5-烯去甲斑蝥酸喜樹堿20-位酯衍生物的合成及其抗腫瘤活性研究

趙長闊，王先恒,2，高 磊，楊福紅，保玉嬌，李 嬋

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院臨床藥學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

5-烯去甲斑蝥酸喜樹堿20-位酯衍生物的合成及其抗腫瘤活性研究

趙長闊1，王先恒1,2，高 磊1，楊福紅1，保玉嬌1，李 嬋1

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院臨床藥學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

目的為增強(qiáng)喜樹堿的抗腫瘤活性，設(shè)計并合成型5-烯去甲斑蝥酸喜樹堿20-位酯衍生物。方法順丁烯二酸酐與呋喃在乙醚中通過[4+2]環(huán)加成反應(yīng)得到5-烯去甲斑蝥素1，1醇解得到5-烯去甲斑蝥素單酸甲酯的側(cè)鏈2；側(cè)鏈2與喜樹堿在耦合劑及有機(jī)堿催化劑存在下，酯化得到5-烯去甲斑蝥酸喜樹堿20-位酯衍生物3；采用CCK-8法考察了3對4種腫瘤細(xì)胞株的體外抑制活性。結(jié)果5-烯去甲斑蝥酸喜樹堿20-位酯衍生物3通過喜樹堿和5-烯去甲斑蝥素單酸甲酯偶聯(lián)合成，收率達(dá)89%，其對于胃癌BGC803和胰腺癌PANC-1細(xì)胞的抑制率高達(dá)70%，活性與斑蝥素及喜樹堿2個陽性對照藥品相當(dāng)，而對于肝癌HepG2和結(jié)腸癌SW480的抑制率分別為67%和55%。結(jié)論5-烯去甲斑蝥酸喜樹堿20-位酯衍生物3對測試4種腫瘤細(xì)胞具有較好的抑制活性。

喜樹堿；5-烯去甲斑蝥酸；合成；CCK-8法；抗腫瘤活性

喜樹是我國特有物種，屬于藍(lán)果樹科喜樹屬植物，主要分布于長江流域以及西南各省區(qū)[1]。貴州是喜樹的主產(chǎn)區(qū)之一，在全省各縣均有分布，包括野生及人工栽培[2]。喜樹堿(Camptothecin，CPT)是一種存在于喜樹葉子、果實，具有良好抗癌活性，較為廣泛的天然產(chǎn)物，對于胃腸道和頭頸部腫瘤等有較好療效，最早由美國化學(xué)家Wall等[3]從喜樹中提取得到；喜樹堿的抗腫瘤機(jī)制在于其可以特異性地作用于拓?fù)洚悩?gòu)酶I(Topo I)[4]。

喜樹堿為淡黃色針狀晶體固體，熔點為264～267 ℃。喜樹堿不溶于水，難溶于一般溶劑，可溶于氯仿、乙醇、乙酸、乙酸乙酯；其化學(xué)性質(zhì)也不同于一般生物堿，無明顯堿性，大致呈中性。喜樹堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)包含了一個駢列五員環(huán)；ABCD環(huán)是巨大的共軛體系，整體為平面結(jié)構(gòu)(見圖1)。

圖1 喜樹堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)

為提高喜樹堿的水溶性、增強(qiáng)抗癌活性以及降低毒副作用，近30年來藥物學(xué)家掀起了喜樹堿化學(xué)修飾的熱潮。喜樹堿E環(huán)的內(nèi)酯結(jié)構(gòu)是保留其抗腫瘤活性的必要基團(tuán)，對其結(jié)構(gòu)改造主要涉及CPT結(jié)構(gòu)中的7、9、10及20位[5-8]。研究表明，喜樹堿20位羥基修飾為酯，可阻止其與內(nèi)酯環(huán)羰基形成分子內(nèi)氫鍵，從而穩(wěn)定該內(nèi)酯環(huán)，增強(qiáng)其抗腫瘤活性，例如，部分20(S)-喜樹堿肉桂酸酯衍生物對胃癌SGC-7901[9]，以及20(S)-O-取代苯甲酸-7-乙基喜樹堿酯類化合物對肺癌LLC-E9FP、肺腺癌95D、胃癌BGC-803、胃癌HGC-27和肝癌7721顯示較強(qiáng)的抑制活性[10]。斑蝥素及其衍生物已被證明具有良好的抗腫瘤活性[11-12]，去甲斑蝥素是一種人工合成的抗腫瘤小分子藥物，臨床用于肝癌、食管癌、胃癌和賁門癌等及白細(xì)胞低下癥、肝炎等。黃丹儀等[13]報道將斑蝥酸鈉和喜樹堿聯(lián)合用藥增強(qiáng)對肺癌細(xì)胞A549和肝癌細(xì)胞Hep3B的體外抑制作用，二者表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。

