白酒中環(huán)二肽成分的分析研究

鄧霞玲，練順才，謝正敏，廖勤儉，葉華夏，張 倩

(四川宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓644007)

白酒中環(huán)二肽成分的分析研究

鄧霞玲，練順才，謝正敏，廖勤儉，葉華夏，張 倩

(四川宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓644007)

采用HPLC-QTOF高分辨質(zhì)譜儀在白酒樣品中檢測(cè)到13種環(huán)二肽化合物，并定性鑒定為環(huán)（丙氨酸-脯氨酸）、環(huán)（二氨基丁酸）、環(huán)（亮氨酸-丙氨酸）、環(huán)（異亮氨酸-纈氨酸）、環(huán)（蘇氨酸-脯氨酸）、環(huán)（脯氨酸-苯丙氨酸）、環(huán)（苯丙氨酸-丙氨酸）、環(huán)（亮氨酸-異亮氨酸）、環(huán)（纈氨酸-纈氨酸）、環(huán)（酪氨酸-脯氨酸）、環(huán)（苯丙氨酸-纈氨酸）、環(huán)（脯氨酸-亮氨酸）、環(huán)（二苯丙氨酸）等。其中環(huán)（亮氨酸-丙氨酸）、環(huán)（脯氨酸-苯丙氨酸）、環(huán)（苯丙氨酸-丙氨酸）、環(huán)（酪氨酸-脯氨酸）、環(huán)（脯氨酸-亮氨酸）具有多種生理活性。

白酒； 環(huán)二肽； HPLC-QTOF

環(huán)二肽（cyclic dipeptides）又叫2，5-二酮哌嗪等衍生物(2,5-diketopiperazine derivatives)，該類化合物在人、脊椎動(dòng)物、無脊椎動(dòng)物、植物、真菌和細(xì)菌中均有發(fā)現(xiàn)，由于環(huán)二肽形成一個(gè)穩(wěn)定的六元環(huán)結(jié)構(gòu)，具有一定的構(gòu)象約束作用，有兩個(gè)氫鍵給體和兩個(gè)氫鍵受體，氫鍵是藥物與受體相互作用的主要方式之一，因而環(huán)二肽在藥物化學(xué)中是一個(gè)重要的藥效團(tuán)。目前發(fā)現(xiàn)許多環(huán)二肽具有強(qiáng)的生理活性，引起了有機(jī)化學(xué)家、生物學(xué)家和藥物學(xué)家的廣泛興趣。環(huán)二肽的報(bào)道不多，至今沒有查到有關(guān)白酒中環(huán)二肽的報(bào)道。

白酒是中國的國粹，是傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵的產(chǎn)物，自然接種使大曲和酒糟中存在各種各樣的微生物，其中不乏真菌和細(xì)菌，尤其是發(fā)酵后期以細(xì)菌為主，加上傳統(tǒng)白酒獨(dú)特的蒸餾工藝，高沸點(diǎn)的環(huán)二肽被帶入酒中，成為酒體的一部分。白酒中的環(huán)二肽種類很多，已檢出20種以上，但通常含量很低，在μg/L級(jí)甚至更低，少數(shù)在mg/L級(jí)，因此用高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定白酒中的環(huán)二肽時(shí)需要前處理。

1 材料與方法

1.1 材料

酒樣：市售濃香型白酒（53%vol）、清香型白酒（53%vol）、醬香型白酒（53%vol）。

儀器：美國Agilent公司1290系列高效液相色譜儀，6520B系列四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)器，色譜柱為Agilent Eclipse Plus C182.1×100mm 1.8-micron，有機(jī)前處理系統(tǒng)一套，SPE C18小柱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

取白酒樣品50 mL，過SPE C18小柱后，甲醇洗脫，洗脫液經(jīng)有機(jī)前處理系統(tǒng)低溫濃縮至2 mL，置于干凈的進(jìn)樣瓶中，供液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)樣檢測(cè)。

1.2.2 樣品檢測(cè)

