浙江沿海潮間帶多毛類環(huán)節(jié)動(dòng)物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫初建

姚 瑞，謝斐昂，嚴(yán)安琪，陳永久,

（1.浙江海洋大學(xué)國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022）

浙江沿海潮間帶多毛類環(huán)節(jié)動(dòng)物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫初建

姚 瑞1，謝斐昂2，嚴(yán)安琪2，陳永久1,2

（1.浙江海洋大學(xué)國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022）

多毛綱環(huán)節(jié)動(dòng)物是形態(tài)學(xué)分類鑒定極為困難的一類海洋生物。本研究旨在構(gòu)建浙江沿海常見多毛類的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫。2015年1-10月期間，針對(duì)多毛類環(huán)節(jié)動(dòng)物在浙江沿海潮間帶進(jìn)行了多次定性采樣，并對(duì)樣本進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定以及線粒體COⅠDNA序列分析。從形態(tài)學(xué)上共鑒定了8個(gè)多毛類物種，隸屬于4個(gè)科，即雙齒圍沙蠶Perinereis aibuhitensis、威氏圍沙蠶 P.wilsoni、獨(dú)齒圍沙蠶P.cultrifera、雜色偽沙蠶Pseudonereis variegata、雙管闊沙蠶Platynereis bicanaliculata、短毛海鱗蟲Halosydna brevisetosa、巖蟲Marphysa sanguinea、四索沙蠶Lumbrineris tetraura。共得到長(zhǎng)度為680～930 bp的13條DNA序列，其中2條屬于P.wilsoni、2條屬于M.sanguinea的片段，這兩個(gè)物種的序列還未在BOLD中收錄；1條H.brevisetosa的COⅠ基因序列與GenBank上的同名序列差異較大。計(jì)算得到樣本的種內(nèi)平均遺傳距離為2.8%，科內(nèi)種間平均遺傳距離為23.9%，科內(nèi)種間距離遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于種內(nèi)距離；從而印證了COⅠ可作為多毛類動(dòng)物分類的條形碼。此外，本研究還設(shè)計(jì)了一對(duì)多毛類動(dòng)物COⅠ片段的特異性引物，而且適用于擴(kuò)增A+T含量較高的多毛類物種。

DNA條形碼；線粒體COⅠ序列；形態(tài)學(xué)；多毛類；浙江沿海

多毛類是環(huán)節(jié)動(dòng)物門最大的一個(gè)綱。包括80余科，1 600多個(gè)屬，10 000多個(gè)已描述的種類[1]。多毛類動(dòng)物大多生活在海洋生境中，是魚類及其他動(dòng)物的重要餌料，以及海洋資源調(diào)查的重要組成部分，也是海洋生物中尚待開發(fā)、利用和保護(hù)的潛在對(duì)象。然而，相比其他常見類群，如甲殼動(dòng)物、軟體動(dòng)物、棘皮動(dòng)物，多毛類分類學(xué)研究的進(jìn)展最為緩慢[2]。目前，分類學(xué)家們已經(jīng)意識(shí)到單以形態(tài)學(xué)方法來進(jìn)行多毛類物種的分類鑒定顯得極為繁瑣和耗時(shí)[3]。國內(nèi)外已經(jīng)發(fā)表了許多關(guān)于海洋底棲生物多樣性的文章，其中有關(guān)多毛類的鑒定也大多數(shù)使用科或?qū)偎絒4]。這是因?yàn)槟壳岸嗝V動(dòng)物還存在著許多不能確定的物種分化，許多類群缺少相關(guān)的分類學(xué)家；同時(shí)，由于受現(xiàn)階段的采樣方法和采樣工具的限制，很難獲得較為完整的多毛類樣本，大多數(shù)樣本都不完整且個(gè)體眾多[5]。此外，多毛類動(dòng)物具有復(fù)雜的生活史，不同生長(zhǎng)發(fā)育階段形態(tài)各異，加之隱生種的存在，給形態(tài)學(xué)分類帶來了極大的挑戰(zhàn)[6]。