喜樹堿20位羥基形成酯后可穩(wěn)定E內(nèi)酯環(huán)，而喜樹堿和斑蝥素兩種抗腫瘤藥物聯(lián)用的體外協(xié)同作用已被證實。因此本研究將本實驗室制備得到的去甲斑蝥素酸衍生物5-烯去甲斑蝥素單酸甲酯與喜樹堿通過20位酯鍵連接得到的新型喜樹堿20-位酯衍生物；并初步檢測新型喜樹堿20-位酯衍生物對肝癌HepG2、結(jié)腸癌SW480、胃癌BGC803和胰腺癌PANC-1 4種腫瘤細(xì)胞的體外抑制活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 20(S)-喜樹堿(X=98%,四川成都瑞芬思生物科技有限公司)，順丁烯二酸酐、呋喃、EDCI、DMAP (分析純，國藥集團(tuán))；石油醚、乙醚、 氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃(分析純，重慶川東化工)；NaOH、Na2CO3(分析純，上?；瘜W(xué)試劑廠)；層析用硅膠( 粒度200～300目,青島海洋化工廠)；人肝癌細(xì)胞HepG2、人結(jié)腸癌SW480、人胰腺癌PANC-1和人胃癌BGC-803細(xì)胞以及EnoGeneCellTMCounting Kit-8 (CCK-8)細(xì)胞活力檢測試劑盒(南京恩晶生物科技有限公司)；蒸餾水(自制)。

81-2型暗箱三用紫外分析儀(上海司樂儀器有限公司)；Varian 400MHz核磁共振波譜儀(TMS作內(nèi)標(biāo)，安捷倫科技有限公司)；傅里葉紅外變換光譜儀(美國Nicolet公司；KBr壓片)；LC-10ATVP 型高效液相色譜儀(日本島津公司)；Thermo MK3酶標(biāo)儀(美國熱電公司)。

1.2 方法

1.2.1 喜樹堿20-位酯衍生物3的合成 順丁烯二酸酐與呋喃在乙醚反應(yīng)通[4+2]環(huán)加成反應(yīng)得到5-烯去甲斑蝥素1，1溶解于甲醇中，并在三乙胺催化作用下，醇解得到5-烯去甲斑蝥素單酸甲酯的側(cè)鏈2，側(cè)鏈2與喜樹堿在耦合劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽EDCI及有機(jī)堿催化劑4-二甲氨基吡啶DMAP作用下，酯化反應(yīng)得到喜樹堿20-位酯衍生物3。

1.2.2 側(cè)鏈5-烯去甲斑蝥素單酸甲酯2的制備[14]

1.2.2.1 5-烯去甲斑蝥素1的制備 將順丁烯二酸酐置于干燥研缽中研細(xì)后，稱取12.02 g，置于干燥的三口燒瓶中，室溫下加90 mL乙醚攪拌至順丁烯二酸酐完全溶解。緩慢滴加13 mL呋喃，滴加完畢后緩慢升溫至38 ℃，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1 h，溶液開始出現(xiàn)白色固體，且白色固體隨反應(yīng)時間增多。反應(yīng)至24 h后抽濾，得5-烯去甲斑蝥素1。

