基于熒光顯微鏡的顯微視覺圖像增強處理

常 敏，劉天成

(上海理工大學(xué) 光電信息與計算機工程學(xué)院，上海 200093)

基于熒光顯微鏡的顯微視覺圖像增強處理

常 敏，劉天成

(上海理工大學(xué) 光電信息與計算機工程學(xué)院，上海 200093)

針對顯微視覺景深較小，經(jīng)常出現(xiàn)圖像模糊、不清晰等問題，文中提出采取一種圖像增強的處理方法。通過對顯微采集原始圖像進行灰度變換、直方圖均衡化等處理方法從而快速準(zhǔn)確地獲得目標(biāo)的圖像特征。基于圖像增強、目標(biāo)細(xì)胞定位處理對熒光圖像中信息進行分析，找尋目標(biāo)位置，提高細(xì)胞定位精確度。根據(jù)圖像清晰度評價函數(shù)顯示，經(jīng)由處理后的圖像邊界和細(xì)節(jié)部分清晰，有助于醫(yī)學(xué)應(yīng)用。

顯微視覺；圖像增強；細(xì)胞定位；圖像清晰度評價函數(shù)

生物醫(yī)學(xué)顯微圖像，具有數(shù)據(jù)量大、目標(biāo)復(fù)雜、干擾多等問題，相應(yīng)的特征提取[1-5]和目標(biāo)分割[6-10]較為困難。因此，將宏觀領(lǐng)域中圖像處理的成果[11-16]引入微觀領(lǐng)域的顯微視覺圖像處理中，提高圖像處理與目標(biāo)識別的實時性和魯棒性，是未來顯微視覺圖像處理的重要發(fā)展之一。

本文考慮到顯微圖像的特點，在借鑒宏觀圖像處理方法的基礎(chǔ)上，綜合考慮顯微視覺環(huán)境的不同，提出了一種基于熒光顯微鏡的圖像增強處理方法。

1 顯微圖像預(yù)處理

由于顯微視覺采集系統(tǒng)景深很小，造成的圖像模糊、圖像不清晰現(xiàn)象，就需要相應(yīng)的灰度變換算法來對采集圖像進行圖像增強。灰度變換[7]是針對圖像的灰度值進行的一類變換，可對圖像中的信息進行有選擇的加強或抑制，從而突出所需要的圖像細(xì)節(jié)或特征。

直方圖均衡化[5,10,14]是一種常用的灰度變換方法，是將每個灰度區(qū)域都具有相近的像素點數(shù)。該算法共包括兩個步驟，分別為歸一化均衡和范圍變換。直方圖均衡化的歸一化均衡變換函數(shù)fH應(yīng)滿足條件：(1)fH為單調(diào)函數(shù)；(2)fH≤1。

對于輸入顯微圖像的像素點(x,y)，其灰度值I1(x,y)經(jīng)過直方圖均衡化變換后形成的圖像灰度值為I2(x,y)，則I2(x,y)與I1(x,y)兩者之間關(guān)系可以表示為

I2(x,y)=fH(I1(x,y))(I2max-I2min)+I2min

(1)

式中，fH為歸一化均衡變換函數(shù)；I2min和I2max分別為變換后期望的最小和最大灰度值。假設(shè)輸入顯微圖像的像素點灰度值G∈{0,1,2,…,L-1}，以r表示圖像的像素點總數(shù)；以nG表示灰度值為G的像素數(shù)。于是，歸一化均衡變換函數(shù)fH可以表示為

(2)

經(jīng)過仿真可以發(fā)現(xiàn)，原始圖像的灰度值經(jīng)過直方圖均衡化后，圖像的細(xì)胞被明顯增強，使得在背景中更為突出。

2 圖像清晰度評價函數(shù)

在顯微操作系統(tǒng)中，自動對焦[2,14-15]對于后期的細(xì)胞識別以及操作精度，起著重要的作用，而如何選取準(zhǔn)確性較好的圖像清晰度評價函數(shù)是顯微視覺圖像處理的關(guān)鍵。

