單采血小板保存期內(nèi)各項(xiàng)生化標(biāo)志物的動態(tài)變化*

石潔 段志倩 鄭建勇

單采血小板保存期內(nèi)各項(xiàng)生化標(biāo)志物的動態(tài)變化*

石潔 段志倩 鄭建勇

目的 探討單采血小板在保存期內(nèi)血小板數(shù)量、形態(tài)、功能的各項(xiàng)指標(biāo)變化。方法 采用血細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)血小板數(shù)量，使用光鏡觀察血小板形態(tài)，同時測定葡萄糖、乳酸濃度以及血小板P選擇素（CD62p）和血小板聚集功能。結(jié)果 單采血小板在體外保存過程中，血小板計數(shù)和pH值在保存第5天時明顯降低；血小板形態(tài)學(xué)計分在第3天起顯著降低；葡萄糖濃度呈逐漸下降，而乳酸濃度呈逐漸升高趨勢；血小板聚集功能逐漸降低，保存第3天、第5天與第1天相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 單采血小板在體外保存期間形態(tài)和功能發(fā)生動態(tài)改變，保存3 d內(nèi)血小板形態(tài)和功能基本維持穩(wěn)定。

單采血小板 保存 血小板P選擇素 聚集

隨著輸血醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，單采血小板（apheresis platelets）已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)。血小板輸注療效確切，是臨床治療各種血液疾病、顱腦損傷、惡性腫瘤、感染性休克、創(chuàng)傷性大出血等急、危、重癥疾病的重要手段[1]。由于血小板極為脆弱，在機(jī)體血液循環(huán)中壽命僅為8～10天，離體后易發(fā)生變形和破壞，因此，在血小板采集過程中加強(qiáng)對血小板制品的質(zhì)量控制是保證血液制品臨床療效的重要環(huán)節(jié)[2]。本文研究了單采血小板在保存期內(nèi)血小板數(shù)量、形態(tài)、功能的各項(xiàng)指標(biāo)變化，分析并探討其相互間的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

材料與方法

1 材料

1.1 樣本收集與處理：2016年3～8月，按照《獻(xiàn)血者健康檢查標(biāo)準(zhǔn)要求》（GB18467-2011）篩選并收集了成分獻(xiàn)血者捐獻(xiàn)的單采血小板樣本60份。所有獻(xiàn)血者在捐獻(xiàn)單采血小板前1周內(nèi)均未服用任何抗菌藥物或能影響血小板功能的藥物。單采血小板使用MCS+血細(xì)胞分離機(jī)采集，每單位血小板濃度為（2.5～3.0）×1011個。將采集的血小板充分混勻后，使用與血小板保存袋性質(zhì)相同的樣品袋留取5～6 ml血小板樣本，置（22±2）℃血小板振蕩保存箱內(nèi)水平振搖保存5 d。在血小板采集的第1天、第3天和第5天分別進(jìn)行血小板計數(shù)、血小板形態(tài)計分、葡萄糖含量、乳酸濃度、血小板P選擇素（CD62p）和血小板聚集功能檢測。

1.2 儀器與試劑：MCS+血細(xì)胞分離機(jī)（美國血液技術(shù)公司），血小板恒溫振蕩保存箱，光學(xué)顯微鏡（日本Olympus），Sysmex-800i型血細(xì)胞計數(shù)儀（日本Sysmex），Sysmex血細(xì)胞計數(shù)試劑（日本Sysmex），pHS-3C型pH計（上海雷磁），血小板聚集儀（美國CHRONO），Neubauer計數(shù)板，葡萄糖檢測試劑盒（中生北控生物科技有限公司）、乳酸檢測試劑盒（中生北控生物科技有限公司），血小板P選擇素（CD62p）檢測試劑盒（美國TSZ），ADP試劑（美國Sigma）。

2 方法

2.1 血小板計數(shù)及生化指標(biāo)檢測：在單采血小板采集的第1天、第3天和第5天，用Sysmex-800i血細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行血小板計數(shù)，用pH計測定血小板pH值，按試劑說明書進(jìn)行葡萄糖含量、乳酸濃度和血小板P選擇素檢測。