對(duì)多毛類資源進(jìn)行開發(fā)、利用和保護(hù)，都要求對(duì)形態(tài)相似的物種進(jìn)行確切的劃分。然而，僅依賴形態(tài)學(xué)分類顯然難以滿足這些要求，因此建立一套基于遺傳信息的快速、高效、精確并且國際化的多毛類物種鑒定標(biāo)準(zhǔn)，這對(duì)提高海洋生物資源調(diào)查和海洋生態(tài)系統(tǒng)評(píng)估的效率和科學(xué)性具有深遠(yuǎn)的意義。2003年加拿大分類學(xué)家HEBERT等[7]提出以線粒體COI DNA序列作為普遍的動(dòng)物DNA條形碼。與形態(tài)學(xué)鑒定參考標(biāo)準(zhǔn)不同，DNA條形碼是直接將采樣個(gè)體與全球化的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫中的序列信息進(jìn)行比較[8]，從而較為客觀、準(zhǔn)確地鑒定物種；由于條形碼檢測(cè)對(duì)樣本的完整程度和形態(tài)特征沒有限制，故可用于鑒別多毛類碎片樣本，以及不同生長(zhǎng)生活階段的個(gè)體。但是這一方法的真正推行，有賴于全球范圍內(nèi)的相關(guān)研究人員，以統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)、同一形式對(duì)盡可能多的多毛類物種進(jìn)行條形碼提取和數(shù)據(jù)庫構(gòu)建，以降低人為因素造成的誤差[9]。

至今，以COⅠ基因?yàn)榛A(chǔ)的條形碼數(shù)據(jù)庫BOLD（http://www.barcodinglife.org）已經(jīng)覆蓋了4 827 188個(gè)物種，但是關(guān)于多毛類的條形碼只有10 430條，而其中鑒定到種這一分類階元的僅有6 555個(gè)。從物種范圍上看，大多數(shù)僅停留在特定屬和種[10-12]，大量多毛類物種的條形碼信息仍尚未報(bào)道。而從地理分布來講，大多數(shù)研究的主要集中于美國—加拿大—阿拉斯加沿海，以及中國黃渤海沿海以及葡萄牙、挪威等地沿海[13]，其他海域和近海的研究十分匱乏。根據(jù)BOLD數(shù)據(jù)庫（2014）的統(tǒng)計(jì)顯示，雖然已描述的多毛類環(huán)節(jié)動(dòng)物已有一萬多種，但是僅793個(gè)物種的DNA條形碼在BOLD上收錄。

本研究為了構(gòu)建浙江沿海多毛類環(huán)節(jié)動(dòng)物的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，在浙江沿岸潮間帶進(jìn)行定性采樣。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定，通過對(duì)線粒體COⅠDNA序列測(cè)序和分析，探索一套較為系統(tǒng)、完整的條形碼數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的基本思路及關(guān)鍵技術(shù)，初步建立浙江沿海多毛類DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，也為使我國多毛類物種鑒定早日擺脫繁瑣、耗時(shí)的手工操作局面創(chuàng)造技術(shù)和數(shù)據(jù)條件。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與保存

本研究于2015年1月至10月期間，在浙江沿海潮間帶進(jìn)行了多次多毛類動(dòng)物定性采樣。采樣地最北至舟山東極青浜島，最南至蒼南；涉及到泥沙相、沙相、巖相以及礫石相等多種潮間帶底質(zhì)環(huán)境。采樣點(diǎn)包括舟山東極島、朱家尖島和六橫島，以及象山，溫州洞頭島，平陽南麂列島和蒼南（圖1）。采集采樣深度不超過10 m。采樣點(diǎn)的溶解氧（DO 值）在 0.768～0.938 mg/L，鹽度在 28～33范圍內(nèi)。