目前有一種在圖像獲取設(shè)備中基于數(shù)字圖像處理技術(shù)的自動對焦方法是通過計算機或微型處理器對圖像進行分析運算，進而完成對焦過程，這種方法更加智能，被廣泛應(yīng)用于各類視覺系統(tǒng)中。在這些數(shù)字圖像處理的方法中，主要方法有對焦深度法以及離焦深度法兩類。

圖1 自動對焦流程圖

要完成快速準(zhǔn)確的自動對焦，如流程圖所示就必須要有清晰度評價函數(shù)，對該函數(shù)的要求是：(1)評價函數(shù)評價特征明顯，可以迅速完成對焦，比手工花費時間更少；(2)評價函數(shù)應(yīng)具有性質(zhì)：在某一點上具有峰值且對應(yīng)于最佳對焦參數(shù)，并當(dāng)物體離開最佳點時單調(diào)遞減。(3)當(dāng)存在噪聲的時候，評價函數(shù)的適應(yīng)性要好。圖像清晰度是表征圖像銳化程度的參量。在空域上，圖像清晰度表現(xiàn)為圖像的邊界和細(xì)節(jié)部分是否清晰；在頻域上，則表現(xiàn)為圖像的高頻分量是否豐富；在統(tǒng)機特性上，表現(xiàn)為灰度分布是否均勻。因此，判別圖像清晰度的評價函數(shù)可分為空域方法、頻域方法和統(tǒng)計方法。

2.1 空域Brenner函數(shù)

Brenner[4]清晰度評價函數(shù)對于圖像的清晰度具有分辨能力，能夠判定是清晰圖像還是模糊圖像。其具有全局性好、運行效率高等特點，能夠?qū)ο胪▋?nèi)容的圖像區(qū)分清晰度。但對光照引起的灰度變化較為敏感，容易受到光照影響。評價函數(shù)為Jg3,有

(3)

2.2 清晰度評價函數(shù)

基于傅里葉變換的清晰度評價函數(shù)，根據(jù)圖像傅里葉變換后高頻分量含量的多少作為評價準(zhǔn)則[4]。圖像越清晰，高頻帶的能量越大；圖像越模糊，高頻帶的能量幅度越小，衰減越快。常用的頻譜分析方法有離散傅里葉變換(DFT)、快速傅里葉變換(FFT)、離散余弦變換(DCT)等。評價函數(shù)為Jf1，有

(4)

2.3 基于圖像信息熵的清晰度評價函數(shù)

圖像熵函數(shù)反映的是圖像的灰度分布離散程度大小[4]。圖像越模糊，熵函數(shù)越大，圖像越清晰，熵函數(shù)越小。因此，可以將圖像熵函數(shù)定義為

(5)

3 熒光圖像處理

在完整的熒光生物樣品成像過程中，重建出真實熒光圖像只是一個步驟，要得到最終熒光圖像還要通過必要的圖像處理。生物細(xì)胞的點樣有許多熒光目標(biāo)點，會與熒光標(biāo)記的測試樣品溶液發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果即為熒光圖像中對應(yīng)位置處的像素灰度值。

系統(tǒng)中熒光圖像處理主要分兩步驟：(1)圖像增強[15]，目的即濾除熒光圖像中的環(huán)境噪聲，消除脈沖噪聲以及椒鹽噪聲；(2)目標(biāo)細(xì)胞定位[9,13]，能夠識別定位到要捕獲的細(xì)胞位置，并將坐標(biāo)提供到機械執(zhí)行機構(gòu)。

3.1 噪聲的濾除

由于樣品培養(yǎng)皿或載玻片上自帶熒光以及載玻片或培養(yǎng)皿正面難免附著未與細(xì)胞樣品結(jié)合的熒光染料，反面有時會附有染料顆粒，不僅如此，培養(yǎng)皿或玻片表面的灰塵粒子、試液烘干時的顆粒狀殘留物等都會造成熒光圖像中的脈沖噪聲或其他噪聲。因此，得到的熒光圖像中包含有一定背景噪聲，必須通過圖像增強處理濾除所有這些噪聲，否則會影響后續(xù)的識別準(zhǔn)確性。

