蛋白酶體抑制劑MG132對(duì)大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的干預(yù)機(jī)制①

寧麗常 蹇孝麗 岳 萍 蔣紅梅

(貴州醫(yī)科大學(xué)臨床微生物和免疫教研室 ，貴陽550004)

·臨床免疫學(xué)·

蛋白酶體抑制劑MG132對(duì)大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的干預(yù)機(jī)制①

寧麗常 蹇孝麗②岳 萍③蔣紅梅

(貴州醫(yī)科大學(xué)臨床微生物和免疫教研室 ，貴陽550004)

目的：探討蛋白酶體抑制劑MG132對(duì)大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(Collagen induced arthritis，CIA)的干預(yù)效果及作用機(jī)制。方法：48只雌性SD大鼠被隨機(jī)分為空白對(duì)照組、CIA模型組、MG132干預(yù)模型組，每組16只CIA模型組和MG132干預(yù)模型組注射牛Ⅱ型膠原建立CIA模型大鼠，初次免疫后第21天，干預(yù)組大鼠以1 mg/kg的劑量每天1次，連續(xù)14天皮下注射MG132。建模起每周觀察大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度，計(jì)算關(guān)節(jié)炎指數(shù)(Arthritis index，AI)，第42天后稱重并處死大鼠；HE染色觀察關(guān)節(jié)滑膜組織的病理改變；熒光底物測定法檢測滑膜組織20S蛋白酶體的活性；蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κB/p65、IκBα蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：與CIA模型組比較，MG132干預(yù)模型組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)在注射MG132后一周明顯降低(P<0.05)，關(guān)節(jié)滑膜組織未見明顯增生，只伴有少量炎性細(xì)胞浸潤。與空白對(duì)照組大鼠比較，CIA模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織20S蛋白酶體活性增高；與CIA模型組大鼠比較，MG132皮下注射干預(yù)后關(guān)節(jié)滑膜組織20S蛋白酶體活性降低(P<0.05)。與空白對(duì)照組比較，CIA模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織高表達(dá)NF-κB/p65蛋白，其中胞核NF-κB/p65表達(dá)增高更為明顯(P<0.01)，注射蛋白酶體抑制劑MG132干預(yù)后，其滑膜組織胞漿及胞核NF-κB/p65蛋白表達(dá)均顯著減少(P<0.01)。與空白對(duì)照組比較，CIA模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜低表達(dá)IκBα蛋白(P<0.01)，注射MG132干預(yù)后關(guān)節(jié)滑膜IκBα蛋白表達(dá)顯著增多(P<0.01)。結(jié)論：大鼠CIA體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，蛋白酶體抑制劑MG132經(jīng)皮下注射可明顯改善大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀，其作用機(jī)制可能與MG132降低大鼠CIA關(guān)節(jié)滑膜組織20S蛋白酶體活性，減少其底物蛋白IκBα的表達(dá)，從而抑制NF-κB活性有關(guān)。

膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎;蛋白酶體抑制劑MG132;20S蛋白酶體;NF-κB;IκBα蛋白

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種由多種細(xì)胞因子參與的、以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主要特征的全身性自身免疫性疾病。主要表現(xiàn)為對(duì)稱性的多個(gè)小關(guān)節(jié)僵硬、疼痛和腫脹，隨著病情的發(fā)展后期常?？赡軐?dǎo)致關(guān)節(jié)畸形以及活動(dòng)功能受限[1,2]。雖然近年來在細(xì)胞和分子水平上關(guān)于RA的機(jī)制研究已經(jīng)取得了一些成果，但其確切病因仍未完全明確，目前仍未找到治療RA的理想藥物。因此，繼續(xù)研究RA的發(fā)病機(jī)制并且尋找有效的治療藥物有著重要的意義。

