養(yǎng)胃舒與葉酸片治療亞硝基胍誘發(fā)慢性萎縮性胃炎模型大鼠的萎縮逆轉(zhuǎn)作用觀察*

吳 悅 吳人照 龍華晴 馬津真 聶曉靜 陳 宇 戴關(guān)海 陳 璇 童曄玲 任澤明

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053 2 浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江 杭州 310007

實(shí)驗(yàn)研究

養(yǎng)胃舒與葉酸片治療亞硝基胍誘發(fā)慢性萎縮性胃炎模型大鼠的萎縮逆轉(zhuǎn)作用觀察*

吳 悅1吳人照2#龍華晴1馬津真1聶曉靜1陳 宇2戴關(guān)海2陳 璇2童曄玲2任澤明2

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053 2 浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江 杭州 310007

目的：探討?zhàn)B胃舒、葉酸片治療亞硝基胍（MNNG）誘發(fā)慢性萎縮性胃炎（CAG）模型大鼠的體重恢復(fù)及胃黏膜萎縮逆轉(zhuǎn)作用。方法：Wistar大鼠自由飲用167μg/ml蒸餾水濃度的飲用液，實(shí)驗(yàn)造模12周。確定成模后，將大鼠分為模型組、養(yǎng)胃舒組、葉酸片組，另設(shè)同齡正常對(duì)照組。并分別給予藥物干預(yù)后，觀察大鼠體重、胃組織病理組織學(xué)情況。結(jié)果：①體重：治療第8周,養(yǎng)胃舒組體重丟失恢復(fù)顯著高于模型組（P＜0.05）,葉酸片組體重丟失有恢復(fù)趨勢(shì)，但無(wú)顯著性（P＞0.05）。②病理：養(yǎng)胃舒組腸化顯著減輕（P＜0.05），葉酸片組胃黏膜炎癥等級(jí)、腺體萎縮、不典型增生均顯著減輕（P＜0.05，P＜0.01）。模型組雄1發(fā)生腫瘤，各治療組未見(jiàn)腫瘤。結(jié)論：養(yǎng)胃舒對(duì)CAG模型大鼠在減輕體重丟失，減輕腸化方面有較好治療作用；葉酸片對(duì)CAG模型大鼠在胃黏膜炎癥等級(jí)、腺體萎縮、不典型增生方面有較好的治療作用。

慢性萎縮性胃炎 養(yǎng)胃舒 葉酸 病理 大鼠

阻斷乃至逆轉(zhuǎn)胃黏膜萎縮和腸化生的發(fā)展進(jìn)程，對(duì)慢性萎縮性胃炎（CAG）治療至關(guān)重要。中西藥聯(lián)合治療CAG有著一定的優(yōu)勢(shì)，養(yǎng)胃舒與葉酸片均為臨床可選藥物，但未見(jiàn)系統(tǒng)的比較研究文獻(xiàn)。本研究采用亞硝基胍（MNNG）誘發(fā)大鼠CAG模型，客觀評(píng)價(jià)養(yǎng)胃舒與葉酸片對(duì)CAG的治療效果，觀察各組大鼠體重丟失恢復(fù)情況和病理改變情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：正常Wistar大鼠70只，雌雄各半，體重160～190g，動(dòng)物合格證編號(hào)：0228546。均購(gòu)買于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，其實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為：SCXK(滬)2013-0016。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于本院25±2℃的屏障實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，每12小時(shí)光照明暗交替，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(浙)20090122。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物：①養(yǎng)胃舒顆粒：顆粒劑，每袋10g，內(nèi)含黨參、陳皮、黃精、山藥、玄參、烏梅、山楂、北沙參、干姜、菟絲子、白術(shù)（炒）等。由合肥神鹿雙鶴藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，臨床人體用藥量20g/日。批號(hào)：1506215，有效期3年。②葉酸片：依據(jù)《中國(guó)慢性胃炎共識(shí)意見(jiàn)》，葉酸可以改善CAG，預(yù)防胃癌［1］，本實(shí)驗(yàn)采用了CAG以及胃癌前病變相對(duì)比較公認(rèn)有一定療效的西藥葉酸片，每片5mg。批號(hào)：1603007，有效期3年。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：RM2235 LEICA病理切片機(jī)、EG1150C LEICA生物組織冷凍機(jī)、EG1150H LEICA生物組織包埋機(jī)、ASP200 LEICA生物組織自動(dòng)脫水機(jī)：德國(guó)萊卡公司；BX41OLYMPUS顯微鏡：日本OLYMPUS（オリンパス）株式會(huì)社；Nikon ECLIPSE Ti顯微攝像系統(tǒng)：日本Nikon株式會(huì)社。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑：MNNG：5g/瓶，上海藍(lán)季生物公司購(gòu)買，由日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社生產(chǎn)，批號(hào)：75F71-TF；甲醛溶液：500ml/瓶，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20130610。