除了環(huán)境噪聲外，探測器的熒光成像中，入射到探測器的熒光光子數(shù)在統(tǒng)計上為泊松分布，因此散粒噪聲是不可避免的。另外灰塵、顆粒殘留物引起的脈沖噪聲可看作信號無關(guān)噪聲。綜合考慮這些噪聲，一個熒光目標(biāo)點的熒光亮度可以用如下正態(tài)分布表示

y～n(μ,σ2+μ2f2)

(6)

式中，y為熒光目標(biāo)點的像素值；μ為期望值；σ為信號無關(guān)噪聲引起的測量誤差；f為信號相關(guān)噪聲系數(shù)。

如果進行簡單的中值濾波，會對一些正確的信號產(chǎn)生誤濾除。為減少濾波算法對正確熒光信號的影響，反饋系統(tǒng)選用開關(guān)中值濾波算法來濾除圖像中存在的椒鹽噪聲、脈沖噪聲等背景噪聲，其在傳統(tǒng)的中值濾波基礎(chǔ)上增加了噪聲判斷功能，可以在濾除噪聲的同時很好地保護熒光目標(biāo)點邊緣的有效信息。

圖2 開關(guān)中值濾波

如圖2所示，開關(guān)中值濾波算法中有一個算法叫脈沖噪聲監(jiān)測算法，首先判斷一個像素是否為脈沖噪聲，若判斷結(jié)果為真，對該像素采用中值濾波算法再輸出；若結(jié)果不為真，則直接輸出。

在培養(yǎng)皿樣品中的熒光圖像中，熒光結(jié)合點以及背景的亮度分布都可以近似為高斯分布，因此可以根據(jù)濾波窗口內(nèi)像素的灰度統(tǒng)計特征來判斷當(dāng)前所判斷的像素是否為脈沖噪聲。若濾波窗口為W，它在圖像坐標(biāo)中可以描述為

W={(s,t)|-h≤s≤h,-h≤t≤h}

(7)

式中，h為窗口大小，當(dāng)前像素Xij通過濾波窗口為W的中值濾波后，輸出的信號為

Yij=median({Xi-s,j-t|(s,t)∈W})

(8)

輸出和輸入的差值為

dij=|Yij-Xij|

(9)

當(dāng)前像素Xij是否為脈沖噪聲是由脈沖監(jiān)測器來判斷，它由一個脈沖閾值Tij，在這個算法中，Tij可以表示為

(10)

對于當(dāng)前像素Xij，若dij≥Tij，則脈沖監(jiān)測器即認(rèn)定其為噪聲，要經(jīng)過中值濾波器進行濾波出來；否則，脈沖檢測器則認(rèn)為其是信號，不經(jīng)過中值濾波器處理。開關(guān)中值濾波的輸出如下

(11)

可以看出，濾波窗口的大小 和閾值調(diào)節(jié)參數(shù) 都會影響開關(guān)中值濾波器的性能。在本次實驗中，分別選取h=1,2,3,對應(yīng)的濾波窗口大小為3×3，5×5，7×7，并選取k=0.5,1,1.5,2，對比實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)h=2，k=1時，噪聲的濾除效果最佳，下圖是濾波前后對比圖。

圖3 濾波前熒光圖像

圖4 開關(guān)中值濾波后圖像

3.2 熒光目標(biāo)點定位

目標(biāo)點尋找即尋找細(xì)胞熒光結(jié)合點在熒光圖像中的位置?？梢圆捎檬謩踊蜃詣拥姆椒ǎ?dāng)目標(biāo)點排列不規(guī)則的圖像中一般采用手動定位，從而提高可靠性，且方法簡單易行。但當(dāng)熒光圖像中熒光目標(biāo)點數(shù)目眾多時，此方法就變得速度很慢，大幅增加了處理時間，降低效率。因此自動定位的方法旨在提高效率及精準(zhǔn)度，即需要設(shè)計一個準(zhǔn)確性高、可靠、抗干擾能力強的自動定位算法，這是熒光圖像識別中的一個關(guān)鍵問題。