2.2 血小板形態(tài)學(xué)計分檢測：吸取50μl血小板樣本進(jìn)行20倍稀釋后混勻，在100倍油鏡下觀察血小板形態(tài)并計分，參照Kunicki形態(tài)評分方法[3]：計數(shù)100個血小板，圓盤狀計4分，球形計2分，樹突狀計1分，氣球狀計0分，累計總分。

2.3 血小板聚集功能檢測：用10 μmol/L ADP作聚集誘導(dǎo)劑進(jìn)行血小板聚集功能檢測。取2支試管標(biāo)記為貧血小板血漿（PPP）和富血小板血漿（PRP）。吸取樣本 2 ml 3 000 r 離心10 min，吸500 μl上清于PPP；吸取樣本0.2 ml，3～5倍稀釋PPP，將血小板計數(shù)調(diào)至（2 500～3 000） ×109/ L，用PPP調(diào)零，將PRP加入測試杯，加磁力攪拌珠，37℃溫育5 min后加入8 μl ADP，血液聚集儀測定8 min血小板聚集曲線和血小板最大聚集率。

3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用t檢驗(yàn)，計數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

通過對60例單采血小板樣本進(jìn)行保存期內(nèi)數(shù)量、形態(tài)和功能的動態(tài)檢測，發(fā)現(xiàn)體外單采血小板在保存期的不同時間點(diǎn)血小板數(shù)量、形態(tài)和功能發(fā)生了動態(tài)改變。研究結(jié)果顯示，單采血小板在保存期內(nèi)血小板計數(shù)呈下降趨勢，在保存第5天血小板計數(shù)與第1天相比顯著下降（P＜0.05）；血小板形態(tài)學(xué)計分也逐漸下降，保存第3天和第5天與第1天相比，血小板形態(tài)受損，形態(tài)學(xué)分值顯著降低（P＜0.05）；血小板的pH值和葡萄糖呈進(jìn)行性下降，保存第5天pH值和葡萄糖含量比第1天顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。此外，保存第3天時葡萄糖含量與第1天相比差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。然而，檢測乳糖含量結(jié)果顯示，隨著保存時間的延長乳糖濃度增加，保存第3天和第5天與第1天的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；不僅如此，血小板P選擇素（CD62p）水平隨保存時間逐漸升高，第3、5天的水平顯著高于第1天，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。血小板聚集功能在血小板保存期間逐漸降低，血小板最大聚集率在保存第3、5天顯著低于第1天，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 單采血小板保存期內(nèi)各項(xiàng)指標(biāo)動態(tài)變化（n=60）

討 論

國家標(biāo)準(zhǔn)[4]規(guī)定單采血小板在體外保存條件為（22±2）℃振蕩保存，時間僅為5 d。研究表明，血小板在體外保存時會出現(xiàn)損傷，在一定程度上影響血小板輸注后的活力和功能[5]。血小板離體后隨著溫度降低其形態(tài)將發(fā)生改變，由盤狀變成球狀，容易聚集和破壞。血小板一旦失去了正常形態(tài)，也就失去了快速凝集功能。血小板形態(tài)計分是一種用于血小板形態(tài)學(xué)檢查的規(guī)范方法，可以較好地分析和評價血小板形態(tài)。隨著離體時間的延長，單采血小板中乳酸濃度增加將導(dǎo)致pH值降低[6]。此外，血小板的質(zhì)量還體現(xiàn)在血小板的聚集功能、粘附功能、血塊收縮實(shí)驗(yàn)、分泌功能、膜表面促凝血活性的功能等方面[7]。

本研究分析了單采血小板在保存期內(nèi)血小板數(shù)量、形態(tài)、功能的各項(xiàng)指標(biāo)變化。結(jié)果顯示，在體外保存3天內(nèi)，血小板計數(shù)沒有顯著差異，在第5天時，血小板計數(shù)明顯降低。利用血小板形態(tài)計分法觀察血小板形態(tài)，在保存第3天開始，血小板形態(tài)計分降低，表明血小板形態(tài)開始受損，血小板形態(tài)分值與第1天相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。隨著保存時間的延長，血小板形態(tài)分值呈下降趨勢。

