HPLC測定蒙藥尼安嘎日那格-10中梔子苷的含量

韓志廣，雷露靜，李旻輝，3,4,5*

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市藥品檢驗(yàn)所，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)藥研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；3.包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014060;4.內(nèi)蒙古自治區(qū)特色藥用植物培育與保護(hù)工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 包頭 014060；5.內(nèi)蒙古自治區(qū)特色道地藥材資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 包頭 014060)

HPLC測定蒙藥尼安嘎日那格-10中梔子苷的含量

韓志廣1，雷露靜2，李旻輝2，3,4,5*

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市藥品檢驗(yàn)所，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)藥研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；3.包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014060;4.內(nèi)蒙古自治區(qū)特色藥用植物培育與保護(hù)工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 包頭 014060；5.內(nèi)蒙古自治區(qū)特色道地藥材資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 包頭 014060)

目的：建立蒙藥尼安嘎日那格-10中梔子苷的含量測定方法。方法：采用高效液相色譜法(HPLC)，色譜柱為Dikma Technologies C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相為乙腈-水(11∶89)；流速1.0 mL·min-1；檢測波長為238 nm。結(jié)果：梔子苷在6.00～60.00 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，r=0.999 9，平均加樣回收率97.85%，RSD為1.26%。結(jié)論：本方法簡便準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于測定蒙藥尼安嘎日那格-10中梔子苷的含量測定。

尼安嘎日那格-10；梔子；梔子苷；HPLC

近年來，隨著民族醫(yī)藥的快速崛起，蒙醫(yī)藥現(xiàn)代化步伐也隨之加快。蒙醫(yī)藥是蒙古族人民在與自然和疾病長期的斗爭實(shí)踐中創(chuàng)造、積累、精選出的具有獨(dú)特風(fēng)格的經(jīng)驗(yàn)結(jié)晶，是蒙古族文化的重要組成部分，在長期的臨床實(shí)踐中，蒙醫(yī)藥積累了豐富的理論經(jīng)驗(yàn)[1]。蒙藥屬于天然藥物，在治療一些疾病方面，療效確切，毒副作用低，得到全國市場的廣泛認(rèn)可[2]，但由于其質(zhì)量控制一直處于低水平狀態(tài)，導(dǎo)致蒙藥產(chǎn)業(yè)與苗藥、藏藥等民族醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)相比處于低水平發(fā)展?fàn)顟B(tài)，因此應(yīng)該大力開展蒙藥的標(biāo)準(zhǔn)化完善工作，不斷推動(dòng)蒙藥產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)代化發(fā)展。

蒙藥尼安嘎日那格-10來源于《蒙醫(yī)傳統(tǒng)驗(yàn)方》，由梔子、木香、黑冰片、白硵砂、蔓荊子、可瓜子、蓽茇、川烏(制)、訶子等10味藥組成，具有止吐，解痙等作用，用于嘔吐，胃痙攣等癥的治療。梔子為方中君藥，具有瀉火除煩，清熱利尿，涼血解毒的功效；梔子是我國常用中藥材，在蒙醫(yī)藥里使用也十分普遍，近些年國內(nèi)外研究證明梔子中的有效成分環(huán)烯醚萜類物質(zhì)具有解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、鎮(zhèn)靜催眠、保肝利膽、防止動(dòng)脈粥樣硬化等藥理活性。因此以梔子苷作為尼安嘎日那格-10的質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)具有很好的代表性。本文為了更好地控制藥品質(zhì)量，采用高效液相色譜法測定尼安嘎日那格-10中梔子苷的含量，為進(jìn)一步完善尼安嘎日那格-10質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津高效液相色譜儀(LC10-ATVP型泵、SCL-10AVP型控制器、SPD-10AVP型檢測器、SLASS-VP色譜工作站)；HR-200型萬分之一天平、Presia型十萬分之一天平、MAS3.6P-OCE-DM百萬分之一電子天平(德國賽多利斯)。

1.2 試劑與試藥

梔子苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110749-200714)；尼安嘎日那格-10對照品(內(nèi)蒙古巴林右旗蒙醫(yī)院，批號：070416、080614、090325)；陰性樣品及模擬樣品由赤峰市藥品檢驗(yàn)所制備。乙腈為色譜純，水為超純水，其它試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Dikma TechnologiesC18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(11∶89)；柱溫25 ℃；流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量20 μL；檢測波長238 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取梔子苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含30 μg梔子苷的溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品細(xì)粉約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率50 Hz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按處方配制不含梔子藥材的樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

在2.1項(xiàng)色譜條件下，分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各20 μL，注入液相色譜儀，理論板數(shù)按梔子苷峰計(jì)應(yīng)大于2000；陰性對照色譜圖中，在與梔子苷對照品以及供試品色譜相應(yīng)的保留時(shí)間處無色譜峰出現(xiàn)，表明該方法專屬性好，成方制劑中其它組分對梔子苷的測定無干擾，見圖1。

