1株Wickerhamomyces酵母菌對濃香型白酒發(fā)酵的影響

簡曉平，簡章容，余麗辰，鄧騖遠，游 玲

(1.四川省宜賓高洲酒業(yè)有限責任公司，四川宜賓645178； 2.宜賓學院生命科學與食品工程學院，四川宜賓644000)

1株Wickerhamomyces酵母菌對濃香型白酒發(fā)酵的影響

簡曉平1，簡章容1，余麗辰2，鄧騖遠2，游 玲2

(1.四川省宜賓高洲酒業(yè)有限責任公司，四川宜賓645178； 2.宜賓學院生命科學與食品工程學院，四川宜賓644000)

為了探究1株Wickerhamomyces anomalus酵母菌對濃香型白酒發(fā)酵的影響，將該株酵母菌接種至糟醅中發(fā)酵，并分析糟醅的理化性質、風味物質及微生物區(qū)系的變化。結果顯示，此酵母菌能使糟醅中氨基態(tài)氮的含量極顯著增加，乙醇顯著減少；乙酸生成量極顯著減少，正丁醇極顯著增加，仲丁醇顯著增高，異戊醇、苯甲醇和丁酸乙酯顯著減少；增加糟醅中細菌和真菌群體的多樣性和豐度，使Sphingobacterium、Botryotinia豐度降低，使Lactobacillus、Xeromyces豐度增加。結果表明，W.anomalus酵母菌對濃香型白酒發(fā)酵有著廣泛而深遠的影響。

Wickerhamomyces； 濃香型白酒； 糟醅理化性質； 風味物質； 微生物區(qū)系

濃香型白酒發(fā)酵是以糟醅為介質，通過酒曲和窖泥中微生物的共代謝，生成酒精及多種風味物質。其中，酵母作為白酒釀造微生物中的重要類群，在糖化原料、產(chǎn)酒、形成香氣物質等方面都起著重要的作用，部分酵母菌株已用于白酒釀造[1]，但現(xiàn)有白酒用商業(yè)酵母菌均為釀酒酵母，而已有研究表明，非釀酒酵母可通過分泌多種風味酶促進風味物質生成[2]。Wickerhamomyces anomalus酵母菌作為非釀酒酵母，用于芒果酒、蘋果酒及面包發(fā)酵，效果均較好[3]；葉萌祺[4]、王益姝[5]的研究表明，其可在高酸度條件下生長良好，生成大量酯類，并且保證生成的酯類不被降解[6]。游玲等[7]從宜賓濃香型白酒產(chǎn)區(qū)分離了大量功能釀酒酵母，其中1株W.anomalus酵母菌體現(xiàn)了很好的產(chǎn)酯能力。本研究通過在糟醅中強化接種該酵母，通過糟醅中碳氮轉化和風味物質生成情況，探討此酵母菌對濃香型白酒發(fā)酵過程中物質代謝的影響，同時采用高通量測序分析該酵母對糟醅中微生物區(qū)系的影響，從產(chǎn)物生成及釀造微生物生態(tài)兩個方面評價W.anomalus酵母對濃香型白酒發(fā)酵的影響，為該酵母的推廣應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：從濃香型白酒糟醅中分離得到1株Wickerhamomyces anomalus酵母菌，保藏編號S432Y-42-C（現(xiàn)保存于固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室）。

糟醅：由宜賓高洲酒業(yè)有限責任公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液制備

目的酵母菌接種至50 mL YPD液體培養(yǎng)基中活化，再轉接至YPD固態(tài)培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)至形成單菌落，然后挑取單菌落接種至YPD液體培養(yǎng)基中，28℃恒溫擴培2 d。將擴培后的培養(yǎng)液在8000 r/min條件下，低溫離心5 min，取沉淀以無菌水洗滌離心3次后，調節(jié)菌體濃度為108個/mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 發(fā)酵

固態(tài)發(fā)酵體系：在濃香型白酒釀造車間，入窖糧糟加1%（v/v）黃水混勻后，分裝入1 L的玻璃壇（每壇0.83 kg±0.05 kg），每個玻璃壇接種50 mL菌懸液，充分混勻后封口（封口材料自內向外依次為窖皮泥、壇蓋、保鮮膜、牛皮紙）。