泛素-蛋白酶體途徑(Ubiquitin proteasome pathway，UPP)是生物體內(nèi)蛋白質(zhì)選擇性降解的重要途徑之一。而起催化核心作用的20S蛋白酶體是UPP的重要組成部分，目前針對(duì)UPP的抑制劑主要是通過選擇性地抑制20S蛋白酶體的活性來發(fā)揮作用[3,4]。同時(shí)，蛋白酶體抑制劑可抑制IκB蛋白的降解從而抑制NF-κB的活性，這是近年來免疫、炎癥等研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[5]。在炎癥及自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中，NF-κB作為主要調(diào)控多種免疫和炎癥基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子起著重要的作用[6,7]。以NF-κB作為靶點(diǎn)，通過對(duì)NF-κB通路激活的抑制，有望成為RA治療的一條新途徑。NF-κB的激活可以通過UPP來調(diào)節(jié)[8,9]。蛋白酶體抑制劑可抑制蛋白酶體的活性使IκB穩(wěn)定，從而抑制NF-κB的活性，減少NF-κB通路參與的炎癥因子的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)用蛋白酶體抑制劑MG132皮下注射干預(yù)大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)(Collagen induced arthritis,CIA)，觀察其對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)、關(guān)節(jié)滑膜組織病理形態(tài)、滑膜組織20S蛋白酶體活性及NF-κB/p65、IκBα蛋白表達(dá)的影響，探討蛋白酶體抑制劑MG132對(duì)大鼠CIA的干預(yù)效果及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性SD大鼠，清潔級(jí)，體重(180±20.13)g，購自重慶動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(渝)2012-0005。動(dòng)物房使用許可證號(hào)：SYXK(黔)：2002-0001。動(dòng)物飼料使用許可號(hào)：SCXK(渝)2007-0006。

1.1.2主要試劑及儀器 MG132 批號(hào)S2619 (Selleck)、牛Ⅱ型膠原(Bovine Collagen Type Ⅱ，BⅡC)批號(hào)C7806、弗氏完全佐劑(FCA)批號(hào)F5881(Sigma)、Western blot一抗：兔源NF-κB/p65單克隆抗體 批號(hào)8242p (CST)、兔源IκBα單克隆抗體 批號(hào)ab32518 (Abcam)，內(nèi)參：鼠源GAPDH單克隆抗體 批號(hào)60004-1-Ig、鼠源LaminB1單克隆抗體 批號(hào)66095-1-Ig (武漢三鷹)，二抗：辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG 批號(hào)BS13278、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 批號(hào)BS12478 (南京巴傲得生物科技有限公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒 批號(hào)PC0020-20140919(北京索萊寶科技有限公司)、蛋白酶體活性檢測試劑盒 批號(hào)APT280-2648190(德國 millipore公司)、20S蛋白酶體檢測試劑盒 批號(hào)CSB-EQ027420HU (武漢華美生物工程有限公司)、ELX800酶標(biāo)儀(美國 Bio-tek公司)等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 雌性SD大鼠48只，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后被隨機(jī)分為空白對(duì)照組、CIA模型組、MG132干預(yù)模型組三組，每組16只。按組分籠飼養(yǎng)，室溫15～25℃，自然采光，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2.2CIA大鼠模型的復(fù)制 牛Ⅱ型膠原(BⅡC)10 mg溶于5 ml配制好的0.1 mol/L的醋酸溶液中，在冰浴中攪拌使之充分溶解，配制成濃度為2 mg/ml的膠原溶液，置于4℃冰箱過夜。次日再將弗氏完全佐劑(Freund′s complete adjuvant，CFA)與配制好的膠原溶液按照1∶1等體積混合，在冰浴中充分乳化，乳化完全的標(biāo)準(zhǔn)為將乳劑滴入清水中不擴(kuò)散，乳化完全后的膠原乳劑濃度為1 mg/ml，置于4°C冰箱備用。參照文獻(xiàn)[10]來復(fù)制CIA大鼠模型，CIA模型組和MG132干預(yù)模型組大鼠在其左后足跖部皮內(nèi)多點(diǎn)注射乳化完全的膠原乳劑，每只注射200 μl，初次注射后第14天在尾根部皮下多點(diǎn)注射相同劑量的膠原乳劑以加強(qiáng)免疫，復(fù)制膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，空白對(duì)照組同方法注射同劑量的生理鹽水。