1.5 MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠造模方法：6周齡的Wistar大鼠：70只，雌雄各半，50只開(kāi)始造模：在飲水中加入MNNG。每周1次用蒸餾水配成1g/L濃度的儲(chǔ)存液，避光冷藏保存。同時(shí)配成167μg/ml蒸餾水濃度的飲用液，將其裝入外用黑色塑料袋包裹著的水瓶，讓大鼠自由飲用。本次實(shí)驗(yàn)造模12周。

1.6 MNNG誘發(fā)CAG模型大鼠的治療：造模完成時(shí)，隨機(jī)選取4只模型動(dòng)物與4只正常動(dòng)物胃組織做病理組織學(xué)檢查，確定成模后，按照實(shí)驗(yàn)的分組要求（每組12只，雌雄各半）分組并開(kāi)始給藥。模型組給生理鹽水，養(yǎng)胃舒顆粒給養(yǎng)胃舒顆粒4.0g/kg/日灌胃，葉酸組給葉酸片5.0mg/kg/日灌胃，此外，取12只相同條件的大鼠作為空白（未造模）對(duì)照組。在給藥第8周完成時(shí)，4組大鼠均麻醉，迅速將胃摘出，福爾馬林固定，石蠟包埋，做4μm切片，用HE、AB染色，進(jìn)行組織學(xué)檢查。

1.7 病理組織學(xué)檢查方法：標(biāo)本：大鼠均麻醉，迅速將胃摘出，標(biāo)本為全胃，上段留0.5cm食管，下段留1.5cm十二指腸；沿胃大彎剪開(kāi)，生理鹽水沖洗，浸于10%中性福爾馬林中。取材范圍：從前胃一直到十二指腸縱向全長(zhǎng)、全層。包埋切片：石蠟包埋，作4μm切片。染色：HE染色、AB染色。光鏡觀察：①胃黏膜炎癥情況：采用半定量法。后在胃組織的胃竇部取10個(gè)視野，具體參照在1994年美國(guó)休斯頓所提出的胃炎診斷標(biāo)準(zhǔn)。②胃黏膜腺體厚度：每張胃組織切片中，選取胃竇部黏膜5個(gè)視野，測(cè)出在每個(gè)視野下胃竇黏膜腺體厚度，得出每張切片5個(gè)視野平均值(μm)。③胃腺體數(shù)目：選取100倍鏡下，找到每只大鼠胃組織的幽門(mén)環(huán)0.2～1.2mm（200～1200μm）之間（即1mm范圍）胃竇固有的腺體總個(gè)數(shù)，單位通常以“個(gè)/mm”來(lái)表示。④不典型增生：在每張切片中，取5個(gè)高倍鏡視野，觀察胃黏膜上皮細(xì)胞，明確有無(wú)細(xì)胞核多形性和腺體不典型增生的變化（采用輕、中、重級(jí)別報(bào)告）。⑤主細(xì)胞、壁細(xì)胞數(shù)目：選取400倍鏡下，取5個(gè)視野平均值。⑥腸上皮化生表現(xiàn)：參照《中藥新藥治療慢性萎縮性胃炎的臨床研究指導(dǎo)原則》及2006中國(guó)上海慢性胃炎共識(shí)意見(jiàn)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組均數(shù)比較采用F檢驗(yàn)，其中兩組比較計(jì)量資料采用LSD-t和Dunnett T3檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異顯著。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 體重：治療前模型大鼠體重較正常大鼠顯著下降（P＜0.01）。造模完成后，在治療前各治療組間體重情況無(wú)顯著差異（P＞0.05），具有可比性。各治療組治療后體重較模型組體重丟失有一定程度恢復(fù)。治療第8周時(shí)養(yǎng)胃舒組大鼠體重丟失較模型組有顯著恢復(fù)（P＜0.05），葉酸片組大鼠體重丟失較模型組有恢復(fù)趨勢(shì)，但無(wú)顯著性（P＞0.05）。養(yǎng)胃舒與葉酸片體重丟失恢復(fù)比較無(wú)顯著性（P＞0.05）。見(jiàn)表1、圖1。

2.2 病理：養(yǎng)胃舒組腸化（“++”“+++”只數(shù)）5/11（45.45%）（治療8周后養(yǎng)胃舒組存活11只），與模型組腸化（“++”“+++”只數(shù)）10/12（83.33%）比較，有顯著差異（P＜0.05）。養(yǎng)胃舒組炎癥、腺體數(shù)量、腺體厚度、主細(xì)胞、壁細(xì)胞、輕度不典型增生與模型組比較，有改善但無(wú)顯著性（P＞0.05）。葉酸片組炎癥、腺體數(shù)量、腺體厚度、輕度不典型增生與模型組比較，有顯著差異（P＜0.01，P＜0.05）,腸化方面有改善，但無(wú)顯著性（P＞0.05）。模型組還有1只動(dòng)物（雄1號(hào)）發(fā)生腫瘤，為十二指腸漿膜面胃腺癌，其他各治療組未發(fā)生腫瘤。在炎癥方面，葉酸片比養(yǎng)胃舒顯著改善（P＜0.05）。詳見(jiàn)表2、表3。