本系統(tǒng)采用基于投影的熒光目標(biāo)定位算法，由于熒光目標(biāo)點的大小和位置在觀察區(qū)域內(nèi)是隨機變化的，所以基于投影的熒光目標(biāo)點定位算法是比較常用的算法。該算法主要將圖像進行投影計算，將計算所得的熒光圖像灰度值進行橫向和縱向的投影，每個方向都可以得到一維恢復(fù)分布函數(shù)，函數(shù)中的各個極值就對應(yīng)了熒光目標(biāo)點沿著該方向的位置坐標(biāo)。若設(shè)熒光圖像的行數(shù)為M，列數(shù)為N，沿著列方向的縱向投影一維灰度分布函數(shù)可以表示為

(12)

同理可將熒光圖像進行橫向投影，可以獲得熒光目標(biāo)點沿橫向方向的位置坐標(biāo)，橫向投影的一維灰度分布函數(shù)可以表示為

(13)

橫向和縱向的投影函數(shù)的交叉目標(biāo)就是探測到的熒光目標(biāo)點位置坐標(biāo)，為了提高投影算法的計算速度，同時減少數(shù)據(jù)量，將16位灰度值轉(zhuǎn)換為8位灰度值，以提高灰度值的權(quán)重避免未濾除的灰塵等噪點的影響?；谕队暗臒晒饽繕?biāo)定位算法雖然可以提高準(zhǔn)確性，但是缺點在于只能處理背景沒有顆粒噪聲干擾的熒光圖像，無法避免未濾除的灰塵等噪點影響。

4 實驗結(jié)果與分析

灰度變換能夠?qū)D像中的信息進行有選擇的加強或抑制，以便突出所需要的圖像細(xì)節(jié)或特征?；叶葓D像經(jīng)過二值化處理后就可以只針對取值為1的區(qū)域進行處理。

圖5 灰度化后圖像

圖6 二值化后圖像

圖7 垂直投影直方圖

圖8 水平投影直方圖

由圖5可見，灰度化后的圖像可以反應(yīng)出細(xì)胞的細(xì)節(jié)信息。而圖6中的二值化圖像可只針對高亮細(xì)胞區(qū)域進行選取及定位，提高后續(xù)處理效率。圖7及圖8的投影直方圖可看出曲線波谷波峰變換，此曲線結(jié)合行投影和列投影相關(guān)經(jīng)驗知識，能夠確定目標(biāo)熒光細(xì)胞大致圖像區(qū)域，可以用于對目標(biāo)在圖像中的定位或者分割。

5 結(jié)束語

本文介紹了一種基于熒光顯微鏡的顯微視覺圖像處理方法。通過對顯微采集系統(tǒng)采集的原始圖像進行預(yù)處理及清晰度評價函數(shù)判定、噪聲濾除及熒光細(xì)胞定位處理，較好的解決了因熒光顯微鏡景深小引起的圖像清晰度差、干擾多、圖像背景復(fù)雜等問題。通過實驗驗證表明，該方法運行效果良好，能很大程度的濾除掉圖像噪聲、定位出醫(yī)學(xué)需要細(xì)胞。在顯微醫(yī)學(xué)操作中值得深入研究和普及推廣。后續(xù)可繼續(xù)研究分析自動化細(xì)胞識別捕獲等原理，引出自動化顯微操作視覺系統(tǒng)在醫(yī)學(xué)工程中的多種應(yīng)用。

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Microscopic Visual Image Enhancement Processing based on Fluorescence Microscope

CHANG Min，LIU Tiancheng

(School of Optical-Electrical and Computer Engineering,University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093,China)

With a small microscopic visual depth of field, often appear problem such as image fuzzy, not clear, to take a method of image enhancement processing.Through microscopic to original image gray-scale transformation, histogram equalization processing methods so as to rapidly and accurately so as to obtain the image characteristics of the target.By image enhancement, target cells and localization of fluorescence image analysis in the information, to find the target location, improve cell positioning accuracy.According to image clarity evaluation function, the processed image is through the clear boundary and the details and help to medical applications.

micro-vision;image enhancement;cellular localization;evaluation function for image definition

2016- 12- 14

常敏(1978-)，女，博士，副教授。研究方向：精密儀器。劉天成(1991-)，男，碩士研究生。研究方向：精密儀器。

10.16180/j.cnki.issn1007-7820.2017.09.030

TP391.41

A

1007-7820(2017)09-108-05