1.2.3蛋白酶體抑制劑MG132干預(yù) 粉末狀的MG132溶解在二甲亞砜(DMSO)中，配制成5 mg/ml的濃度然后放在-20℃冰箱備用。在初次注射膠原乳劑建模后第21天，MG132干預(yù)模型組和單純MG132對(duì)照組大鼠用微量注射器以1 mg/kg的量皮下注射MG132，每天1次，連續(xù)注射14 d[11]。用同樣方法空白對(duì)照組和CIA模型組大鼠注射相同劑量的溶劑DMSO，三組在初次免疫后第42天即注射完MG132后一周處死大鼠。

1.2.4關(guān)節(jié)炎指數(shù) 按5級(jí)評(píng)分法評(píng)價(jià)大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)(Arthritis index，AI)[12]，計(jì)算各組大鼠初次免疫第7、14、21、28、35、42天關(guān)節(jié)炎指數(shù)，并記錄。

1.2.5關(guān)節(jié)滑膜組織病理觀察 用10%的中性福爾馬林將關(guān)節(jié)滑膜組織固定24 h，制石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增生情況及炎癥細(xì)胞浸潤等情況。

1.2.6大鼠滑膜組織20S蛋白酶體活性檢測 96孔板每孔加入30 μg蛋白樣品、10 μl蛋白酶體亞基(Suc-LLVY-AMC)、10 μl的10×buffer(包括250 mmol/L HEPES，pH7.5，5 mmol/L EDTA，0.5% NP-40，0.01% SDS)，再用去離子水補(bǔ)足體積至100 μl，空白對(duì)照孔不加蛋白樣品，其他成分同樣品孔，充分振蕩混勻。60℃孵育1 h，采用多功能酶標(biāo)儀測定反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長：380 nm，發(fā)射波長：460 nm)。該組蛋白酶體的活性用每組測得的熒光強(qiáng)度值減去空白對(duì)照孔的值表示。

1.2.7Western blot法檢測大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κB/p65、IκBα蛋白的表達(dá)情況 按試劑盒說明書對(duì)滑膜組織核蛋白和漿蛋白的提??；用BCA蛋白定量法測核蛋白和漿蛋白的濃度，SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、 一抗孵育、 二抗孵育和 ECL發(fā)光顯色。采用凝膠成像系統(tǒng)成像，圖像分析軟件進(jìn)行分析，以各組目的條帶灰度值與相應(yīng)內(nèi)參灰度值的比值進(jìn)行半定量分析。

圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)變化Fig.1 Comparisons of arthritis indexes(AI)of rats in every group

2 結(jié)果

2.1MG132干預(yù)后大鼠一般情況變化 空白對(duì)照組大鼠生長良好，飲食正常，活動(dòng)自如，反應(yīng)靈敏度CIA模型組大鼠從造模后第7天開始，被注射足開始出現(xiàn)明顯紅腫，并慢慢累及趾間關(guān)節(jié)、跖間關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)等，在第14天進(jìn)行加強(qiáng)免疫后，對(duì)側(cè)足開始由跖趾關(guān)節(jié)至踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)不同程度的腫脹。第21天左右達(dá)高峰，關(guān)節(jié)紅腫逐漸加重，甚至出現(xiàn)踝關(guān)節(jié)及四肢關(guān)節(jié)紅腫，行動(dòng)遲緩、跛行，并緩慢出現(xiàn)關(guān)節(jié)強(qiáng)直、畸形以至活動(dòng)障礙。MG132干預(yù)模型組大鼠在造模第21天出現(xiàn)明顯關(guān)節(jié)炎癥狀后皮下注射蛋白酶體抑制劑MG132，兩周后被注射足及對(duì)側(cè)足的紅腫程度有所減輕，且少有關(guān)節(jié)功能障礙和關(guān)節(jié)畸形，大鼠行動(dòng)較靈活。