注：A.梔子苷對照品；B.供試品；C.陰性對照品圖1 梔子苷HPLC圖

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取梔子苷對照品15.0 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取上述對照品溶液1.0、3.0、5.0、7.0、10.0 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，按2.1項(xiàng)下色譜條件測定，以濃度對峰面積進(jìn)行回歸分析，結(jié)果梔子苷在6.00～60.00 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系?；貧w方程為Y=179 027.6X-34 141，r=0.999 9。

2.5 精密度試驗(yàn)

取批號為070416的樣品制成的供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄梔子苷峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示梔子苷峰面積的RSD為1.23%，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取批號為070416的樣品制成的供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)行測定，記錄梔子苷峰面積，RSD為1.43%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取批號為070416的樣品5份，約1 g，精密稱定，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定供試品中梔子苷含量，測得梔子苷含量分別為3.539 5、3.516 5、3.490 1、3.501 4、3.542 2 mg·g-1，RSD為0.65%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

取已知梔子苷含量的樣品(批號：070416，梔子苷含量3.528 0 mg·g-1)9份，各約0.5 g，精密稱定，置9個(gè)錐形瓶中，分別按已知梔子苷含量的80%、100%、120% 3個(gè)水平精密加入梔子苷對照品1.44 mg、1.80 mg、2.32 mg，按2.2.2項(xiàng)下方法制備，測定每份樣品中梔子苷的含量，計(jì)算回收率和RSD，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.9 樣品的含量測定

取三個(gè)批次的尼安嘎日那格-10樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法處理并進(jìn)樣，記錄梔子苷峰面積，按外標(biāo)法測定并計(jì)算樣品中梔子苷含量；為了驗(yàn)證生產(chǎn)工藝對梔子苷含量有無影響，按處方制備模擬樣品，同法計(jì)算梔子苷含量。測定結(jié)果見表2。

表2 樣品、模擬樣中梔子苷量測定結(jié)果(樣品n=2，模擬樣品n=3)

從表中三批樣品測定的數(shù)據(jù)可見，模擬樣中梔子苷的含量為3.476 mg·g-1，實(shí)驗(yàn)中用相同的方法對上述模擬樣生產(chǎn)用梔子藥材進(jìn)行了含量測定，測得梔子苷含量為35.665 mg·g-1，測定結(jié)果見表3。

表3 梔子藥材中梔子苷含量測定結(jié)果(n=3)

3 結(jié)果與討論

3.1 質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)的選擇

參照文獻(xiàn)，對尼安嘎日那格-10方劑中各單味藥進(jìn)行對比分析，以確定最佳質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)。方中木香的藥用部位為其干燥根，主要含萜內(nèi)酯類揮發(fā)油成分，其中含量最高的萜內(nèi)酯為木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯等[3]，文獻(xiàn)[4-6]多以上述兩種成分為指標(biāo)物對木香進(jìn)行質(zhì)量控制，但揮發(fā)油類成分在生產(chǎn)過程中易損失，影響測量結(jié)果的準(zhǔn)確性，故此類成分并非本方質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)的最佳選擇。方中其他單味藥如黑冰片主要成分為Fe、Ca、Zn、Cu、Mg等、白硇砂化學(xué)成分為NH4Cl，可瓜子主要成分為內(nèi)酯類及脂肪酸類化合物，上述成分均不具有代表性，不宜作為質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)。除此之外，方中訶子含有大量的水溶性鞣酸，而川烏(制)、蓽茇主要成分為生物堿類，兩者易發(fā)生沉淀反應(yīng)，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；另外蓽茇的主要成分胡椒堿見光可分解，也不宜作為指標(biāo)物進(jìn)行定量分析。梔子是我國常用中藥材，在蒙醫(yī)藥里使用也十分普遍，具有解痙等作用，用于嘔吐，胃痙攣等癥的治療，其主要成分梔子苷具有降血糖、降血脂、保肝利膽、鎮(zhèn)靜催眠、抗腫瘤、抗氧化等作用。梔子在方中為君藥，且梔子苷化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，以梔子苷作為尼安嘎日那格-10的質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)具有很好的代表性。

3.2 供試品提取條件考察

梔子苷為環(huán)烯醚萜苷類化合物，易溶于甲醇等有機(jī)溶劑，《中華人民共和國藥典》[7]多以甲醇、70%甲醇、50%甲醇為溶劑提取供試品中的梔子苷，提取方式多為超聲提取。本文在提取過程中，考察以了甲醇、70%甲醇、50%甲醇為提取溶劑，并考察了超聲(功率300 W，頻率50 Hz)提取時(shí)間(10 min、20 min、30 min、40 min)對提取效率的影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：以甲醇為溶劑對梔子苷進(jìn)行提取，效果最佳；對超聲時(shí)間的考察表明超聲提取30 min，梔子苷的提取效率較高，且和超聲提取40 min相比梔子苷含量基本一致，為提高效率，將超聲提取時(shí)間定為30 min。