采集到的活體樣本帶回實(shí)驗(yàn)室后，置于孔徑0.5 mm的鋼篩上，先用海水沖洗，再用蒸餾水浸泡活體30 s進(jìn)行麻醉使其剛毛、疣足、觸須等結(jié)構(gòu)完全舒展，以便于觀察，最后在解剖鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。對(duì)需要進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定的個(gè)體（每個(gè)采樣點(diǎn)同一個(gè)物種選2～3個(gè)個(gè)體）在近尾部剪取2 mm3大小的肌肉組織樣本置于95%的乙醇溶液中，以備提取總DNA。其余部分和其他個(gè)體也置于相同濃度的乙醇中，并放入硫酸紙標(biāo)簽密封保存，置于4℃標(biāo)本陳列柜中長(zhǎng)期保存。樣本編號(hào)、采集地等信息見表1。

圖1 采樣點(diǎn)分布圖Fig.1 Map shows sampling sites

1.2 形態(tài)學(xué)觀察樣本

本研究使用Optec光學(xué)解剖鏡，對(duì)所有樣本進(jìn)行觀察、解剖、對(duì)比，并參考《中國動(dòng)物志·無脊椎動(dòng)物門·多毛綱·沙蠶目》和《中國近海多毛環(huán)節(jié)動(dòng)物》中各物種的分類特征[14-15]，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行特征記錄和繪圖。對(duì)于剛毛和疣足上其他微小結(jié)構(gòu)制作了臨時(shí)裝片，用Olympus-CX31光學(xué)顯微鏡對(duì)顯微結(jié)構(gòu)的觀察，拍照和繪圖。用數(shù)碼顯微鏡對(duì)每一個(gè)物種進(jìn)行整體拍照，輔以詳細(xì)的形態(tài)描述，以達(dá)到準(zhǔn)確鑒定的目的。

1.3 DNA提取和儲(chǔ)存

在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，選取一部分具有物種和地理代表性的樣本提取基因組總DNA。提取方法采用高鹽法[16]。提取的總DNA溶于DEPC水或TE溶液，然后通過Thermo公司的Nanodrop 2000/2000C分光光度計(jì)檢測(cè)DNA產(chǎn)品的OD260 nm、OD280 nm值，以及濃度和純度，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳（160 V、80 A）檢測(cè)DNA產(chǎn)品的質(zhì)量。符合實(shí)驗(yàn)要求的DNA樣本保存于-20℃冰箱中備用。

1.4 COⅠ基因PCR擴(kuò)增

線粒體COⅠ基因的PCR擴(kuò)增使用了2對(duì)引物，其中第一對(duì)參考FOLMER等[17]設(shè)計(jì)的引物；第二對(duì)是針對(duì)多毛綱環(huán)節(jié)動(dòng)物自行設(shè)計(jì)的特異性引物PolyCoⅠF2（5‘-TCCACTAATCAYAAAGAYATTGG-3’）和PolyCoⅠR4（5‘-GCGAGTCATCTAAATACTTTAAT-3’）。兩對(duì)引物使用前都經(jīng)梯度PCR驗(yàn)證，引物設(shè)計(jì)使用Primer 3軟件（http://primer3.ut.ee/）。根據(jù)引物的在已知COⅠDNA序列的位置，我們推算第一對(duì)引物可以擴(kuò)增出750 bp，第二對(duì)可擴(kuò)增出約900 bp的DNA片段，所有引物均由上海生工生物有限公司合成。

PCR 總體積為 25 μL 體系，反應(yīng)體系為 1×Taq MasterMix(Dye)12.5 μL，模板 DNA 1 μL（＜10 ng），正、反向引物各1 μL（0.4 μM），滅菌的雙蒸水9.5 μL。TaqMix為康維世紀(jì)有限公司的產(chǎn)品。擴(kuò)增反應(yīng)在PTC-100型PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)橄?4℃預(yù)變性4 min；之后運(yùn)行35個(gè)循環(huán)，即94℃變性45 s，46～48℃退火30 s，72℃延伸 1 min。循環(huán)結(jié)束后在72℃ 再延伸7 min使PCR產(chǎn)物穩(wěn)定。擴(kuò)增產(chǎn)物用Loading Buffer染色后，經(jīng)混有綠如藍(lán)熒光染料的1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，并用凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量。