1.2.2.1 液相色譜條件

分析柱：Agilent Eclipse Plus C182.1×100 mm 1.8-micron；柱溫：30℃；流速：0.1 mL/min；進(jìn)樣體積：1μL；流動(dòng)相：甲醇B（液質(zhì)級(jí)），超純水A（含0.1%甲酸），0～18 min：10%B-100%B；18.1～26 min：100%B-100%B；26.1～30 min：100%B-10%B；32 min：stop。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描模式：正模式；檢測(cè)方式：選擇離子檢測(cè)（SIM）；干燥氣溫度：300℃；干燥氣流量：10 L/min；霧化氣壓力：40 psig；毛細(xì)管電壓：3500 V；毛細(xì)管出口電壓：70 V。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

質(zhì)譜經(jīng)過Agilent MassHunter數(shù)據(jù)采集工作軟件、定性定量分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對(duì)于化合物分子式的判定，主要依據(jù)m/z、同位素相對(duì)豐度、同位素比例等的相似度。分別再經(jīng)過目標(biāo)離子（target掃描）的碎片進(jìn)行目標(biāo)物的結(jié)構(gòu)判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 酒樣分析

通過上述的檢測(cè)方法，對(duì)市售濃香型白酒（53%vol）、清香型白酒（53%vol）、醬香型白酒（53%vol）的3種酒樣進(jìn)行分析，結(jié)果見表1。

表1 環(huán)二肽名稱、分子式、母離子、子離子、碰撞能量

由表1可看出，3種香型的白酒中都存在環(huán)二肽，尤其濃香型與醬香型白酒中檢出的環(huán)二肽的種類更多。

2.1.2 環(huán)二肽結(jié)構(gòu)

經(jīng)過LC-QTOF質(zhì)譜儀碎片離子峰后，得出的13種環(huán)二肽結(jié)構(gòu)式見圖1。

2.1.3 二級(jí)質(zhì)譜圖

經(jīng)過LC-QTOF質(zhì)譜儀碎片離子峰后，3種酒樣對(duì)應(yīng)的TIC圖及其中每種環(huán)二肽對(duì)應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜圖，見圖2—圖17。

2.2 結(jié)果討論與分析

據(jù)哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院的盧曦元、徐德昌等人在《環(huán)二肽的生物活性的研究進(jìn)展》一文中，詳細(xì)講述了環(huán)二肽的生物活性的作用：細(xì)胞間信息傳遞、抑制毒素、促癌細(xì)胞凋亡和鎮(zhèn)痛作用等。Rhee等首次提出兩種環(huán)二肽的協(xié)同作用于抑制致病微生物生長和在沙門氏菌中的抗突變作用。這兩種環(huán)二肽為cyclo(L-Leu-L-Pro)和cyclo(L-Phe-L-Pro)，這種藥物組合對(duì)物種抗萬古霉素的糞腸球菌菌種具有較強(qiáng)的抑制作用；對(duì)另外的物種菌種也具有抑制作用，對(duì)應(yīng)的最低抑菌濃度為0.25～0.5 mg/L。Lee等發(fā)現(xiàn)由放射誘發(fā)的早期肺損傷可以通過濃度為40 mg/kg的cyclo(L-Phe-LPro)減低，并證明cFP對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用于TNF-α、TGF-β1有關(guān)，但具體機(jī)理未知。KumikoⅢo等證實(shí)Cyclo(L-Leu-L-Tyr)(cLY)對(duì)天竺鼠缺血后功能障礙具有保護(hù)性影響，并與對(duì)應(yīng)的線性肽進(jìn)行了對(duì)比，cLY能夠顯著增強(qiáng)左心室發(fā)展壓、左心室舒張末壓、冠脈流量和心率等等。李德海等在《海洋放線菌11014中抗腫瘤活性成分研究I.環(huán)二肽》一文中采用SRB法測(cè)定了13個(gè)環(huán)二肽的體外抗腫瘤活性，結(jié)果表明，化合物環(huán)[4-羥基-脯氨酸-苯丙氨酸)在5 μg/mL時(shí)有較強(qiáng)的體外抗腫瘤活性[抑制率為(48.3±3.3)%]，化合物環(huán)（亮氨酸-丙氨酸)、環(huán)(異亮氨酸-丙氨酸)、環(huán)(纈氨酸-丙氨酸)、環(huán)(脯氨酸-酪氨酸)、環(huán)(脯氨酸-苯丙氨酸)、環(huán)(脯氨酸-纈氨酸)具有弱的體外抗腫瘤活性，抑制率分別為(13.1± 5.3)%(5 μg/mL)、(13.84±0.5)%(10 μg/mL)、(24.3± 3.1)%(100 μg/mL)、(15.7±4.2)%(50 μg/mL)、(13.1± 1.9)%(5 μg/mL)、(13.3±1.6)%(5 μg/mL)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)這些環(huán)二肽的體外抗腫瘤作用在5～100 μg/mL范圍內(nèi)不具有濃度依賴性，其他化合物未表現(xiàn)出體外抗腫瘤活性。如化合物環(huán)(纈氨酸-丙氨酸)、環(huán)(脯氨酸-苯丙氨酸)同時(shí)具有激活A(yù)HI，感應(yīng)器和誘導(dǎo)生物發(fā)光的作用?；衔锃h(huán)(酪氨酸-甘氨酸)，環(huán)(脯氨酸-酪氨酸)、環(huán)(脯氨酸-纈氨酸)，環(huán)(脯氨酸-亮氨酸）具有抗鰻弧菌(Vibrio anguillarum)的作用，MIC分別為0.07 μg/mL、0.03 μg/mL、0.05 μg/mL和0.05 μg/mL。