結(jié)合表1的體重丟失恢復(fù)療效，以及模型組還有1只動(dòng)物發(fā)生腫瘤，進(jìn)行綜合分析，養(yǎng)胃舒對(duì)MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠體重丟失、腸化有顯著改善作用。在一定程度上有改善炎癥等級(jí)、胃黏膜萎縮、不典型增生的療效。葉酸片對(duì)MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠體重丟失有恢復(fù)趨勢(shì)，能顯著改善胃黏膜炎癥等級(jí)、萎縮、不典型增生的病變情況。在炎癥（等級(jí)）方面，葉酸片比養(yǎng)胃舒顯著改善。養(yǎng)胃舒與葉酸片治療CAG的療效表現(xiàn)在不同方面，但對(duì)CAG的治療都有較好效果。

表1 養(yǎng)胃舒與葉酸片對(duì)MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠治療8周體重影響（±s,g/只）

表1 養(yǎng)胃舒與葉酸片對(duì)MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠治療8周體重影響（±s,g/只）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

分組養(yǎng)胃舒組(n=12、11)葉酸片組(n=12)正常組(n=12)模型組(n=12)治療第8周226.18±37.24*206.17±28.46 292.83±61.88**171.08±32.23治療前170.33±33.17 168.75±29.74 259.42±51.93**167.77±38.23

圖1 養(yǎng)胃舒、葉酸片對(duì)MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠治療8周大鼠體重（g/只）

表2 養(yǎng)胃舒與葉酸片對(duì)MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠治療8周胃組織不典型增生、腸化觀察（只）

表3 養(yǎng)胃舒與葉酸片對(duì)MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠治療8周胃組織萎縮病理觀察（±s）

表3 養(yǎng)胃舒與葉酸片對(duì)MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠治療8周胃組織萎縮病理觀察（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與葉酸組比較，#P＜0.05。

組別養(yǎng)胃舒組葉酸片組正常組模型組壁細(xì)胞(個(gè)/視野) 178.02± 44.76 156.07± 52.27 285.00±113.21**184.42±102.81例數(shù)11 12 12 12炎癥 (等級(jí)) 0.77±0.28#0.50±0.28**0.23±0.20**0.88±0.38腺體數(shù)量(個(gè)/mm) 38.55±5.45 39.83±6.95*45.83±7.16**33.67±4.58腺體厚度(um) 240.41±37.7 262.53±64.42*254.91±38.97*212.02±41.83主細(xì)胞(個(gè)/視野) 200.23±139.8 185.23±117.76 319.42±121.35*205.75±118.12

3 討論

CAG是一種常見(jiàn)的消化系統(tǒng)疾病，且已明確為癌前疾病。中醫(yī)學(xué)將其歸屬為“胃脘痛”“嘈雜”“胃痞”等范疇。CAG的病因，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)識(shí)尚不十分明確。目前多認(rèn)為CAG的發(fā)生是多病因綜合作用、漫長(zhǎng)、多階段、多基因變異的積累過(guò)程，主要有Hp感染、胃黏膜微循環(huán)改變、黏膜營(yíng)養(yǎng)因子缺乏、膽汁反流、精神壓力、心理異常等。其主要病機(jī)是中焦?jié)駸幔鲅獌?nèi)阻。治宜益氣活血、溫養(yǎng)脾胃為主。

養(yǎng)胃舒顆粒內(nèi)含黨參、陳皮、黃精、山藥、玄參、烏梅、山楂、北沙參、干姜、菟絲子、白術(shù)（炒）等。黨參有益氣健脾之功，陳皮有理氣開(kāi)胃、燥濕化痰之功，北沙參、玄參有養(yǎng)陰清肺、益胃生津之功，黃精、山藥、白術(shù)（炒）有補(bǔ)氣健脾、滋腎潤(rùn)肺之功，菟絲子有滋補(bǔ)肝腎之功，烏梅、山楂、砂仁有消食健胃、溫補(bǔ)脾陽(yáng)、活血行氣、收斂止痢之功，干姜有溫中散寒、燥濕消痰、溫肺化飲之功?，F(xiàn)代藥理研究已經(jīng)證實(shí)，黨參有提高機(jī)體免疫力，通過(guò)擴(kuò)張末梢血管達(dá)到改善胃黏膜微循環(huán)的作用，還有利于促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，有促使胃黏膜細(xì)胞、腺體細(xì)胞修復(fù)和再生的功能［2］；白術(shù)不僅具有提高機(jī)體免疫力、對(duì)抗腫瘤細(xì)胞毒性的作用，還具有雙向調(diào)整胃腸運(yùn)動(dòng)，抗胃黏膜損傷，改善局部病變的綜合作用［3］。北沙參的提取物能夠抑制脂質(zhì)的過(guò)氧化作用，也可以抑制促癌物質(zhì)滲入磷脂中，有抑制腫瘤生成的作用［4］。以上藥物綜合運(yùn)用，具有提高機(jī)體免疫、改善消化功能、調(diào)節(jié)胃腸道動(dòng)力、抗胃黏膜損傷等作用。已有研究證實(shí)養(yǎng)胃舒可以有效改善胃黏膜損傷，促進(jìn)胃黏膜修復(fù)和再生［5］。