混菌處理：添加黃水的糟醅裝入玻璃壇后，接種50 mL菌懸液，充分混勻后封口。

純菌對照：添加黃水的糟醅裝入玻璃壇后，1× 105Pa滅菌30 min，冷卻至35℃左右接種50 mL菌懸液封口。

空白對照：以等體積的無菌水代替50 mL菌懸液接種未滅菌的糟醅。

處理和對照均設3個重復，室溫條件下遮光發(fā)酵60 d。

1.2.3 理化指標檢測

（1）淀粉含量：通過GB/T 5009.9—2008，采用酶水解法來測定淀粉的含量[8]。

（2）還原糖含量：通過GB/T 5009.7—2008，采用斐林試劑滴定法來測定還原糖的含量[9]。

（3）酸度：通過GB/T 9736—2008，采用滴定分析法來測定酸度[10]。

（4）氨基態(tài)氮：通過GB/T 12143—2008，采用甲醛值法來測定氨基態(tài)氮的含量[11]。

1.2.4 風味物質及乳酸檢測

將固液態(tài)發(fā)酵樣品加入200 mL的去離子水，蒸餾得到100 mL的蒸餾液，所有的蒸餾液均用0.22 μm濾膜過濾備用。

[12]，采用FFAP色譜柱（50×0.25 mm× 0.25 μm，Agilent USA）和LZP-930色譜柱（50 m× 0.25 mm×0.25 μm，鄭州普析）檢測有機酸及其他主要風味物質，采用C18柱（5 μm，250×4.6 mm）應用液相色譜法檢測乳酸含量。

2 結果與分析

遮光處理發(fā)酵60 d后，對所有處理及其對照組進行觀察測定和分析。以下分別討論S432Y-42-C酵母對糟醅中碳氮源利用、風味物質生成及微生物區(qū)系的影響。

2.1 S432Y-42-C對糟醅中碳氮源利用的影響

白酒發(fā)酵過程中，糟醅中糖類物質（特別是還原糖）含量變化直接反映了微生物的生長狀況及發(fā)酵速度的快慢，蛋白質及氨態(tài)氮含量對白酒品質有較大影響，因此對糟醅發(fā)酵前后的主要碳氮物質含量進行檢測。

S432Y-42-C對糟醅中碳氮源利用的影響見圖1。從圖1可知，與接種S432Y-42-C酵母菌株的滅菌糟醅相比，混菌糟醅中淀粉、還原糖含量略低，其含量差異都未達到顯著水平，而混菌糟醅中乙醇含量顯著高于純菌發(fā)酵，可能是因為：第一，強化接種菌株和糟醅微生物共同作用加強了發(fā)酵體系糖化酶作用，從而提高了淀粉轉化率，導致還原糖生成量多，因此乙醇生成量增多；第二，糟醅滅菌后，由于高溫作用，產(chǎn)酒酵母減少，使整個發(fā)酵體系發(fā)酵力減弱。

圖1 S432Y-42-C對糟醅中碳氮利用的影響

與空白對照相比，混菌發(fā)酵糟醅中淀粉含量、氨態(tài)氮和還原糖略高，殘淀含量高于空白糟醅，說明加入強化菌株后降低了淀粉利用率，因此乙醇含量也相應降低，可能是由于加入強化酵母后影響了糟醅的微生物區(qū)系，進而影響到糟醅的微生物共代謝網(wǎng)絡，使糟醅中糖化酶的產(chǎn)生及作用受到一定抑制。同時，混菌發(fā)酵體系中氨基態(tài)氮含量極顯著高于空白對照組，可能是接種此酵母后促使蛋白酶活性增加，合成氨基態(tài)氮的微生物增多。

2.2 S432Y-42-C對糟醅中風味物質含量的影響

2.2.1 S432Y-42-C對糟醅中醇類物質含量的影響（表1）

表1 S432Y-42-C對糟醅中醇含量的影響 (g/L)

由表1可知，與接種S432Y-42-C的純菌發(fā)酵糟醅相比，接種S432Y-42-C的混菌糟醅中5種高級醇生成量均高于純菌糟醅，并且其中仲丁醇和異戊醇含量差異達到顯著水平，正丁醇達到極顯著水平，除乙醇外的總醇生成量明顯高于純菌發(fā)酵生成量，除此之外，苯甲醇含量顯著低于純菌發(fā)酵體系，說明該酵母菌株與糟醅中其他微生物的相互作用傾向于增加高級醇的生成。