2.2大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)變化 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)見圖1、表1。與空白對(duì)照組在同一時(shí)間點(diǎn)比較，CIA模型組和MG132干預(yù)模型組大鼠在初次免疫第7天后關(guān)節(jié)炎指數(shù)開始升高，并在第21天達(dá)到最高(P<0.05)。在連續(xù)注射MG132干預(yù)14 d后一周即建模第42天與模型組同一時(shí)間點(diǎn)比較，在初次免疫第22天開始皮下注射MG132對(duì)CIA大鼠進(jìn)行干預(yù)，大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)有所下降(P<0.05)。

Groupsn20SproteasomeactivityBlankcontrolgroupSixteen2692.94±260.62CIAmodelgroupSixteen3735.31±412.111)MG132interventionCIAmodelgroupSixteen2995.06±262.811)2)

Note：The 20S proteasome activity was expressed by the fluorescence intensity of each experimental group minus the experimental blank hole fluorescence intensity.Compared with the blank control group 1)P<0.05,Compared with CIA model group 2)P<0.05.

GroupsnSeventhdaysFourteenthdaysTwenty-firstdaysTwenty-eighthdaysThirty-fifthdaysForty-seconddaysBlankcontrolgroupSixteen000000CIAmodelgroupSixteen2.44±0.511)6.13±0.891)11.00±0.891)10.31±1.301)10.19±1.471)9.44±1.211)MG132interventionCIAmodelgroupSixteen2.50±0.521)5.94±1.071)10.69±1.301)9.38±1.091)9.06±1.121)7.88±1.461)2)

Note：Compared with the blank control group at the same time,1)P<0.05;compared with the CIA model group at the same time，2)P<0.05.

GroupsnCytosolicNF-kappaB/p65NuclearNF-kappaB/p65CytosolicIkappaBalphaBlankcontrolgroupSixteen1.01±0.010.12±0.010.73±0.06CIAmodelgroupSixteen1.75±0.021)1.09±0.041)0.57±0.061)MG132interventionCIAmodelgroupSixteen1.23±0.041)2)0.68±0.021)2)0.71±0.012)

Note：the data in the table is the gray value analysis by image J software,In each band gray value ratio and the corresponding reference gray value representation.Compared with the blank control group，1)P<0.01；compared with CIA model group，2)P<0.01.

圖2 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織病理(HE染色，×400)Fig.2 Histological characteristics of synovial tissue in rats(HE staining,×400)Note:A.Blank control group；B.CIA model group；C.MG132 intervention CIA model group.

2.3大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織病理形態(tài)觀察 空白對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織由1～3層滑膜細(xì)胞及滑膜下層組成，滑膜細(xì)胞排列規(guī)則，未見炎性細(xì)胞浸潤(圖2A)。CIA模型對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織明顯增厚，滑膜細(xì)胞明顯增生，并見大量炎性細(xì)胞浸潤(圖2B)。MG132干預(yù)模型組大鼠滑膜組織細(xì)胞輕度增生，伴有少量炎性細(xì)胞浸潤(圖2C)。