1.2.2.2 5-烯去甲斑蝥素單酸甲酯2的制備 將4.15 g 5-烯去甲斑蝥素1懸浮于25 mL甲醇中，向懸浮液中緩慢滴加三乙胺 (0.73 mL,0.51 g)，室溫下攪拌24 h，減壓旋蒸除去甲醇，得到目標(biāo)產(chǎn)物2的粗產(chǎn)品。將粗產(chǎn)品溶于25 mL二氯甲烷，依次用1 mol/L鹽酸水溶液7 mL，飽和食鹽水10 mL洗滌后，加入適量無水MgSO4至有機(jī)相干燥15～30 min，抽濾，濾餅用少量二氯甲烷沖洗2～3次，合并濾液，減壓旋蒸去除溶劑后得5-烯去甲斑蝥素單酸甲酯2。

圖2 喜樹堿20-位酯衍生物3的合成

1.2.2.3 喜樹堿5-烯去甲斑蝥酸酯衍生物3的制備 喜樹堿1.2 g (3.48 mmol)溶于20 mL氯仿中，依次加人5-烯去甲斑蝥素單酸甲酯2(1.38 g，7 mmol)，3.2 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽EDCI(16.8 mmol)和240 mg 4-二甲氨基吡啶DMAP(2.44 mmol)。室溫下攪拌反應(yīng)10 h，TLC薄層板跟蹤監(jiān)測，展開劑(CH2Cl2:CH3OH=97∶3)，在紫外燈254 nm下觀察，反應(yīng)底物喜樹堿消失。停止反應(yīng)，加入30 mL氯仿，依次用蒸餾水、Na2CO3飽和溶液、飽和食鹽水洗滌，有機(jī)相用無水MgSO4干燥，減壓旋蒸去除溶劑后的殘留物粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠柱層析純化后得20(S)-喜樹堿5-烯去甲斑蝥酸酯衍生物3。

1.2.3 CCK-8染色法檢測體外腫瘤細(xì)胞抑制活性 取活細(xì)胞比例達(dá)90%以上的細(xì)胞進(jìn)行實驗。細(xì)胞增殖抑制試驗采用EnoGeneCellTMCounting Kit-8 (CCK-8)細(xì)胞活力檢測試劑盒。細(xì)胞消化、計數(shù)、制成濃度為1×105個/mL的細(xì)胞懸液，96孔板中每孔加入100 μL細(xì)胞懸液(每孔1×104個細(xì)胞)；96孔板置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；每孔加入100 μL相應(yīng)的含藥物培養(yǎng)基，作用濃度為50 μmol/L，同時設(shè)立陰性對照組、溶媒對照組、陽性對照組，每組5復(fù)孔；96孔板置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后；每孔加入10 μL CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的OD值，計算各個化合物對人肝癌細(xì)胞HepG2、人結(jié)腸癌SW480、人胰腺癌PANC-1和人胃癌BGC-803細(xì)胞的抑制率。

T代表待測樣品組、C代表生理鹽水對照組和T0代表空白對照組。

2 結(jié)果

2.1 化合物結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 5-烯去甲斑蝥素1白色固體(17.46 g，86%)，熔點：122～123 ℃，Rf：0.52(石油醚/乙酸乙酯=3/1)；1H-NMR(400-MHZ,CDCl3) ：δ 3.18(s，2H)，5.47(s，2H)，6.58(s，2H)。

2.1.2 5-烯去甲斑蝥素單酸甲酯2白色固體(4.50 g,91%)。1H-NMR(400-MHZ,DMSO-d6)：δ 12.45(br,1H),6.41-6.45(m,2H),5.06(s,2H),3.64(s,3H),2.71(s,2H)。

2.1.3 喜樹堿5-烯去甲斑蝥酸酯衍生物3黃色固體(1.62 g,89%)。Rf=0.50(CH2Cl2:CH3OH=97∶3)；1H-NMR(400-MHz,CDCl3)：δ 8.41 (s,1H),8.22(d,J=8 Hz,1H),7.96(t,J=20Hz,1H)，7.84(t,J=8Hz,1H),7.68(t,J=8Hz,1H),7.24(d,J=2Hz,1H),5.70(d,J=16Hz,1H)，5.42(d,J=16Hz,1H),5.29(s,2H),4.26 (q,J=16Hz,2H),2,91(d,J=28Hz,2H),2.22(m,2H),1.72(s,4H),7.24(s,1H),0.99(t,J=8Hz,3H)。13C-NMR(100-MHz,CDCl3):161.01,162.05,147.02,143.68,141.34,139.66,126.01,125.51,124.44,123.22,123.01,122.99,122.90,115.25,90.43,62.03,44.77,35.23,26.65,24.47。IR(KBr,cm-1)：λ 3 467.2(s),3 420.2(s),3 244.4(m),2 930.1(s),2 348.2(w),2 107.3(w),1 731.0(m),1 26.2(s),1 399.9(s),1 303.1(w),1 147.1(w),1 085.8(w),1 303.1(w),612.1(m)。