1.5 DNA測(cè)序及序列分析

選取擴(kuò)增質(zhì)量良好的PCR產(chǎn)物寄往上海生工生物有限公司測(cè)序。每個(gè)樣本都采用了雙向引物測(cè)序，以確保所得序列的準(zhǔn)確性。

所得到的雙向序列采用Sequencher v5.4軟件 (Gene Codes)進(jìn)行核對(duì)、校正。校正好的序列采用BioEdit 7.0軟件比對(duì)，剪去引物和首尾測(cè)序質(zhì)量較差的部分，然后通過與GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）和BOLD數(shù)據(jù)庫中收錄的序列比對(duì)來確定物種。最后用MEGA 5.0軟件[18]對(duì)排列好的全部序列進(jìn)行Kimura雙參數(shù)（K-2-P）遺傳距離分析，并采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）聚類。聚類樹的置信度采用10 000次Bootstrap重采樣檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

通過對(duì)采集獲得的樣本進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、記錄，參考多毛類形態(tài)學(xué)分類著作，依據(jù)口前葉結(jié)構(gòu)、顎齒形狀和排列方式、疣足和剛毛結(jié)構(gòu)等主要形態(tài)學(xué)分類學(xué)標(biāo)志。本研究收集到的樣本共鑒定得到了8個(gè)多毛類物種，即雙齒圍沙蠶Perinereis aibuhitensis、威氏圍沙蠶P.wilsoni、獨(dú)齒圍沙蠶P.cultrifera、雜色偽沙蠶Pseudonereis variegata、雙管闊沙蠶Platynereis Bicanaliculata、短毛海鱗蟲Halosydna brevisetosa、巖蟲Marphysa sanguinea、四索沙蠶 Lumbrineris tetraura。其中 P.aibuhitensis、P.wilsoni、P.cultrifera三個(gè)物種隸屬于圍沙蠶屬 Perinereis；P.variegata屬于偽沙蠶屬 Pseudonereis；P.bicanaliculata屬于闊沙蠶屬Platynereis；Perinereis、Pseudonereis、Platynereis這三個(gè)屬都?xì)w于沙蠶目沙蠶科。H.brevisetosa屬于葉須蟲目背鱗蟲科的海鱗蟲屬Halosydna；而M.sanguinea和L.tetraura則都是屬于磯沙蠶目的物種，前者屬于磯沙蠶科巖蟲屬M(fèi)arphysa，后者是索沙蠶科索沙蠶屬Lumbrineris的物種，具體分類學(xué)信息見表1。

2.2 線粒體COⅠDNA序列分析

本研究獲得了13個(gè)樣本的線粒體COⅠDNA序列，其中12條是由第一對(duì)引物擴(kuò)增獲得，長(zhǎng)度約為680 bp；只有樣本KY129886是第二對(duì)引物擴(kuò)增獲得，長(zhǎng)度約為930 bp。所得的序列都編輯成長(zhǎng)度為590 bp的片段進(jìn)行變異指數(shù)、單倍型、遺傳距離以及聚類分析。分析表明，COⅠ片段中T，C，A，G的平均含量分別為31.4%，24.9%，26.7%，17.0%；A+T含量（58.1%）顯著高于G+C含量（41.9%）。具體見表1。

所有13條DNA都提交至GenBank。每一條序列都給予唯一的GenBank登錄號(hào)，對(duì)應(yīng)于樣本編號(hào)，以便后續(xù)的工作。BLAST搜索發(fā)現(xiàn)，只有部分序列樣本在GenBank中可找到相似度高于99%的同源序列（表1）。BOLD數(shù)據(jù)庫查找表明，除了KY129888、KY129889這兩個(gè)樣本所屬物種與KY129890所對(duì)應(yīng)物種沒有被BOLD確認(rèn)外，給出的其余物種與本研究得到的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。