葉酸片對(duì)細(xì)胞維持正常功能和增殖至關(guān)重要。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明葉酸具有抗腫瘤作用，能夠抑制腫瘤細(xì)胞中癌基因的表達(dá)［6］。有研究者發(fā)現(xiàn)胃腺癌患者的手術(shù)標(biāo)本中，組織葉酸水平明顯降低。當(dāng)葉酸在一定濃度范圍時(shí)，對(duì)胃癌細(xì)胞表現(xiàn)出良好的抑制作用［7］。在消化系統(tǒng)疾病中，葉酸代謝紊亂的狀況同樣存在，高緯等［8］觀察葉酸片干預(yù)CAG患者后結(jié)果顯示，葉酸片的供甲基作用在一定程度上對(duì)于CAG的惡變有預(yù)防作用。

關(guān)于養(yǎng)胃舒顆粒與葉酸治療萎縮性胃炎進(jìn)行作用特點(diǎn)比較的實(shí)驗(yàn)研究，未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)告?；诖?，本實(shí)驗(yàn)選用單用養(yǎng)胃舒、葉酸片分別治療CAG，觀察CAG大鼠體重丟失恢復(fù)及胃組織病理情況。研究結(jié)果顯示：從本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果看，養(yǎng)胃舒組對(duì)MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠治療8周具有顯著減輕體重丟失，顯著改善腸化的作用，對(duì)胃黏膜炎癥（等級(jí)）、萎縮情況有一定程度改善作用。葉酸片對(duì)MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠治療8周具有顯著改善胃黏膜炎癥（等級(jí)）、萎縮、不典型增生作用，在一定程度上有減輕體重丟失趨勢(shì)和改善腸化作用?？偠灾?，養(yǎng)胃舒、葉酸片治療CAG的療效表現(xiàn)在不同方面，但對(duì)CAG的治療都有一定效果。

[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì).中國(guó)慢性胃炎共識(shí)意見(jiàn)［J］.現(xiàn)代消化及介入診療，2013，18(2)：119-122．

[2]李黎星，康杰芳.中藥黨參的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2009，9(12)：2371-2373.

[3]宿延敏,王敏娟,阮時(shí)寶.白術(shù)的化學(xué)成分及藥理作用研究概述[J].貴陽(yáng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，3(2)：32-35．

[4]崔海燕,許一平.北沙參的化學(xué)成分及藥理作用研究綜述[J].健康與生物醫(yī)藥.2009，21（19）：203-204．

[5]吳人照，陳立鉆，楊兵勛.鐵皮楓斗顆粒治療自身免疫法慢性胃炎模型大鼠的實(shí)驗(yàn)研究[J].浙江中醫(yī)雜志,2015，50 (12)：881-883．

[6]Franzen S.A comparison of peptide and folate receptor targeting of cancer cells：from Single agent to nanoparticle[J].Expert Opinion on Drug Delivery, 2011，8(3)：281．

[7]白紅霞,馮玉光,張小茜,等.葉酸對(duì)人胃癌SGC-79 01細(xì)胞株增殖及ABCG2表達(dá)的影響[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2012，28 (9)：1281-1283．

[8]高瑋,李雷佳,許平,等.葉酸對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)特征以及alkB基因表達(dá)的影響[J].胃腸病學(xué),2010，15(9)：540-543．

2017-05-18

國(guó)家科技重大專項(xiàng)重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目鐵皮楓斗顆粒治療慢性萎縮性胃炎的臨床研究，編號(hào)：2016ZX09101069；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目鐵皮楓斗顆粒有效成分治療慢性萎縮性胃炎的分子機(jī)理實(shí)驗(yàn)研究，編號(hào)：LY15H280011；浙江省重大科技專項(xiàng)項(xiàng)目鐵皮楓斗顆粒治療慢性萎縮性胃炎的研究——擴(kuò)大適應(yīng)癥研究，編號(hào)：2009C13032

# 通訊作者：吳人照，E-mail：wufeng03@126.com