2.4大鼠滑膜組織20S蛋白酶體活性 如表2結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，CIA模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織20S蛋白酶體活性明顯增強(qiáng)(P<0.05)。通過皮下注射MG132干預(yù)后，其關(guān)節(jié)滑膜組織20S蛋白酶體活性明顯下降，與CIA模型組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5Western blot法檢測大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κB/p65、IκBα蛋白的表達(dá)情況 如表3、圖3結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，CIA模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織胞漿及胞核NF-κB/p65蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著增多(P<0.01)，而胞漿IκBα蛋白相對(duì)表達(dá)量減少(P<0.05)。相對(duì)于CIA模型組，在其皮下注射MG132干預(yù)后其滑膜組織胞漿及胞核NF-κB/p65蛋白的相對(duì)表達(dá)量均明顯減少，而胞漿IκBα蛋白相對(duì)表達(dá)量則明顯增多，與CIA模型組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖3 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κB/p65、IκBα蛋白的表達(dá)情況Fig.3 Protein expression of NF-κB/p65,IκBα in synovial tissue of ratsNote:1.Blank control group；2.CIA model group；3.MG132-intervention CIA model group.

3 討論

RA是一種常見的、與遺傳相關(guān)并有多種因素參與的自身免疫性疾病，其主要原因在于免疫調(diào)節(jié)因素如免疫耐受的失衡。目前對(duì)RA的治療主要依賴于改善病情抗風(fēng)濕藥(DMARDs)，包括甲氨蝶呤、糖皮質(zhì)激素和生物制劑的早期積極治療。一般單用DMARDs會(huì)限制其長期療效，這可能是因?yàn)槎嗨幠退幍慕Y(jié)果。因此，在RA治療上，很有必要繼續(xù)研究新型藥物及其作用機(jī)制[1]。

本實(shí)驗(yàn)皮下注射蛋白酶體抑制劑MG132來干預(yù)CIA大鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，皮下注射MG132干預(yù)CIA大鼠后大鼠關(guān)節(jié)腫脹及功能障礙明顯減輕，關(guān)節(jié)炎指數(shù)亦顯著降低，炎癥癥狀明顯緩解。同時(shí)關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)顯示滑膜增生明顯減少，只伴有少量的炎性細(xì)胞浸潤，結(jié)果提示皮下注射蛋白酶體抑制劑MG132對(duì)CIA大鼠的炎癥癥狀能有效改善，并對(duì)疾病的進(jìn)一步發(fā)展能有效緩解。

UPP是細(xì)胞內(nèi)ATP依賴的蛋白質(zhì)選擇性降解的主要途徑，是真核細(xì)胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)調(diào)控系統(tǒng)，參與細(xì)胞凋亡、MHCⅠ 類抗原的遞呈、細(xì)胞周期以及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生理過程，對(duì)維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)具有十分重要的意義[13]。UPP中具有蛋白酶催化活性的核心部分是20S蛋白酶體[14]。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮肌炎和多發(fā)性硬化癥患者的血清中檢測到抗蛋白酶體的自身抗體存在[15-17]。本實(shí)驗(yàn)檢測了CIA大鼠滑膜組織20S蛋白酶體活性，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，CIA模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中20S蛋白酶體活性顯著升高，提示在CIA大鼠的關(guān)節(jié)滑膜組織中UPP存在異常。而當(dāng)皮下注射蛋白酶體抑制劑MG132后，CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中20S蛋白酶體活性顯著下降。