一個(gè)來自于舟山東極島的樣本KY129886與GenBank參考序列（HM473396.1）相似度僅為88%。該參考序列的物種為Halosydna brevisetosa，2010年7月上傳至BOLD，標(biāo)本采集地為加拿大不列顛哥倫比亞省沿海。本研究中采自東極的一個(gè)樣本（GenBank登錄號(hào)KY129886）在BOLD數(shù)據(jù)庫中較早發(fā)布的H.brevisetosa序列相似度達(dá)100%。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果，KY129886可以認(rèn)定為H.brevisetosa。KY129888和KY129889這兩個(gè)樣本與GenBank參考序列（KC800623）相似度為94%；根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，它們應(yīng)屬于Perinereis wilsoni。但是BOLD數(shù)據(jù)庫中缺少該序列相應(yīng)的形態(tài)學(xué)和圖片信息，故本研究將其序列和形態(tài)學(xué)和圖片數(shù)據(jù)共同上傳于BOLD數(shù)據(jù)庫作為條形碼。此外，KY129890這個(gè)樣本與GenBank參考序列，KF733802的相似度達(dá)99%。在BOLD數(shù)據(jù)庫中缺乏這些序列的參考物種信息，結(jié)合本研究的形態(tài)學(xué)和分子學(xué)兩方面鑒定結(jié)果，我們認(rèn)為KY129890屬于Marphysa sanguinea。并將其序列和形態(tài)學(xué)和圖片數(shù)據(jù)共同上傳于BOLD數(shù)據(jù)庫作為條形碼。

2.3 聚類關(guān)系與遺傳距離

從圖2 NJ聚類樹上可以看出，13個(gè)樣本可清晰地分為8個(gè)物種，即雙齒圍沙蠶、威氏圍沙蠶、獨(dú)齒圍沙蠶、雜色偽沙蠶、雙管闊沙蠶、短毛海鱗蟲、巖蟲Marphysa sanguinea、及四索沙蠶。在NJ聚類關(guān)系中，圍沙蠶屬Perinereis的三個(gè)物種沒有形成單系群。在聚類樹上，采用形態(tài)學(xué)鑒定的八個(gè)物種與來自GenBank的八條參考物種序列相吻合，即 Pseudonereis variegata，Platynereis bicanaliculata，Perinereis wilsoni，P.cultrifera，P.aibuhitensis，Marphysa sanguinea，Lumbrineris tetraura，Halosydna brevisetosa. 與 JX503027、GU362685、KC800623、KC80062、KF611806、KF733802、EU352318、及 HM473400 分別聚成置信度極高（Bootstrapping值均為100%）的單系群。

表1 采集樣本的信息包括拉丁名、采集地、CO I DNA GenBank登陸號(hào)、A+T 含量、形態(tài)學(xué)鑒別的特征（觸角、觸手、觸須、眼、頜、顎齒）；以及來自GenBank參考物種序列的登陸號(hào)、BLAST 比對(duì)的相似度Tab.1 Sample information including scientific name, collection site, GenBank accession code for CO I DNA, A+T content, and characters used in morphological identification (palp, tentacle, tentacular cirri, eye, jaws), as well as accession code for reference sequence