與空白對照組相比，混菌發(fā)酵糟醅中正丁醇含量極顯著高于空白糟醅，除了異戊醇、苯甲醇和正己醇外，其余醇類含量均高于空白糟醅，高級醇總量也明顯高于空白組，但是未達到顯著水平，由此推測出可能是接種S432Y-42-C酵母菌與發(fā)酵體系中酶構成協(xié)同作用促進了醇類物質大量生成。

2.2.2 S432Y-42-C對糟醅中有機酸和酯類物質含量的影響（表2、表3）

由表2可知，與接種S432Y-42-C酵母菌株的滅菌糟醅相比，混菌發(fā)酵糟醅中乙酸含量極顯著低于純菌發(fā)酵，己酸含量略高，丁酸、乳酸含量較低，總酸含量也比較低，但含量差異均未達到顯著水平?？赡茉蚴墙尤肓薙432Y-42-C酵母菌株對乙酸菌、丁酸菌和乳酸菌產(chǎn)酸有抑制作用，導致相應菌株生成酸量減少?？偟膩碚f，糟醅滅菌與否，對產(chǎn)酸量有影響，且乙酸含量差異已達到極顯著水平。

表2 S432Y-42-C對糟醅中有機酸含量的影響 (g/mL)

表3 S432Y-42-C對糟醅中酯含量的影響 (g/L)

與空白對照組相比，混菌發(fā)酵糟醅酸度略低，總酸含量較低，其中混菌發(fā)酵糟醅中乙酸含量顯著低于空白糟醅，而對于其他有機酸類物質，盡管表2顯示各處理有一定差異，但顯著性分析表明各處理間差異均不顯著。

由表3可知，與接種酵母菌株的滅菌糟醅相比，混菌發(fā)酵糟醅中丁酸乙酯、乳酸乙酯和己酸乙酯含量略高，乙酸乙酯含量較低，總酯含量略低，其原因可能是糟醅滅菌后產(chǎn)酸菌減少，酯化酶滅活，并且在高溫條件下?lián)]發(fā)性酸和醇也導致酯生成量減少，而乙酸乙酯含量較低可能是由于加入的S432Y-42-C菌削弱了乙酸菌的產(chǎn)酸能力，從而生成的乙酸量較少，進而生成的相應酯較少?？傮w來說，接種此株酵母后，對糟醅中酯的合成有一定程度的影響，但只有丁酸乙酯含量差異達到顯著水平。

與空白對照相比，混菌發(fā)酵糟醅的乙酸乙酯、乳酸乙酯含量略高，丁酸乙酯、己酸乙酯含量較低，總酯含量略低。其可能是接入的S432Y-42-C菌對整個發(fā)酵體系有一定影響，丁酸菌、己酸菌酸化力減弱，酯化力減弱，而增強了乙酸菌、乳酸菌的酯化力，從而使4種主體酯有減有增。由此可見，接種S432Y-42-C酵母菌株對糟醅中4種酯含量和總酯含量均有一定程度的影響，但是均未達到顯著水平。

總體來說，混菌發(fā)酵糟醅的酸度均比純菌糟醅和空白對照低，其中混菌中乳酸含量均比純菌和空白中低，而生成乳酸乙酯含量卻均高于純菌和空白，說明接種該菌株后促使其他風味物質轉化成了乳酸乙酯；并且4種主要的有機酸和酯含量均較低，從而說明接種S432Y-42-C酵母菌株后可在一定程度減弱濃香風味。

2.2.3 S432Y-42-C對糟醅中醛類物質含量的影響（見圖2）

圖2 S432Y-42-C對糟醅中醛類物質含量的影響

由圖2可知，與接種S432Y-42-C菌株的滅菌糟醅相比，混菌發(fā)酵糟醅中異丁醛、糠醛和乙縮醛含量比較低，而只有乙醛含量略高，可能原因是：第一，純菌的乙醇含量較少，氧化成乙醛量較低；第二，混菌糟醅中的微生物可能抑制了接種酵母菌株生成醛類物質?？偟膩碚f，糟醅不滅菌，對乙醛、異丁醛、糠醛、乙縮醛含量均有影響，但均未達到顯著水平。

與空白對照組相比，混菌發(fā)酵糟醅中乙醛含量降低了，而異丁醛、糠醛和乙縮醛均升高了，但都未達到顯著水平，說明此菌株對醛類物質生成有一定影響，接入此菌株傾向于增加了異丁醛和糠醛生成量，從而可能對白酒產(chǎn)生不良風味。