大量研究結(jié)果表明，NF-κB信號(hào)通路是炎癥反應(yīng)調(diào)控機(jī)制的中心環(huán)節(jié)，NF-κB在許多免疫和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)中起重要作用[18]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，UPP與細(xì)胞炎癥反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子NF-κB的激活、失活等密切相關(guān)，是免疫細(xì)胞炎癥反應(yīng)機(jī)制研究中的熱點(diǎn)[8,9]。本實(shí)驗(yàn)顯示，體內(nèi)皮下注射蛋白酶體抑制劑MG132干預(yù)CIA模型大鼠效果良好，為了進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，我們檢測了炎癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB/p65及其抑制蛋白IκBα在滑膜組織中的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組大鼠比較，CIA模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織高表達(dá)NF-κB/p65蛋白，其中以胞核的NF-κB/p65蛋白表達(dá)增高更加顯著；當(dāng)用MG132干預(yù)CIA模型大鼠后，與CIA模型組相比，大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織胞漿及胞核的NF-κB/p65蛋白表達(dá)量均顯著降低。相對(duì)于空白對(duì)照組，IκBα蛋白在CIA模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中的表達(dá)減少，當(dāng)用MG132干預(yù)后其表達(dá)量又顯著增多。蛋白酶體抑制劑可以通過抑制蛋白酶體的活性來穩(wěn)定IκB，阻止NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，從而抑制NF-κB的活性，減少NF-κB通路參與的炎癥因子表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)用蛋白酶體抑制劑MG132干預(yù)CIA模型大鼠后大鼠關(guān)節(jié)的炎癥癥狀明顯減輕，關(guān)節(jié)滑膜病理顯示滑膜輕度增生，通過進(jìn)一步探討其干預(yù)機(jī)制發(fā)現(xiàn)MG132可能主要是通過降低關(guān)節(jié)滑膜組織20S蛋白酶體活性使IκB蛋白降解減少而阻止NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，從而抑制NF-κB的活性使得炎癥癥狀有所減輕。綜上所述，本研究應(yīng)用蛋白酶體抑制劑對(duì)SD大鼠實(shí)驗(yàn)性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(CIA)進(jìn)行干預(yù)，顯示了有意義的治療效果，其臨床應(yīng)用價(jià)值值得進(jìn)一步探討。

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[收稿2017-04-06 修回2017-05-03]

(編輯 許四平 劉格格)

InterventioneffectofproteasomeinhibitorMG132inratswithcollagen-inducedarthritis

NINGLi-Chang,JIANXiao-Li,YUEPing,JIANGHong-Mei.

DepartmentofClinicalMicrobiologyandImmunology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China

Objective:To explore the intervention effect of proteasome inhibitor MG132 in rats with collagen-induced arthritis(CIA),which resembles human rheumatoid arthritis(RA).Methods:Forty-eight female SD rats were randomly divided into three groups,including blank control group,CIA model group and MG132-treated group.There were sixteen rats in each group.Rats in CIA model group and MG132-treated model group were injected with type Ⅱ collagen to established CIA rats.21 days after the initial immunization,the rats in the MG132-treated model group were injected subcutaneously with 1 mg/kg MG132 once daily for 2 weeks.42 days after the initial immunization,the change of paw-swelling and the arthritis scores were determined.The synovial pathology examination was performed with HE staining.The 20S proteasome activity in synovial tissue was measured by fluorescence substrate assay.The expression of NF-κB/p65,IκBα in synovial tissue were analyzed by Western blot.Results:Proteasome inhibitor MG132 significantly attenuated the severity of arthritis and histopathological changes in CIA rats.Compared with the blank control group,the 20S proteasome activity was increased significantly in the CIA model group(P<0.05),and decreased after injection of MG132.Compared with CIA rats,the expression of NF-κB/p65 significantly decreased in rats treated with MG132(P<0.01).Compared with the blank control group,the expression of IκBα protein decreased in CIA model group.After injected with MG132,the protein was significantly increased(P<0.01).Conclusion:The proteasome inhibitor MG132 may attenuates the severity of arthritis and histopathological changes in CIA rats.These effects may be mediated through the inhibition of NF-κB activity.

Collagen induced arthritis;Proteasome inhibitor MG132;20S proteasome;NF-κB;IκBα protein

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.018

①本文為國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81660361)和貴陽市科技局貴州醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合資金國家自然科學(xué)基金培育項(xiàng)目(No.GY2015-38)資助。

寧麗常(1992年-)，女，在讀碩士，主要從事自身免疫性疾病研究，E-mail:1273754337@qq.com。

及指導(dǎo)教師：蔣紅梅(1973年-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事自身免疫性疾病研究，E-mail：646117948@qq.com。

R593.22

A

1000-484X(2017)09-1361-05

②貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,貴陽550004。

③貴州醫(yī)科大學(xué)物理教研室,貴陽550004。