2.2 喜樹堿5-烯去甲斑蝥酸酯衍生物3抗肝癌活性 以斑蝥素、喜樹堿為陽性對照藥物，測試了喜樹堿20-位酯衍生物3對人肝癌細(xì)胞HepG2等4種腫瘤細(xì)胞株的體外抑制活性；在濃度50 μmol/L時,化合物3對人肝癌細(xì)胞HepG2、人結(jié)腸癌SW480、人胰腺癌PANC-1和人胃癌BGC-803的抑制率，分別為67.44%、71.96%、55.51%和73.03%(見表 1)。

表1喜樹堿20-位酯衍生物3對4種體外腫瘤細(xì)胞株的抑制率(%)a

化合物HepG2SW480BGC803PANC-1溶媒對照b1.161.020.931.04斑蝥素78.0875.0475.3377.21喜樹堿74.1971.0473.9573.88喜樹堿20-位酯衍生物367.4455.5171.9673.03

a：樣品測試濃度為5 μmmol/mL；b：溶媒為DMSO。

3 討論

本文設(shè)計并合成得到了一類新型20(S)-喜樹堿5-烯去甲斑蝥酸酯衍生物3。合成涉及2個關(guān)鍵步驟，制備5-烯去甲斑蝥單酸甲酯的側(cè)鏈2，將此側(cè)鏈與喜樹堿通過20-位酯鍵連接得到目標(biāo)產(chǎn)物。各步反應(yīng)使用的原料價廉易得，制備簡單，可操作性強(qiáng)；單步收率分別為：86%、91%和89%，綜合收率在71%以上。綜合核磁共振氫譜、碳譜和紅外光譜對目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，結(jié)果與預(yù)期結(jié)構(gòu)相吻合，證實目標(biāo)化合物的成功制備。

對5-烯去甲斑蝥酸喜樹堿20-位酯衍生物3進(jìn)行了體外抗腫瘤活性測試，測試濃度為5 μmmol/mL，實驗表明衍生物3對于人胃癌細(xì)胞BGC803和人胰腺癌細(xì)胞PANC-1抑制率高達(dá)71.96%和73.03%，活性與斑蝥素及喜樹堿兩個陽性對照藥品相當(dāng)，而對于人肝癌細(xì)胞HepG2和人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的抑制活性略低于陽性對照。

初步體外腫瘤細(xì)胞抑制活性數(shù)據(jù)表明，設(shè)計得到的5-烯去甲斑蝥酸喜樹堿20-位酯衍生物3保留了喜樹堿以及斑蝥素類衍生物對腫瘤細(xì)胞的抑制活性，其對胃癌和胰腺癌細(xì)胞的高抑制率也顯示出該類化合物可作為潛在抗胃癌和胰腺癌的藥物候選者。后續(xù)擬喜樹堿及斑蝥素類衍生物的腫瘤抑制活性范圍中補(bǔ)充篩選更多的腫瘤細(xì)胞株的體外活性，諸如肺癌、肺腺癌、食管癌、賁門癌等；以及進(jìn)一步的小鼠體內(nèi)腫瘤抑制活性測試。

[1] 楊學(xué)義,朱立,孫超.喜樹資源及其開發(fā)利用[J].資源開發(fā)與市場,2007,23(7):618-619.

[2] 周濤,江維克,梅旋,等.貴州喜樹的分布特征及群落結(jié)構(gòu)[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(10):157-159.

[3] Wall M E,Wani M C,Cook C E,et al.Plant antitumor agentsⅠ.The isolation and structure of camptothecin，a novel alkaloidal leukemia and tumor inhibitor from camptotheca acuminate[J].J Am Chem Soc,1966,88(16):3888-3889.

