超高效液相色譜法檢測6種人參皂苷含量

孫磊

哈藥集團世一堂飲片有限責(zé)任公司 150000

超高效液相色譜法檢測6種人參皂苷含量

孫磊

哈藥集團世一堂飲片有限責(zé)任公司 150000

目的：通過超聲提取的方式，對藥食同源植物中6種人參皂苷的含量進(jìn)行檢測。方法：提取劑為50%濃度的甲醇溶液，料液配比為1:80（g:ml）,設(shè)置超聲時間為30分鐘，本次實驗的流動相為0.05%的磷酸水以及乙腈，通過梯度洗脫的方式實現(xiàn)實驗操作，檢測的波長為203nm。結(jié)果：通過檢測實驗可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)質(zhì)量濃度保持在5～1000μg/mL的范圍之中時，其線性較好，在對6種不同的人參皂苷含量進(jìn)行檢測時，發(fā)現(xiàn)最低檢出限一般在22.5到51.0mg范圍中，平均回收率最低為98.1%到105.5%，本實驗中的三種樣品的三醇類皂苷含量低于二醇類皂苷含量，三七中的Rgl含量最高，西洋參的Re含量最高。結(jié)論：實驗結(jié)果表明，這種超高效液的相色譜法檢測結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度較好，適用于數(shù)量較多的產(chǎn)品檢測。

超高效液相色譜；超聲提??；皂苷含量

三七、西洋參以及人參都屬于“藥食同源”的人參屬植物，這類植物中的功能成分一般是人參皂苷，屬于一種特殊的化合物，主要是糖與苷元相連制成的化合物提取人參皂苷的方法有很多種，檢測的方法也有很多種，為了提升人參皂苷的分離性能，本文對超高效液相色譜的檢測方法進(jìn)行研究，不僅檢測結(jié)果比其他的檢測方法更準(zhǔn)確，檢測速度也相對比較快，現(xiàn)有檢測過程如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗材料：無水甲醇、無水乙醇和磷酸、乙腈、Milli Q超純水、人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rd、人參、西洋參及三七。

儀器：Aglient1290超高效液相色譜儀、Aglient 1100高效液相色譜儀、Agilent Eclipse Plus-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μ m）、C18 色譜柱 （Phenomenex 4.6 mm×250 mm，5 μm）、BSA2245-CW 電子天平、KQ-600DA 型超聲波清洗器

1.2 方法

樣品粉碎，過 80 目篩。 準(zhǔn)確稱?。?.50±0.01）g樣品，加入適量提取液，在一定條件下超聲提取。將提取液定容，過 0.22 μm 有機濾膜，待液譜分析。UPLC 色譜條件：流動相為乙腈 （A）和 0.05%磷酸水（B），梯度洗脫程序：0～5 min，18%A；5～6min，18%～20%A；6～7 min，20%A；7～11 min，20%～30%A；11～15 min，30%A；15～18 min，30%～35%A。柱溫 30 ℃，流速 0.35 m L/min，檢測波長 203 nm，進(jìn)樣量 2 μL。HPLC 色譜條件 ：流動相為乙腈 （A）和 0.05%磷酸水（B），梯度洗脫程序：0～5 min，20%A；5～25min，20% ～22% A；25 ～30 min，22% ～25% A；30 ～55min，25% ～50% A；55 ～57 min，50% A；57 ～60 min，50%～80%A。 柱溫 30 ℃，流速 1.0 m L/min，檢測波長 203 nm，進(jìn)樣體積20μL。采用 SPSS17.0 One-way（ANOWA）進(jìn)行單因素方差分析（P＜0.05），比較不同提取條件對人參皂苷含量的影響。

2 結(jié)果

2.1 超聲提取單因素試驗

研究提取溶劑、料液比、超聲時間對提取物皂苷含量的影響，確定相關(guān)因素及其范圍。

2.1.1 提取溶

利用甲醇、水、乙醇、50%甲醇 、60%甲醇、70%甲醇提取樣品中人參皂苷， 種純?nèi)軇υ碥仗崛⌒Ч幸欢ǖ牟町悺?用水提取到的總皂苷含量高于甲醇、乙醇，且水溶劑和甲醇溶劑差異不顯著。 以純水溶劑提取到的原人參三醇類皂苷含量高于二醇類，用甲醇溶劑相反。 由于三醇類皂苷在結(jié)構(gòu)上較二醇類皂苷多1 個羥基， 極性略強與二醇類皂苷， 因此用純水溶劑提取到的三醇類皂苷含量略高。 最終采用甲醇水溶液提取樣品中的皂苷。用甲醇水溶液提取到的總皂苷含量基本相近，均顯著優(yōu)于純?nèi)軇┨崛〉男Ч?種比例的甲醇水溶液對原人參三醇皂苷的提取效果均優(yōu)于純水溶液， 對原人參二醇類皂苷的提取效果與純甲醇溶劑基本相當(dāng)。