圖1 13種環(huán)二肽結(jié)構(gòu)式

圖2 濃香型白酒全掃描色譜圖

圖3 清香型白酒全掃描色譜圖

圖4 醬香型白酒全掃描色譜圖

圖5 環(huán)（丙氨酸-脯氨酸）二級(jí)質(zhì)譜

圖6 環(huán)（二氨基丁酸）二級(jí)質(zhì)譜圖

圖7 環(huán)（異亮氨酸-纈氨酸）二級(jí)質(zhì)譜圖

圖8 環(huán)（纈氨酸-纈氨酸）二級(jí)質(zhì)譜圖

圖9 環(huán)（脯氨酸-苯丙氨酸）二級(jí)質(zhì)譜圖

圖10 環(huán)（亮氨酸-異亮氨酸）二級(jí)質(zhì)譜圖

圖11 環(huán)（酪氨酸-脯氨酸）二級(jí)質(zhì)譜

圖12 環(huán)（脯氨酸-亮氨酸）二級(jí)質(zhì)譜圖

圖13 環(huán)（二苯丙氨酸）二級(jí)質(zhì)譜圖

圖14 環(huán)（亮氨酸-丙氨酸）二級(jí)質(zhì)譜圖

圖15 環(huán)（蘇氨酸-脯氨酸）二級(jí)質(zhì)譜圖

圖16 環(huán)（苯丙氨酸-丙氨酸）二級(jí)質(zhì)譜圖

圖17 環(huán)（苯丙氨酸-纈氨酸）二級(jí)質(zhì)譜圖

通過對(duì)3種香型酒樣中環(huán)二肽的分析研究，不同香型的酒主要由不同的發(fā)酵方式、不同的天然微生物（環(huán)境造成）而產(chǎn)生不同種類的環(huán)二肽物質(zhì)，不同的環(huán)二肽物質(zhì)具有不同的生理活性。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，本文中發(fā)現(xiàn)的13種環(huán)二肽物質(zhì)中化合物3、6、7、10、12等都具有多種生理活性，而其余化合物中的生理活性有待進(jìn)一步的開發(fā)研究。肽類化合物，尤其是環(huán)肽類化合物有各種各樣的生理活性，它們可以是抗生素、毒素、免疫抑制劑、離子轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)器、蛋白黏合抑制劑、酶抑制劑等。由此可見環(huán)二肽的生物活性是非常強(qiáng)大而且具有很強(qiáng)的開發(fā)潛力。