在血小板功能改變的過程中，血小板pH值是一項(xiàng)不可忽視的指標(biāo)。有研究證實(shí)，血小板在pH＜6時存活時間顯著降低[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，血小板pH值在體外保存3天內(nèi)無顯著改變，而在保存第5天明顯降低，與第1天相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。由于糖酵解是血小板重要的代謝途徑，而糖酵解的終產(chǎn)物是乳酸。乳酸含量增加到一定程度時可引起血小板pH降低。因此，本研究檢測了血小板在體外保存過程中葡萄糖和乳酸的含量變化。發(fā)現(xiàn)單采血小板隨著體外保存時間的延長，葡萄糖濃度降低，乳酸含量增加。保存第3天、第5天與第1天相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

血小板P選擇素（CD62p）即血小板α顆粒膜蛋白140，在血小板活化后可表達(dá)于血小板膜表面，可作為血小板活化的分子標(biāo)志物[9]。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD62p，結(jié)果顯示，隨著血小板保存時間延長，CD62p水平逐漸升高，第3、5天顯著高于第1天，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。除此以外，通過檢測血小板聚集功能發(fā)現(xiàn)，隨著血小板保存時間延長，血小板聚集能力逐漸降低，最大聚集率在保存第3、5天顯著低于第1天，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

由此可見，在離體狀態(tài)下，血小板功能呈降低趨勢。本研究結(jié)果提示，血小板形態(tài)和功能在保存3天內(nèi)基本穩(wěn)定，而在保存第5天時，血小板形態(tài)與功能出現(xiàn)較大改變。因此，盡管單采血小板的保存時間為5 d，但在采集制備3 d內(nèi)輸注可達(dá)到較好的效果。

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3 Kunicki TJ，Tuccelli M，Becker GA，et a1.A Study of variables affecting the quality of platelets stored at "Room temperarure" [J].Transfusion，1975，15（5）：414-421．

4 GB18469-2012.全血及成分血質(zhì)量要求[S].

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6 Ringwald J，Haager B，Krex D，et al.Impact of different hold time before addition of platelet additive solution on the in vitro quality of apheresis platelets [J].Transfusion，2006，46（6）：942-948.

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9 Picker SM，Tauszig ME，Gathof BS.Cell quality of apheresis-derived platelets treated with riboflavinultraviolet light after resuspension in platelet additive solution [J].Transfusion，2012，52（3）：510-516.

The Dynamic Change of Various Biochemical Markers during the Preservation of Apheresis Platelets

SHI Jie，DUAN Zhi-qian，ZHENG Jian-yong.
Nanjing Red Cross Blood Center，Quality management Department，210003

Objective To Analyze and discuss the changes in number，morphology，and function in the preservation period of apheresis platelets.Methods Countand observe the morphologyof platelets while determinethe glucose，lactic acid concentration，platelet P-selectin （CD62p） and platelet aggregation function.Results During in vitro preservation，platelets count and PH value were significantly lower when it comes toDay 5.Platelet morphology score significantly declined since the third day.The glucose concentration gradually decreased and lactic acid concentration showed a trend of rising.Compared with Day1，platelet aggregation function gradually reduced （P＜0.05） in Day 3 and Day 5.Conclusion During in vitro preservation period of apheresis platelets，the platelet morphology and function dynamically changed，but were stable in the first three days.

Apheresis platelets Preservation Platelet P-selectin Aggregation

R331.1+43

A

1671-2587（2017）04-0325-03

2017-02-12）

（本文編輯：王虹）

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.04.004

*本課題受南京市衛(wèi)生局一般性項(xiàng)目（No.14171）資助

210003 江蘇省南京紅十字血液中心質(zhì)量管理科

石潔（1986–），女，江蘇鹽城人，檢驗(yàn)技師，碩士，主要從事微生物學(xué)檢驗(yàn)、血液產(chǎn)品質(zhì)量控制與管理工作，（Tel）13601463830（E-mail）599066727@qq.com。

鄭建勇，主管技師，主要從事血液產(chǎn)品質(zhì)量控制與管理工作，（Tel）13813900291（E-mail）417618163@ qq.com。