凍融PESA精子結(jié)合ICSI技術(shù)在治療梗阻性無(wú)精子癥中的應(yīng)用研究

葛 斌，楊智敏，王露娟，楊名慧

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 生殖中心，貴州 遵義 563099)

臨床醫(yī)學(xué)研究

凍融PESA精子結(jié)合ICSI技術(shù)在治療梗阻性無(wú)精子癥中的應(yīng)用研究

葛 斌，楊智敏，王露娟，楊名慧

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 生殖中心，貴州 遵義 563099)

目的凍融PESA精子結(jié)合ICSI技術(shù)在治療梗阻性無(wú)精子癥中的應(yīng)用研究。方法回顧性分析本生殖中心使用新鮮PESA精子、凍融PESA精子、新鮮體外射精精子行ICSI治療共193周期，比較受精、發(fā)育情況和臨床結(jié)局。結(jié)果3組ICSI治療后受精率分別為94.67%、93.50%、95.54%，3組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；正常卵裂率分別為：93.29%、91.89%、94.78%，3組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；優(yōu)質(zhì)胚胎率分別為：39.49%、37.07%、43.49%，3組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；妊娠率分別為：42.42%、37.84%、41.11%，3組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；流產(chǎn)率分別為：10.71%、7.14%、13.51%，3組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；結(jié)論凍融PESA精子能達(dá)到新鮮精子相似的臨床結(jié)果，安全有效。

精子冷凍；經(jīng)皮附睪抽吸精子；卵胞漿內(nèi)單精子注射

梗阻性無(wú)精子癥是指患者有生精功能，但是由于生精小管到射精管的排精通道堵塞，射精后精液中無(wú)法檢測(cè)出精子的一種男性不育疾病，占男性不育癥的10%左右[1]。將經(jīng)過(guò)附睪穿刺(percutaneous epididymal sperm aspiration，PESA)獲得的精子行卵母細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)是目前治療梗阻性無(wú)精子癥的唯一辦法[2]。若將上一周期的剩余附睪穿刺精子進(jìn)行凍融保存，可以減少反復(fù)附睪穿刺帶來(lái)的并發(fā)癥，而且能最大限度保存男性生育力。但是對(duì)于冷凍后的PESA精子其臨床結(jié)局如何，目前報(bào)道較少。作者回顧性比較復(fù)蘇后的冷凍PESA精子其受精能力、胚胎發(fā)育潛能和臨床結(jié)局與新鮮PESA精子及新鮮體外射精精子之間的差異，來(lái)探討凍融PESA精子的臨床效果，并為臨床補(bǔ)充理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 一般資料 選取2014年10月至2016年11月在我院生殖中心進(jìn)行新鮮PESA精子、凍融PESA精子、新鮮體外射精精子行ICSI治療共193周期，其中新鮮PESA精子治療組66例，凍融PESA精子治療組37例，新鮮體外射精精子治療組90例。相同手術(shù)操作均為同一技術(shù)人員，避免人為因素影響。

1.2 方法

1.2.1 降調(diào)節(jié)、促排卵和取卵： 根據(jù)患者配偶的雌二醇、黃體生成素和卵泡生成素情況，采用長(zhǎng)方案促排卵，當(dāng)有兩個(gè)以上優(yōu)勢(shì)卵泡直徑不小于18 mm時(shí)，停用藥物并注射HCG，36～38 h后在B超引導(dǎo)下經(jīng)患者配偶陰道取卵備用。

1.2.2 附睪穿刺取精 患者仰臥，利多卡因局部麻醉后，固定睪丸并用5 mL注射器抽取附睪精子。

1.2.3 精子冷凍 將精子保護(hù)液緩慢加入PESA精子中，按照1∶1比例充分混勻，封口后置于4 ℃冰箱降溫30 min，再置于液氮盒上方熏蒸10 min，最后投入液氮罐中保存。

1.2.4 凍融附睪精子復(fù)蘇 將精子冷凍管中的PESA精子取出置于溫水燒杯內(nèi)(35～37 ℃)20 min，按1:2比例加入培養(yǎng)液400×g離心5 min,留取沉淀置于37 ℃、5%CO2孵箱中平衡。

1.2.5 卵母細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射 在顯微鏡下選擇活力和形態(tài)最佳精子，于7%PVP溶液中使用injiection針劇烈抽打精子頸部下方2/3處直至完全制動(dòng)，將精子注射至MⅡ卵子內(nèi)并回吸，當(dāng)出現(xiàn)“跳水”動(dòng)作后迅速將精子打入卵細(xì)胞內(nèi)，并將受精卵置于培養(yǎng)箱中過(guò)夜。