本研究中的13條序列樣本屬于4個(gè)科，即沙蠶科Nereidae、磯沙蠶科Eunicidae、索沙蠶科Lumbrineridae和背鱗蟲（亞）科Lepidonotinae。沙蠶科Nereidae 包括3個(gè)屬Pseudonereis、Perinereis、Platynereis；磯沙蠶科Eunicidae有1個(gè)屬M(fèi)arphysa；索沙蠶科有1個(gè)屬Lumbrineris，背鱗蟲亞科Lepidonotinae有1個(gè)屬Halosydna。故按各個(gè)科物種計(jì)算種內(nèi)遺傳距離，由于沙蠶科Nereidae有3個(gè)屬Pseudonereis、Perinereis、Platynereis，故以此計(jì)算科內(nèi)種間遺傳距離。不同分類水平上，種內(nèi)、科內(nèi)種間及科間的Kimura雙參數(shù)距離數(shù)據(jù)匯總于表2。種內(nèi)平均遺傳距離為2.8%，在0.2%～14.3%的范圍內(nèi)波動(dòng)，而科內(nèi)種間平均遺傳距離為23.9%，在20.6%～26.9%的范圍內(nèi)波動(dòng)；科間平均遺傳距離為31.3%，在28.1%～35.5%范圍內(nèi)波動(dòng)。顯然，科內(nèi)種間平均遺傳距離遠(yuǎn)大于種內(nèi)平均遺傳距離，且前者最小值也大于后者最大值，兩者已形成了遺傳距離上的溝壑。

表2 基于13個(gè)多毛類樣本及8個(gè)參考物種CO I DNA序列計(jì)算得到的種內(nèi)、科間種內(nèi)及科間的K-2-P遺傳距離，包括平均值、最小值、及最大值Tab.2 The mean,minimum,and maximum values of K-2-P distances within species,between species within family and between families

圖2 基于COⅠDNA序列的多毛類NJ聚類樹Fig.2 NJ tree of polychaetes based on COⅠDNA sequences

3 討論

3.1 多毛類線粒體COⅠPCR的引物

與其他無脊椎動(dòng)物相同，多毛綱動(dòng)物COⅠDNA序列A+T含量較高。本研究所有樣本A+T的平均含量高達(dá)58.1%，其中Marphysa sanguinea的A+T含量最低為56.5%，而Halosydna brevisetosa則高達(dá)60.4%。A+T含量高一方面使得多毛類COⅠ基因序列PCR擴(kuò)增時(shí)必須要使用較其他類群更低的退火溫度，一般是48℃左右，H.brevisetosa等物種需要46℃。較低的退火溫度造成了PCR產(chǎn)物純度下降，增加了該物種COⅠDNA片段擴(kuò)增及測(cè)序的難度。另一方面，大量重復(fù)的A、T核苷酸，往往導(dǎo)致引物很難結(jié)合到模板DNA上，從而使PCR反應(yīng)終止。在本次研究中，特別是H.brevisetosa等幾個(gè)物種未能用FOLMER等[17]的引物擴(kuò)增出COⅠDNA片段。針對(duì)這一問題我們專門設(shè)計(jì)了適用于高A+T含量的多毛類物種COⅠDNA的一對(duì)特異性引物，即PolyCoⅠF2和PolyCoⅠR4。經(jīng)過測(cè)試，發(fā)現(xiàn)PolyCoⅠF2和PolyCoⅠR4這對(duì)引物組合擴(kuò)增效果比較穩(wěn)定，并成功測(cè)定了長(zhǎng)度為930bp的COⅠDNA序列，其中一條在此研究中報(bào)道。

對(duì)于A+T含量高的多毛類物種COⅠDNA序列來說，與FOLMER等的引物相比，新設(shè)計(jì)的引物跨過了A、T核苷酸大量重復(fù)的區(qū)域，特別是反向引物PolyCoⅠR4與FOLMER等的COⅠ2198相比，不但與正向引物相距更遠(yuǎn)，而且?guī)缀跬耆挥诙嗝怌OⅠ基因的序列保守區(qū)上，因此對(duì)于高A+T含量的多毛類物種，采用本研究設(shè)計(jì)的引物可以擴(kuò)增片段更長(zhǎng)、特異性更高的COⅠDNA片段，在多毛類環(huán)節(jié)動(dòng)物DNA條形碼研究中具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