3 結(jié)語

針對(duì)白酒中環(huán)二肽物質(zhì)的分析研究屬于首次報(bào)道，由于釀酒微生物的分布非常廣泛，尤其是一些特殊的老窖泥，“老窖泥”是在特殊的地質(zhì)、特殊的土壤、特殊的氣候條件下，在特定的工藝條件輔助下，通過長期不斷培養(yǎng)形成的。其珍貴之處在于通過數(shù)百年的沉淀和累積，這些老窖泥中聚集了一個(gè)特殊的、專為釀酒所形成的微生物環(huán)境，而這個(gè)微生物環(huán)境中存在高達(dá)數(shù)百種之多的有益微生物菌群落。另外釀酒原料中含有多種微生物所需的各種營養(yǎng)源，這樣為產(chǎn)生環(huán)二肽甚至多肽物質(zhì)提供必要的條件。再加上白酒獨(dú)特的蒸餾方式造成對(duì)這些高沸點(diǎn)物質(zhì)的拖帶作用，從而在白酒中產(chǎn)生。由于環(huán)二肽物質(zhì)多數(shù)具有生理活性，通過對(duì)環(huán)二肽的分析研究，對(duì)白酒的健康因子的研究起到很好的提升作用；對(duì)白酒中風(fēng)味物質(zhì)的剖析有質(zhì)的變遷，因?yàn)檫^去對(duì)白酒風(fēng)味物質(zhì)的研究主要傾向于低沸點(diǎn)物質(zhì)，而環(huán)二肽都屬于高沸點(diǎn)物質(zhì)，其熔點(diǎn)多數(shù)高于200℃；同時(shí)也為釀酒廢棄物的綜合利用提供更廣闊的前景。

[1]盧曦元,徐德昌.環(huán)二肽生物活性的研究進(jìn)展[J].生物信息學(xué),2011(1)：289-291.

[2]李德海,顧謙群,朱偉明,等.海洋放線菌11014中抗腫瘤活性成分的研究I.環(huán)二肽[J].中國抗生素雜志,2005 (8)：449-452.

Cyclic Dipeptide Compounds in Baijiu

DENG Xialing,LIAN Shuncai,XIE Zhengmin,LIAO Qinjian,YE Huaxia and ZHANG Qian
(Wuliangye Co.Ltd.,Yibin,Sichuan 644007,China)

In this study,13 kinds of cyclic dipeptide compounds were detected in Baijiu samples by HPLC-QTOF.They were identified as cyclic alanine-proline,cyclic diaminobutyric acid,cyclic lencine-alanine,cyclic isoleucine-valine,cyclic threonine-proline,cyclic proline-phenylalanine,cyclic phenylalanine-alanine,cyclic leucine-isoleucine,cyclic valine-valine,cyclic tyrosine-proline,cyclic phenylalanine-valine,cyclic proline-leucine,and cyclic diphenyl alanine.Among them,cyclic leucine-alanine,cyclic proline-phenylalanine,cyclic phenylalanine-phenylalanine,cyclic tyrosine-proline,and cyclic proline-leucine had multiple physiological activities.

Baijiu;cyclic dipeptide;HPLC-QTOF

TS262.3；TS261.7

A

1001-9286（2017）09-0027-06

10.13746/j.njkj.2017158

2017-06-06

鄧霞玲，女，四川宜賓人，高級(jí)工程師，四川省白酒評(píng)委，金三角白酒評(píng)委，主要從事酒體設(shè)計(jì)、嘗評(píng)勾兌及酒體分析工作。

練順才，女，四川宜賓人，教授級(jí)高工，主要從事酒類技術(shù)研究工作，發(fā)表論文數(shù)篇。

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2017-07-21；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170721.1038.003.html。