公司；MightyAMP DNA Polymerase、2x MightyAMP Buffer、2000 bp DNA Marker購自TaKaRa公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。rDNA-ITS分析所用的引物ITS5 (5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3′)[15]由生工生物工程有限公司合成。

2 方法

2.1 子實體形態(tài)觀察

用Pentax K-7單反相機拍攝記錄供試標本的菌蓋表面、菌管表面及菌蓋剖面，并用直尺進行測量。

2.2 掃描電鏡觀察

采用Quanta 200 ESEM (FEI)掃描電子顯微鏡觀察供試標本的擔孢子顯微結構。

2.3 子實體基因組DNA的提取

所有供試材料均取子實體的菌蓋部分來提取基因組DNA?；蚪MDNA的提取采用CTAB法[16]。

2.4 PCR擴增

ITS5F-4R反應體系總體積為25 μL，包括MightyAmp DNA聚合酶 0.8 μL，2×MightyAmp Buffer 12.5 μL，ITS5F 0.5 μL，ITS4R 0.5 μL，滅菌蒸餾水9.7 μL，子實體DNA 1.0 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min，然后進入循環(huán)，95 ℃變性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃復性100 s，共40個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，終止溫度為4 ℃。兩樣品均平行實驗3次。

2.5 目的片段的克隆及測序

將ITS的PCR產(chǎn)物與pEASYTM-T5 Zero Cloning vector連接，轉化到Trans1-T1感受態(tài)細胞中，在含有氨芐青霉素的LB平板上進行培養(yǎng)，經(jīng)PCR鑒定后隨機選擇8個陽性克隆，送北京睿博興科生物技術有限公司進行測序。

2.6 ITS 序列分析

將測得的ITS序列去掉5′和3′端的載體序列，轉換為FASTA格式。將去除載體后的序列使用BioEdit分析軟件進行分析和校對處理。在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLASTN分析，并用MEGA 6.06軟件包進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建。用Kimura2- parameter模式計算遺傳距離，所有對位排列結果中的空位或缺失數(shù)據(jù)做完全刪除處理，進化距離分析采用鄰位相連法(NJ，neighbor-joining)。系統(tǒng)樹的每個分支的統(tǒng)計學顯著性分析以自展法進行檢驗，bootstrap重復次數(shù)為1000次。

3 結果與分析

3.1 樣品子實體形態(tài)觀察

3.1.1 供試樣品ZZ 擔子果硬骨質(zhì)，柄狀基部。菌蓋單生，近圓形，7.5 cm×8.1 cm，厚約1.0 cm，剖面近三角形。菌蓋表面淺灰褐色，有明顯黑色皮殼，具同心環(huán)紋及不明顯的溝紋，光滑，邊緣圓鈍、完整。菌肉淺黃褐色，硬木栓質(zhì)，菌管淺灰褐色，較菌肉色淡，呈纖維質(zhì)。見圖1。

3.1.2 供試樣品SS 擔子果硬骨質(zhì)，無菌柄。菌蓋單生，菌蓋近扇形，4.5 cm×4.8 cm，厚約1.2 cm，剖面近三角形。菌蓋表面灰褐色，有明顯黑色皮殼，具同心環(huán)紋及不明顯的溝紋，光滑，邊緣圓鈍、完整。菌肉黃褐色，菌管表面淺灰色，纖維質(zhì)。見圖1。

注：A1、A2為ZZ和SS的菌蓋表面；B1、B2為ZZ和SS的菌管表面；C1、C2為ZZ和SS的菌蓋剖面。圖1 供試標本子實體形態(tài)特征

3.2 掃描電鏡觀察

采用掃描電鏡觀察兩供試樣品的擔孢子的形態(tài)特征，掃描電鏡觀察結果表明兩供試樣品擔孢子顯微特征基本一致，擔孢子近球形，表面平滑，薄壁。供試樣品ZZ的擔孢子大小為5.1 μm×4.9 μm(見圖2A)；供試樣品SS的擔孢子大小為5.0 μm×4.8 μm(見圖2B)。

注：A.供試樣品ZZ；B.供試樣品SS。圖2 供試樣品擔孢子掃描電鏡圖

3.3 供試樣品的PCR擴增、測序及分析

從2個樣品子實體的基因組DNA中，引物ITS5F/4R對均成功地擴增出單條帶，即位于樣品rDNA ITS區(qū)(ITS1-5.8S-ITS2)的一段ITS序列，序列長度約為750 bp(見圖3)。

圖3 ZZ與SS標本子實體的PCR擴增結果

將PCR產(chǎn)物連接到pEASYTM-T5 Zero克隆載體上，隨機挑選8個陽性克隆進行測序，并對序列信息進行分析。各樣品8個陽性克隆的序列均一致。樣品ZZ序列長度為752 bp，GC質(zhì)量分數(shù)為38.70%；樣品SS序列長度為753 bp，GC質(zhì)量分數(shù)為38.50%；兩樣品ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中發(fā)表的極硬紅皮孔菌Pyrrhodermaadamantinum(登錄號：FJ481040.1)序列相似度均達到99.0%。

3.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得權威機構提交的靈芝、紫芝、樹舌靈芝及極硬紅皮孔菌的ITS序列，與測序獲得的2條序列，用Bioedit軟件多重對位排列后，利用對位序列中共包括空位在內(nèi)的649個堿基用于系統(tǒng)發(fā)育樹構建。基于Mega 6.0構建的系統(tǒng)樹如圖4所示。從進化樹中，SS和ZZ兩供試樣品ITS序列首先聚為一分支，然后與極硬紅皮孔菌P.adamantinum聚為一個大的分支，而靈芝G.lucidum、紫芝G.sinense和樹舌靈芝G.applanatumd單獨聚為一分支。以上結果說明，SS和ZZ兩供試樣品與極硬紅皮孔菌親緣關系最近，而與紫芝和樹舌靈芝親緣關系較遠，結合前期的序列相似度分析結果，提示這兩個供試標本最相似物種為極硬紅皮孔菌。