3.2 多毛類分類與DNA條形碼數(shù)據(jù)庫

根據(jù)形態(tài)學(xué)，本研究共鑒定了8個(gè)物種，均得到了GenBank中DNA數(shù)據(jù)的有力支持，形態(tài)學(xué)與DNA鑒定結(jié)果一致。獲得的長(zhǎng)度為930 bp的一個(gè)樣本序列，以及長(zhǎng)度為680 bp的12個(gè)樣本序列都已上傳至GenBank。同時(shí)，條形碼圖片和形態(tài)學(xué)信息已上傳至BOLD數(shù)據(jù)庫。目前，BOLD數(shù)據(jù)庫中，關(guān)于多毛類的信息共有10 430條，其中鑒定到種分類階元的僅6 555條。相比其他類群，多毛類數(shù)據(jù)庫規(guī)模還極為有限，本研究在一定程度上使多毛類動(dòng)物條形數(shù)據(jù)庫得到有效擴(kuò)充，但仍需補(bǔ)充更多的樣本。

GenBank中僅有一個(gè)來自山東青島的威氏圍沙蠶COⅠDNA序列，尚缺少相關(guān)文獻(xiàn)支持，而且BOLD數(shù)據(jù)庫也沒有相應(yīng)的形態(tài)學(xué)和圖片信息。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過反復(fù)地形態(tài)學(xué)觀察，以及COⅠDNA序列比對(duì)認(rèn)為KY129888等兩個(gè)樣本屬于威氏圍沙蠶。得到的630 bp DNA序列及相關(guān)的圖片信息已上傳至BOLD數(shù)據(jù)庫暫作為該物種條形碼。由于劉瑞玉[19]編著的《中國海洋生物名錄》一書中，東海區(qū)并不是該物種的分布區(qū)，而且該3個(gè)COⅠ序列與青島報(bào)道的該物種相似度僅為94%，因此采自浙江沿海的P.wilsoni個(gè)體是否為隱生種還需要通過核DNA信息對(duì)比進(jìn)行驗(yàn)證。但是根據(jù)CHRISTOPHER等[20]在2006年的文章，可以推知P.wilsoni其實(shí)是屬于多齒圍沙蠶的一個(gè)類群。臺(tái)灣地區(qū)是多齒圍沙蠶主要分布區(qū)域，本研究采集到的該物種樣本均來自于浙江南部海域，該海區(qū)與臺(tái)灣海域相連，而且夏季黑潮的次表層水和臺(tái)灣海峽暖水團(tuán)混合形成臺(tái)灣暖流，沿著閩浙槽狀凹地北上，一直達(dá)到長(zhǎng)江口[21]。加上東南季風(fēng)影響勢(shì)力很大，多毛類幼蟲期的擔(dān)輪幼蟲營浮游生活，因此多齒圍沙蠶幼體很有可能隨洋流到達(dá)浙南、閩北一帶海域。此外，由于其翻吻Ⅲ區(qū)兩側(cè)各有一排圓錐形顎齒，而本地種多齒圍沙蠶并無這一特征。故我們認(rèn)為這幾個(gè)樣本屬于威氏圍沙蠶，而且很有可能與臺(tái)灣的威氏圍沙蠶屬于同一類群。但若要驗(yàn)證這一假設(shè)還需要臺(tái)灣的樣本作比較，從而進(jìn)一步說明其分布特點(diǎn)。

經(jīng)過COⅠDNA序列比對(duì)，采自蒼南的KY129876和象山的KY129877樣本屬于四索沙蠶L.tetraura。由于長(zhǎng)葉索沙蠶L.longiforlia和四索沙蠶在形態(tài)上極為相近，因此僅形態(tài)學(xué)鑒定很可能導(dǎo)致誤判，這也進(jìn)一步說明了DNA條形碼在海洋多毛類動(dòng)物分類學(xué)上有著巨大的優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用前景。

從Kimura雙參數(shù)的遺傳距離看，種內(nèi)平均遺傳距離為2.8%，而沙蠶科內(nèi)種間平均遺傳距離為23.9%，科內(nèi)種間距離遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于種內(nèi)距離。而且種內(nèi)和科內(nèi)種間遺傳距離之間存在明顯的分歧，說明COⅠ序列完全可以作為多毛類環(huán)節(jié)動(dòng)物分類鑒定的分子條形碼。