2.3 S432Y-42-C對糟醅微生物區(qū)系的影響

2.3.1 S432Y-42-C對細菌區(qū)系的影響（表4）

表4 S432Y-42-C對細菌區(qū)系多樣性的影響

由表4可知，兩個樣本的覆蓋率均超過92%，能很好地反映糟醅樣本中細菌微生物菌群的真實信息。接種S432Y-42-C后糟醅的有效序列數(shù)減少，但操作分類單元數(shù)增加了，同時香農(nóng)指數(shù)增高了，表明該酵母提高了糟醅中細菌的多樣性，即該體系的均勻度提高了，微生物的類群數(shù)越高，對于生態(tài)系統(tǒng)來說越穩(wěn)定。

不同分類水平下高通量測序類群數(shù)見表5。

表5 不同分類水平下高通量測序類群數(shù)

從表5可以看出，接種S432Y-42-C后，糟醅中細菌門從15個增加到22個，并且在綱、目、科、屬、種水平上均有較大幅度的增長，造成此現(xiàn)象可能是因為接入的S432Y-42-C菌株破壞了原有的生態(tài)平衡，促進本應該衰老的菌株繼續(xù)分裂生長，從而提高了物種多樣性。其中優(yōu)勢門為Firmicutes，優(yōu)勢綱為Bacilli，優(yōu)勢目為Lactobacillales。

S432Y-42-C對糟醅中細菌區(qū)系構成的影響見圖3。從圖3可以看出，接種S432Y-42-C酵母菌株后，優(yōu)勢屬Pseudomonas和Sphingobacterium的豐度明顯銳減，而Lactobacillus屬的豐度大幅度增高了，Kroppenstedtia屬豐度也明顯增加了，并且也出現(xiàn)了一些其他屬，說明此菌株可促進某些屬的生長來提高菌體多樣性，例如Lactobacillus屬。

圖3 S432Y-42-C對糟醅中細菌區(qū)系構成的影響

2.3.2 S432Y-42-C對真菌區(qū)系的影響（表6、表7、圖4）

表6 S432Y-42-C對真菌區(qū)系多樣性的影響

由表6可知，接種S432Y-42-C后糟醅的有效序列數(shù)減少，操作分類單元數(shù)減少，空白組樣本的覆蓋率超過99%，能很好地反映糟醅樣本中真菌微生物菌群的真實信息，而另一樣本的覆蓋率超過81%，也能大致反映糟醅樣本中細菌微生物菌群的真實信息。同時香農(nóng)指數(shù)和ACE指數(shù)變化表明，該酵母增高了糟醅中真菌的多樣性及豐富度。

由表7可知，接種S432Y-42-C后，糟醅中真菌綱從21個下降到17個，目從58個下降到37個，科從97個下降到59個，屬從144個下降到73個，種從215個下降到96個。其中豐度最高綱是Eurotiomycetes，豐度最高目是Saccharomycetales，豐度最高的種是Zygosaccharomyces pseudobailii。

表7 不同分類水平下高通量測序類群數(shù)

圖4 S432Y-42-C對糟醅中真菌區(qū)系構成的影響

從圖4可以看出，接種S432Y-42-C酵母菌株后，優(yōu)勢真菌Botryotinia屬大幅度減少，Lodderomyces酵母屬消失，而unclassified fungi、Xeromyces等屬的豐度不同程度的增高，說明此菌對真菌區(qū)系影響較大。

3 結論

根據(jù)研究表明，固態(tài)發(fā)酵的影響因素和不確定因素較多，所以固態(tài)發(fā)酵不均勻導致數(shù)據(jù)波動較大。本研究模擬固態(tài)發(fā)酵，分別從對糟醅碳氮轉化、風味物質生成及微生物區(qū)系的影響這3個方面探究1株W.anomalus酵母對濃香型白酒發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)：

(1)接種S432Y-42-C酵母對淀粉、還原糖影響不大，對乙醇有顯著影響，對氨基態(tài)氮有極顯著影響，減弱了糟醅發(fā)酵力，同時極顯著促進蛋白質分解。

(2)該酵母傾向于增加甲醇、仲丁醇、正丁醇、糠醇、異丁醛和糠醛的生成，減少異戊醇、苯甲醇丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸和乳酸的生成，其中仲丁醇、異戊醇、苯甲醇、丁酸乙酯已達到顯著水平，而正丁醇和乙酸已達到極顯著水平。