[4] Hsiang Y H,Hertzberg R P,Hecht S,et al.Camptothecin induces protein-linked DNA breaksviamammalian DNA topoisomerase I[J].J Biol Chem,1985,260(27):14873-14878.

[5] 趙軍,許旋,羅一帆,等.具有抗癌活性的喜樹堿類化合物的構(gòu)效關(guān)系研究[J].中國藥物化學(xué)雜志,2003,13(2):27-32.

[6] 牟松,羅猛,祖元剛,等.喜樹堿及其衍生物結(jié)構(gòu)修飾及構(gòu)效關(guān)系的研究[J].中國藥學(xué)雜志,2006,41(11):804-806.

[7] 代魯平,宋春霞,邵先祥,等.抗癌藥物喜樹堿類衍生物的研究進(jìn)展[J].中國藥學(xué)雜志,2010,45(23):1813-1815.

[8] 劉丹,張龍,達(dá)飛,等.新型喜樹堿類抗癌藥物的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2016,16(5):990-992.

[9] 段華鑫,張殊佳,周鵬.20(S)-O-喜樹堿肉桂酸酯衍生物的合成及其抗腫瘤活性研究[J].有機(jī)化學(xué),2009,29(5):724-729.

[10]高鵬,朱磊,王佳樂,等.20(S)-O-取代苯甲酸-7-乙基喜樹堿酯類化合物的合成及其抗腫瘤活性[J].合成化學(xué),2012,20(2):137-142.

[11]周杰,吳敬波.斑蝥素及其衍生物抗腫瘤研究近況[J].西南軍醫(yī),2014,16(3):271-274.

[12]袁禮,鐘思雨,夏新華.斑蝥素的研究現(xiàn)狀[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報,2017,23(3):79-82.

[13]黃丹儀,吳轉(zhuǎn)斌,黃勤,等.斑蝥酸鈉與喜樹堿聯(lián)用抗腫瘤效果的實驗研究[J].中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報,2014,36(11):1519-1525.

[14]王先恒,趙長闊,賈佳,等.去甲斑蝥素單酸單酯衍生物及其抗腫瘤應(yīng)用[P].中國發(fā)明專利，2016：CN201610451738.9.

(編輯：譚秀榮)

Synthesis and antitumor activity of 5-ene-norcantharidin acid 20-camptothecin ester derivatives

Zhao Changkuo1,Wang Xianheng1,2,Gao Lei1,Yang Fuhong1,Bao Yujiao1,Li Chan1

(1.Department of Medicinal Chemistry,School of Pharmacy,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 2.Department of Clinical Pharmacy,School of Pharmacy,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

ObjectiveTo improve anticancer bioactivity of camptothecin,a new type of 5-ene-norcantharidin acid 20-camptothecin ester derivative was designed and synthesized.MethodsMaleic anhydride is cyclized with furan in ether through [4+2] cyclization addition to afford 5-ene-norcantharidin 1,which is methanolized to give 5-ene-norcantharidin monoacid monoester2.Camptothecin react with the side chain 2 to afford 5-ene-norcantharidin acid 20-camptothecin ester derivative3.Inhibition against four kinds of tumor cell lines was investigated through CCK-8 method.ResultsTarget compound3was successfully synthesized with a yield of 89%.Compared to the two positive controls-cantharidin and camptothecin,3showed good inhibition against BGC803 and PANC-1,and relative weaker inhibition against HepG2 and SW480.Conclusion5-ene-norcantharidin acid 20-camptothecin ester derivative3has been proved with a good inhibitory activity against four tumor cells tested.

camptothecin; 5-ene-norcantharidin acid; synthesis; CCK-8 method; antitumor activity

貴州省科技廳聯(lián)合基金資助項目(NO：黔科合LH字[2015]7531)；貴州省衛(wèi)生計劃委員會中醫(yī)藥管管理局項目(NO：QZYY-2014-027)。

王先恒，女，博士，副教授，研究方向:新藥設(shè)計與合成、臨床藥學(xué)研究，藥事管理學(xué)等，E-mail:wangxianheng01@163.com。

R914

A

1000-2715(2017)04-0374-04

[收稿2017-06-07;修回2017-07-11]