1.2.6 優(yōu)質(zhì)胚胎判定 卵裂球數(shù)目≥6、大小規(guī)則、碎片≤20%定義為優(yōu)質(zhì)胚胎。

1.2.7 胚胎移植與妊娠判定 ICSI操作18～19 h后觀察受精情況，以雙原核(2PN)作為判斷正常受精依據(jù)，并在25～26 h和42～44 h兩次觀察受精卵發(fā)育情況；受精后66～68 h后選擇發(fā)育最優(yōu)的胚胎進(jìn)行移植，兩周后抽血檢測(cè)人絨毛膜促性腺激素水平，并于30 d左右后監(jiān)測(cè)孕囊以排除生化妊娠，隨訪。

1.2.8 檢測(cè)指標(biāo) 受精率(受精卵子總數(shù)/ MⅡ卵子總數(shù)×100%)；正常受精率(正常受精數(shù)/總受精數(shù)×100%)；正常卵裂率(正常卵裂數(shù)/正常受精數(shù)×100%)；優(yōu)質(zhì)胚胎率(優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/正常受精數(shù)×100%)；妊娠率(妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%)；流產(chǎn)率(流產(chǎn)周期數(shù)/妊娠周期數(shù)×100%)。

2 結(jié)果

2.1 各組間臨床資料對(duì)比 3組間年齡、子宮內(nèi)膜厚度及成熟卵子獲卵數(shù)均無(wú)顯著差異(P>0.05，見(jiàn)表1)。

表1 3組間年齡、子宮內(nèi)膜厚度及成熟卵獲得數(shù)比較

組別女方年齡(歲)男方年齡(歲)子宮內(nèi)膜厚度(mm)成熟卵獲得數(shù)(個(gè))新鮮PESA31.53±3.6633.57±4.548.22±2.669.31±3.77冷凍PESA32.98±4.3732.74±3.389.04±2.169.67±2.88新鮮射精32.71±4.1032.32±3.638.40±2.749.50±3.47P>0.05>0.05>0.05>0.05

2.2 3組間胚胎發(fā)育資料對(duì)比 各組間受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率等胚胎發(fā)育潛能情況均無(wú)顯著差異(P>0.05，見(jiàn)表2)。

表2 3組間胚胎發(fā)育資料比較

組別總受精率(%)正常受精率(%)正常卵裂率(%)優(yōu)質(zhì)胚胎率(%)新鮮PESA90.25(583/646)94.67(552/583)93.29(515/552)39.49(218/552)冷凍PESA89.64(277/309)93.50(259/277)91.89(238/259)37.07(96/259)新鮮射精92.71(941/1015)95.54(899/941)94.78(852/899)43.49(391/899)P>0.05>0.05>0.05>0.05

2.3 3組間臨床結(jié)局對(duì)比 3組間平均移植數(shù)、妊娠率和流產(chǎn)率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，見(jiàn)表3)。

表3 3組間臨床結(jié)局對(duì)比

組別移植胚胎數(shù)(個(gè))妊娠率(%)流產(chǎn)率(%)新鮮PESA2.28±0.3342.42(28/66)10.71(3/28)冷凍PESA2.06±0.5237.84(14/37)7.14(1/14)新鮮射精2.15±0.3941.11(37/90)13.51(5/37)PP>0.05P>0.05P>0.05

3 討論

PESA和ICSI技術(shù)解決了梗阻性無(wú)精子癥的難題，但由于附睪內(nèi)的精子數(shù)量少，且經(jīng)常分散于附睪的各個(gè)位置，所以即使第一次PESA取精成功，下次仍有20%～30%的失敗可能[3]，而女方從降調(diào)解月經(jīng)周期到準(zhǔn)備取卵是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，需要十余天甚至數(shù)十天的前期治療，若女方取卵當(dāng)天PESA取精失敗，給患者夫婦造成的打擊可想而知，因此，將上一周期或者用于診斷的剩余PESA精子凍融保存是十分有意義的。

從18世紀(jì)中葉，就曾有學(xué)者嘗試將精子置于雪中進(jìn)行保存[4]，但是長(zhǎng)期以來(lái)，很多學(xué)者人為精子在冷凍過(guò)程中產(chǎn)生的冰晶會(huì)使得精子膜內(nèi)壓力升高，從而使精子細(xì)胞膜腫脹、破損甚至?xí)a(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)而影響精子的受精功能，而且會(huì)損傷精子的染色體[5]，因此認(rèn)為復(fù)蘇后的精子不能取得滿意的臨床效果。但是也有學(xué)者認(rèn)為只要附睪中能找到足夠的存活精子，將其冷凍后再行ICSI操作是完全可行的[6]