(3)接種該酵母后均增加了糟醅中細菌和真菌多樣性和豐富度，且對真菌區(qū)系影響更大。

因為固態(tài)發(fā)酵的不均質性，且糟醅中微生物之間的作用較復雜，因此對于上述結論中涉及到的相關現(xiàn)象產(chǎn)生的何種原因、機理還不清楚，后續(xù)還需要進行更深一步的探索、研究。

參考文獻：

[1]侯建光,郭富祥,樊建輝,等.響應面法優(yōu)化陶香型窖池中異常威克漢姆酵母發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯條件[J].釀酒科技,2016(10)：78-81.

[2]崔艷,劉金福.非釀酒酵母在葡萄酒釀造中應用的研究現(xiàn)狀[J].中國釀造,2010(11)：13-16.

[3]岑濤,岳田利,袁亞宏,等.云南芒果中酵母菌分離鑒定及在芒果酒發(fā)酵中的應用[J].食品科學,2015(11)：119-124.

[4]葉萌祺.蘋果酒釀造過程香氣物質調控及FT-NIRS分析方法研究[D].西安：西北農(nóng)林科技大學,2015.

[5]王益姝.生香酵母及其面團發(fā)酵過程與面包香氣特征研究[D].無錫：江南大學,2016.

[6]張玉然,李文平,郭蘭英,等.2株酒用酵母的分子鑒定及耐受性研究[J].濟寧醫(yī)學院學報,2016,39(6)：386-390.

[7]YOU L,WANG S,ZHOU R P,et al.Characteristics of yeast flora in Chinese strong flavour spirit fermentation in Yibin Region,China[J].Journal of the Institute of Brewing,2016,122(7)：517-523.

[8]中華人民共和國衛(wèi)生部.食品中淀粉的測定：GB/T 5009.9—2008[S].北京：中國標準出版社,2009.

[9]中華人民共和國衛(wèi)生部.食品中還原糖的測定：GB/T 5009.7—2008[S].北京：中國標準出版社,2009.

[10]中國石油和化學工業(yè)協(xié)會.化學試劑酸度和堿度測定通用方法:GB/T 9736—2008[S].北京：中國標準出版社,2008.

[11]全國食品工業(yè)標準化技術委員會.飲料通用分析方法：GB/T 12143—2008[S].北京：中國標準出版社, 2009.

[12]YOU L,WANG T,YANG Z R,et al.Performance of indigenous yeasts in the processing of Chinese strong-flavoured liquor during spontaneous mixed solidstate or submerged fermentation[J].Journal of the Institute of Brewing,2015,121：295-303.

Effects of a Wickerhamomyces Strain on the Fermentation of Nongxiang Baijiu

JIAN Xiaoping1,JIAN Zhangrong1,YU Lichen2,DENG Wuyuan2and YOU Ling2
(1.Gaozhou Distillery Co.Ltd.,Yibin,Sichuang 645178;2.College of Life Science& Food Engineering,Yibin University,Yibin,Sichuang 644000,China)

In order to explore the effects of a Wickerhamomyces anomalus strain on the fermentation of Nongxiang Baijiu,the strain was inoculated in fermented grains,and the change in physicochemical indexes,flavoring substances and microflora in the fermented grains was analyzed.The results suggested that,the inoculation of the strain could significantly increase the content of amino nitrogen,n-butyl alcohol and sec-butyl alcohol in the fermented grains,and reduce ethanol content,acetic acid yield,isoamyl alcohol,benzyl alcohol and ethyl butyrate.Furthermore,the strain could increase the diversity and abundance of bacteria and fungus in the fermented grains(Lactobacillus and Xeromycess became dominant strains instead of Sphingobacterium and Botryotinia).In conclusion, W.anomalus strain had extensive and deep influence on the fermentation of Nongxiang Baijiu.

Wickerhamomyces;Nongxiang Baijiu;physicochemical properties of fermented grains;flavoring substances;microflora

TS262.3；TS261.1；TS261.4；Q93-3

A

1001-9286（2017）09-0033-06

10.13746/j.njkj.2017194

宜賓學院博士啟動項目（2017JJ009）；四川省重點實驗室項目（2015GTC001）。

2017-07-11

簡曉平(1965-)，男，高級釀酒師，白酒國家級評委，主要從事白酒釀造技術研究。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2017-08-10；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170810.1534.001.html。