2.1.2 超聲時間

固定超聲波清洗儀 功率 600W，頻率 40k Hz 條件，比較不同超聲時間對人參皂苷的提取效果。超聲時間對原人參二醇類皂苷影響不大，對原人參三醇類有影響。從總皂苷含量看，超聲10min 和 20 min 的提取率偏低，超聲提取 30，40，50，60 min 的提取效果較好。最終選擇提取時間30 min。

2.2 流動相對分離效果的影響

人參皂苷的檢測波長為 203 nm。 選擇乙腈為有機相，扣除溶劑的背景值。 水相中磷酸的含量對 6 種人參皂苷的分離影響較大 ， 尤其是對 Rg1 和Re 分離度的影響。 純水相中不能很好地將 Rg1 和Re 分離。 隨著磷酸含量的增加 ，這兩組分分離度增大，然而分析時間延長，組分的響應(yīng)值降低。最終選擇含磷酸 0.05%的水溶液為 A 相。

2.3 UPLC 與 HPLC 分離效果比較

采用 UPLC，18min 即 可分 離 6 種 皂苷 ， 而 采用HPLC 需 要 50min 才能進(jìn)行基線分離，節(jié)約近 2 倍的時間。UPLC的流速約為 HPLC 的 1/3，大大減少了流動相的使用。在分析人參皂苷時，使用 UPLC，其分離度與使用 HPLC 的相似，但進(jìn)樣量少，分析速度快，節(jié)省溶劑。

2.4 線性范圍、準(zhǔn)確度和精密度

將6種人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品配成質(zhì)量濃度為 5，10，20，50，100，200，500，1 000 μg/m L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以濃度（x）為橫坐標(biāo)、色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸分析。 以3倍信噪比計算方法的最低檢出限。6種人參皂苷在質(zhì)量濃 度5～1 000 μg/m L 范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，最低檢出限在 22.5～51.0 mg/kg 之間。

2.5 加標(biāo)回收率試驗

選取有代表性的人參樣品向其中加入 500，1 000，2 000 mg/kg 3 個水平的混標(biāo)，做加標(biāo)回收試驗。平均回收率為 98.1%～105.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～3.3%。該方法準(zhǔn)確，靈敏度高，重現(xiàn)性好，省時快捷，適合日常大批量樣品的檢測。

2.6 樣品測定

對市售人參、西洋參、三七樣品中 6 種人參皂苷含量進(jìn)行測定人參中 6 種皂苷總含量比西洋參和三七低。 人參、西洋參和三七中人參皂苷含量差異很大。 對于原人參三醇類皂苷（Rg1、Re和 Rf），三七樣品高于西洋參、人參，平均含量依次為 19 124.0，10 392.2，5 316.1 mg/kg， 并且西洋參和三七中不含 Rf。西洋參中 Re 含量最高，三七中Rg1 的含量最高。 對于原人參二醇類皂苷（Rb1、Rc和 Rd）， 西洋參樣品高于三七高于人參，平均含量依次為 28 368.1，24 785.3 和 9 760.1 mg/kg。 三類樣品中原人參二醇類皂苷均高于三醇類皂苷。

3 討論

苷元的種類不同，其合成的人參皂苷也存在差異，人參皂苷主要有三種不同的類型，分別是：齊墩果酸皂苷、二醇型皂苷以及三醇型皂苷。除了第一種人參皂苷之外的兩種人參皂苷都可以作為活性成分，能夠有效地調(diào)節(jié)人體的神經(jīng)中樞系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)以及造血系統(tǒng)，不僅能起到抗疲勞的作用，還能發(fā)揮抗癌的作用。UPLC是一種比較常見的檢測中藥材的方式，本文對 HPLC與UPLC進(jìn)行了比較，比較對象主要是分離性能，通過比較試驗發(fā)現(xiàn)，在同樣的實驗條件之下，UPLC方法的實用性更強，不僅能夠快速獲取檢測數(shù)據(jù)，其檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性也比較高，再進(jìn)行精密度實驗、回收實驗后，對人身、三七以及西洋參三種藥品進(jìn)行測定，確定在對數(shù)量比較多的批量藥品檢測時，可以使用這種方法，技術(shù)人員還要對這種方法進(jìn)行改進(jìn)，使其能夠更好地檢測人身皂苷。

[1] 許勇,諸艷蓉,王柯,季申. HPLC測定復(fù)方丹參膠囊中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志.2013(06)

[2] 吳和珍,李婷婷,李菁,朱艷平,楊艷芳. 高效液相色譜法測定益智寧顆粒中人參皂苷 Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1含量[J].湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報.2012(02)

[3] 王一博,肖丹,李曉宇,戴雨霖,越皓,劉淑瑩. 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)結(jié)合多探針底物法研究人參皂苷 Rb1的體外代謝[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報.2015(10)

[4] 陳洪巖,姚晨旭,張小龍. 高效液相色譜四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法測定啟脾丸中7種人參皂苷的含量[J].中國藥師.2017(03)

R473.5

A

1672-5018（2017）05-213-01