而在我中心實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)，只要冷凍技術(shù)成熟、操作規(guī)范，復(fù)蘇后絕大多數(shù)情況下都能找到足夠的可用精子。本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)蘇后的PESA精子無(wú)論其受精率、卵裂率和優(yōu)質(zhì)胚胎率與新鮮PESA精子及新鮮體外射精精子比較并無(wú)顯著差異，而且妊娠率和流產(chǎn)率等臨床結(jié)局也與新鮮精子相似，與Tsai等[7-10]研究結(jié)果一致。分析原因是：冷凍過(guò)程中雖然會(huì)對(duì)精子產(chǎn)生一些物理?yè)p傷，但同時(shí)也是一種優(yōu)勝劣汰的篩選過(guò)程，只有那些受精能力強(qiáng)、活力好的精子能夠存活下來(lái)，因此能夠得到較好的臨床結(jié)局。

綜上所述，將PESA精子進(jìn)行凍融保存是安全有效的。凍融PESA組表面看經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)略微增加，但保障了取卵日有可用精子，避免了更多的經(jīng)濟(jì)損失。目前，我中心已經(jīng)將PESA精子冷凍作為一種常規(guī)的輔助生殖技術(shù)進(jìn)行全面應(yīng)用。

[1] 劉艷麗，路芳鳴，孫麗君，等.精液參數(shù)和來(lái)源對(duì)ICSI助孕患者胚胎質(zhì)量及臨床結(jié)局的影響[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,42(3):66-70.

[2] Peng Q P，Cao S F，Lyu Q F，et al．A novel method for cryopreservation of individual human spermatozoa[J].In Vitro Cell Dev BiolAnim，2011,47(8):565-572．

[3] 葛斌，楊智敏，刁英，等.無(wú)保護(hù)劑玻璃化冷凍技術(shù)在凍存PESA精子中的實(shí)用性研究[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2016,32(1):91-93.

[4] Paoly D,Lombardo F,Lenzi A,et al.Sperm cryopreservation：effectes on chromationg structure [J]. Adv Exp Med Biol,2014,791(791):137-150.

[5] Said T M ，Gaglani A ，Agarwal A.Implication of apoptosis insperm cryo injury[J]．Repord Biomed Online,2010,21(4):456-462.

[6] Levron J ，Madgra I，Shefi S，et al.IVF outcome with cryopre served testicular sperm [J].Andrologia,2011,43(1):48-51.

[7] Lu Y U,Gao H J,Li B J,et al.Different sperm sourees and paramclers can influence intracytoplasmic sperm injection outcomes before sperm embryo implantain [J].J Zhejiang Univ Sei B,2012,13(1):1-10.

[8] Tsai C C,Huang F J,WangL J,et al.Clincal outcomes and dcvelopment of children born after intracytoplasnic sperm injection using extracted testicular sperm or ejaculated extreme severe oligo- astheno-teratozoospeospe rmia:a comparative study[J].Fertil Steril,2011,96(3):567-571.

[9] 0lddereid N B,Hanevik H I, Bakkevig I,et al.Prenanecy outcome according to male diagnosis after ICSI with non-ejaculated sperm compared with ejaculated controls[J]. Repord Biomed Oline,2014,29(4)417-423.

[10]Xie D,Qiu Z,Luo C,et al.Effect of spermatozoa from different sources on normal fertilization of oocytes and embryouquality and development in intracytoplasmic sperm injection eycles [J].South Med Univ,2014,34(6):857-861.

(編輯：王福軍)

Application of freeze-thaw PESA sperm combined with ICSI in the treatment of obstructive azoospermia

Ge Bin,Yang Zhimin,Wang Lujuan,Yang Minghui

(Department of Reproductive Center,Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

ObjectiveTo study the application of freeze-thaw PESA sperm combined with ICSI technology in treating obstructive anspermia.MethodsThe fresh PESA sperm,freeze-thaw PESA sperm,and fresh sperm were used to do the treatment with ICSI in the total 193 cycles. The results of fertilization,development and clinical outcome were analyzed retrospectively.ResultsAfter the treatment,the fertilization rates of the three groups were 94.67%,93.50%,and 95.54%,respectively. The normal cleavage rates were 93.29%,91.89%,and 94.78%. The quality embryo rates were 39.49%,37.07%,and 43.49%. The rates of pregnancy were 42.42%,37.84%,and 41.11%. And the abortion rates were 10.71%,7.14%,and 13.51%. In all of the above comparisons,there was no statistical difference among the three groups (P>0.05).ConclusionThe clinical effect of frozen and thawing PESA sperm can be similar to that of fresh sperm,which is safe and effective.

sperm frozen; percutaneous epididymal sperm aspiration; intracytoplasmic sperm injection

貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(NO：黔科合LH字[2015]7449)。

R321.1

A

1000-2715(2017)04-0410-03

[收稿2017-06-08;修回2017-07-03]