3.3 色譜條件的選擇

采用高效液相色譜法測定蒙藥尼安嘎日那格-10中梔子苷的含量，文獻(xiàn)報(bào)道[8-11]梔子苷含量測定流動(dòng)相體系為甲醇-水或乙腈-水，參照文獻(xiàn)，經(jīng)反復(fù)嘗試，最終選用乙腈-水(11∶89) 為流動(dòng)相，分離效果好；在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果梔子苷在238 nm處有最大吸收，故選擇檢測波長為238 nm；實(shí)驗(yàn)柱溫采用25 ℃，在此色譜條件下，梔子苷與其他成分達(dá)到較好的分離度，并具有較好的保留時(shí)間。

3.4 測定結(jié)果分析

目前有關(guān)中成藥中梔子苷的含量測定方法已有較多報(bào)道，但關(guān)于蒙藥方劑中梔子苷含量測定的報(bào)道還很少，且尼安嘎日那格-10中梔子苷含量測定未見文獻(xiàn)報(bào)道，因此本文采用高效液相色譜法測定蒙藥尼安嘎日那格-10中梔子苷含量。在供試品提取條件考察等方面，文獻(xiàn)報(bào)道[12-14]中成藥中梔子苷含量測定多用70%甲醇或50%甲醇為提取溶劑，但鑒于本方中各成分的特殊性，含水甲醇容易將方中黑冰片、白硵砂中的無機(jī)鹽以及訶子中大量的水溶性鞣酸提取出來，導(dǎo)致雜質(zhì)峰較多，干擾測量結(jié)果，且鹽類對色譜柱和高效液相系統(tǒng)均有不同程度損壞，影響色譜柱及儀器壽命，而選用純甲醇做提取溶劑，雜質(zhì)峰較少，對測定結(jié)果無干擾，且方法更簡便、快捷，實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和穩(wěn)定性更好。另外，相比文獻(xiàn)報(bào)道中成藥的質(zhì)量控制方法，本文新增了對模擬樣品、供試樣品、梔子藥材中梔子苷含量的對比研究，考察了制劑的均一性及工藝的穩(wěn)定性。試驗(yàn)結(jié)果表明，模擬樣品和樣品中梔子苷含量相差不大，說明生產(chǎn)工藝對尼安嘎日那格-10中梔子苷含量無影響；對梔子單味藥材中梔子苷的含量進(jìn)行測定，結(jié)果與模擬樣品及樣品中梔子苷含量相差不大，表明樣品均一性良好，制劑工藝穩(wěn)定。

蒙醫(yī)藥是經(jīng)實(shí)踐考驗(yàn)的具有民族特色的醫(yī)藥體系，有著很高的醫(yī)療價(jià)值，蒙醫(yī)藥和傳統(tǒng)中醫(yī)藥相比，其用藥特點(diǎn)與地理環(huán)境及蒙古族特有的生活方式有著密切聯(lián)系，用藥方法、用藥時(shí)間與傳統(tǒng)中醫(yī)藥不同，并且有特殊的炮制方法[15]，蒙藥在質(zhì)量控制方面與中藥相比還處于低水平階段，有待進(jìn)一步提高。本文建立的方法在進(jìn)一步完善尼安嘎日那格-10質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的同時(shí)，對建立民族特色蒙藥的質(zhì)量控制方法提出了新的探索，具有一定的示范作用，并將傳統(tǒng)蒙醫(yī)藥理論與現(xiàn)代藥學(xué)新理論、新技術(shù)有機(jī)的結(jié)合起來，加強(qiáng)傳統(tǒng)蒙藥的現(xiàn)代化研究，建立了科學(xué)的質(zhì)量控制方法，為更好地開發(fā)利用蒙藥資源奠定了基礎(chǔ)，對促進(jìn)蒙醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化、可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

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DeterminationofGeniposideinMongolianMedicineNi-Angarinage-10byHPLC

HAN Zhiguang1，LEILujing2，LIMinhui2，3,4,5*

(1.ChifengInstituteofDrugInspection，Chifeng024000，China；2.InnerMongoliaAutonomousRegionAcademyofChineseMedicine，Hohhot010110，China；3.BaotouMedicalCollege，Baotou014060，China;4.InnerMongoliaResearchCenterofCharacteristicMedicinalPlantsCultivationandProtectionEngineeringTechnology，Baotou014060，China；5.InnerMongoliaKeyLaboratoryofCharacteristicTraditionalChineseMedicinalResourcesProtectionandutilize，Baotou014060，China)

Objective：To establish an HPLC method for the determination of geniposide in Mongolian medicine Ni-Angarinage-10.Methods：The stationary phase was Diamonsil C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm) and the mobile phase was Acetonitrile-Water (11∶89)，the flow rate was 1.0 mL·min-1and the detection wave length was 238 nm.Results：The linear range of geniposide was 6.00～60.00 μg·mL-1，r=0.999 9.The average recovery was 97.85% RSD=1.26%.Conclusion：The HPLC method for the determination of geniposide is a simple，fast，accurate and good reproducible.

Ni-Angarinage-10；Fructus Gardeniae；geniposide；HPLC

] 李旻輝，教授，研究方向：中蒙藥資源保護(hù)與開發(fā)利用、分子生藥學(xué)；Tel：(0471)6262232，E-mail：li_minhui@aliyun.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.7.006

2017-01-08)

*[