圖4 基于供試樣品rDNA-ITS區(qū)堿基序列構建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

4 討論

4.1 疑似靈芝屬樣品的鑒定結果

本研究利用掃描電鏡對供試樣品ZZ和SS進行了擔孢子形態(tài)的觀察，結果發(fā)現(xiàn)兩樣品外觀形態(tài)和擔孢子顯微特征基本一致：菌蓋單生，近圓形，菌蓋表面淺灰褐色，有明顯黑色皮殼，具同心環(huán)紋及不明顯的溝紋，光滑，邊緣圓鈍、完整。菌肉淺黃褐色，硬木栓質(zhì)，菌管淺灰褐色，較菌肉色淡，呈纖維質(zhì)；擔孢子近球形，表面平滑，薄壁。前期野外鑒定結果認為樣品ZZ可能為紫芝，而SS可能為樹舌靈芝，對照外觀形態(tài)和擔孢子的觀察結果，發(fā)現(xiàn)樣品ZZ表面無漆樣光澤且無明顯柄，只有柄狀基部，而樣品擔孢子和文獻中記載的紫芝“擔孢子卵圓形，雙層壁，具明顯小刺”等特征差異較大；供試樣品SS形態(tài)特征與文獻記載樹舌靈芝也有差異[7]，樣品具黑色皮殼，基部具放射狀菌絲束，而樣品擔孢子亦不具備樹舌靈芝“擔孢子卵圓形雙層壁，外壁無色、平滑，內(nèi)壁有小刺”等特點。這表明兩個樣品實際上可能來源于同一種真菌，而前期野外鑒定結果有誤。

為進一步確定兩個樣品的來源，本研究對樣品進行了rDNA-ITS序列的擴增和比對。Renske Landeweert等[17]在對土層中外生菌根菌絲進行分子鑒定時，提出將供試品rDNA-ITS序列在GenBank上進行BlastN分析，如相似度≥99%，可以鑒別為相同種；序列相似性為 95%～99%，可以鑒別為相同屬；序列相似性≤95%，可以鑒別為相同科。兩樣品rDNA-ITS序列BlastN結果均為最相似物種是極硬紅皮孔菌，且相似度達到99%，結合系統(tǒng)發(fā)育樹結果，判斷兩樣品均為極硬紅皮孔菌，且兩樣品的子實體、擔孢子顯微結構與極硬紅皮孔菌的特征也均一致[18]。

4.2 分子鑒定是藥用真菌疑似樣品性狀鑒定的重要補充

目前，對藥用真菌的鑒定主要依賴傳統(tǒng)形態(tài)鑒定，而分子鑒定是藥用真菌傳統(tǒng)性狀鑒定的重要補充。在藥用真菌的分子鑒定中，主要以基因組DNA序列片段作為分子標記，其中ITS1和ITS2[19-20]在保守性上表現(xiàn)為種內(nèi)相對一致、種間差異明顯，故rDNA-ITS序列適合并已成功運用于真菌種及種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育分析以及物種的分子鑒定[21-22]。然而基于rDNA-ITS序列分析并不能對所有真菌都精準地鑒定到屬或種水平，原因主要包括：1)ITS區(qū)序列雖然可變，但不同物種其變異程度不同，有些可能不足以用于進行屬、種和居群的鑒定；2)ITS序列分析結果受BlastN比對分析時所使用參考核酸數(shù)據(jù)影響，故真菌核酸數(shù)據(jù)庫的不完善也可能影響鑒定的結果。因此，需要同時采用性狀和分子鑒定兩種手段，互相驗證以保證鑒定結果的準確性。

致謝：中國科學院微生物研究所張小青研究員對本實驗中形態(tài)和顯微結構鑒定提供指導，特此致謝！

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APrimaryStudyonClassificationandIdentificationofTwoSamplesBasedonMorphologicalCharacteristicsandMolecularAnalyses

DONG Xiaoman1，2，WANGYajun3，ZHALiangping1，JIANGChao2，JINYan2，ZHAOYuyang2，YUANYuan2*

(1.SchoolofPharmacy，AnhuiUniversityofChineseMedicine，Hefei230012，China；2.StateKeyLaboratoryofDao-diHerbsBreedingBase，NationalResourceCenterforChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China；3.NationalCenterforNanoscienceandTechnology，Beijing100190，China)

Objective：In order to identify and classify two samples which were suspected asGanoderma，the morphological characteristics and molecular analyses were performed.Methods：Basing on primary identification of them，the rDNA-ITS region were amplified thereby，the rDNA-ITS amplicon was characterized by cloning，sequencing，blasting in GenBank and phylogenetic analyses using MEGA.Results：The rDNA-ITS entire sequences of the two species was 752 bp and 753 bp，respectively.The sequences both related to thePyrrhodermaadamantinumwere available in GenBank，and the similarity reached 99.0%.The cluster analysis suggested that the relationship between the two samples andP.adamantinumwas closer，however，the relationship between the two samples and theGanodermawere relatively farther.The morphological and microscopic characteristics combined with the sequence analysis demonstrated that the two samples areP.adamantinum.Conclusion：The molecular biology methods of rDNA-ITS region analysis provides a technical support and theoretical reference for accurate identification on suspected fungi samples.

Molecular identification；Pyrrhodermaadamantinum；ITS

中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(201407003)

] 袁媛，博士，研究員，研究方向：分子生藥學；Tel：(010)84044340，E-mail：y_yuan0732@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.7.007

2016-11-16)

*[