雖然多毛類多數(shù)類群的成體遷移能力較低，但幼體可浮游，因而分布范圍十分廣泛。這類海洋生物適應(yīng)能力極強(qiáng)，在多種生境下均可生存，因而又形成了適應(yīng)各地相應(yīng)生態(tài)環(huán)境的類群。來自于舟山東極貽貝養(yǎng)殖場(chǎng)的短毛海鱗蟲樣本經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)（BOLD數(shù)據(jù)庫相似度為100%）共同驗(yàn)證屬于短毛海鱗蟲。但是BLAST的結(jié)果顯示，該樣本與GenBank中的參考序列HM473396相似度僅為88%。由于本研究缺少該物種足夠的DNA序列樣本，因此下載了GenBank中的HM473396一起進(jìn)行分析和遺傳距離計(jì)算，由此造成該物種種內(nèi)遺傳距離高達(dá)13.48%。多毛綱屬于高級(jí)無脊椎動(dòng)物，起源于距今大約6億年的寒武紀(jì)時(shí)期，進(jìn)化歷史相當(dāng)漫長(zhǎng)[14]。加拿大不列顛哥倫比亞省和浙江省舟山東極島有太平洋的阻隔，且在漫長(zhǎng)的地質(zhì)時(shí)代里，這兩個(gè)地區(qū)沒有匯合過，反而隨著太平洋板塊的擴(kuò)大而不斷遠(yuǎn)離，地理隔離顯著[2]，因而來自于這兩個(gè)采樣點(diǎn)的短毛海鱗蟲群體長(zhǎng)期缺少基因交流，兩者的COⅠDNA序列可變位點(diǎn)的低頻突變也就分別被保留了下來。同時(shí)，由于該類群多附著于其他生物群落或者棲息于大的龍介蟲棲管中，其棲息地生態(tài)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定，受自然選擇壓力較小，因此在外形上并未發(fā)生明顯的分化，一些主要形態(tài)學(xué)鑒別特征仍然一致[1]。但是鑒于本研究的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，我們推測(cè)我國東海的短毛海鱗蟲群體和加拿大地區(qū)的群體已經(jīng)發(fā)生了分化。由于本研究分析的樣本數(shù)較少，因此未能充分驗(yàn)證東海的短毛海鱗蟲是否屬于隱生種，準(zhǔn)確鑒定還需要進(jìn)一步的數(shù)據(jù)支持。

此外，聚類結(jié)果顯示，圍沙蠶屬的三個(gè)物種不是一個(gè)單系群。由于圍沙蠶屬的物種都屬于全球范圍內(nèi)的廣布種，生物多樣性極高，因此不斷有隱生種被報(bào)道，且該屬所包含的物種也時(shí)常被調(diào)整，故該類群也是目前多毛類研究的一個(gè)熱門。隨著雙齒圍沙蠶的人工養(yǎng)殖的不斷規(guī)?；瑢?duì)該類群其他物種的研究也必將不斷深入。

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Development of DNA Barcode Reference Library for Polychaetous Annelids Identified from the Coastal Intertidal Zone of Zhejiang Coastal Sea

YAO Rui1,XIE Fei-ang2,YAN An-qi,et al
(1.National Engineering Research Center for Mariculture,Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022;2.Marine Science and Technology School of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China)

It remains a big challenge for accurate identification of marine polychaetous annelids solely depending on morphology.This study aimed to develop a DNA barcode reference library for polychaetes collected from intertidal zones of Zhejiang coastal sea during the period from January to October,2015.Samples were selected for mitochondrial COⅠDNA sequence analysis after morphological examination.Eight species from fourfamilies,i.e.Perinereis aibuhitensis,P.wilsoni,P.cultrifera,Pseudonereis variegata,Platynereis bicanaliculata,Halosydna brevisetosa,Marphysa sanguinea and Lumbrineris tetraura were identified from 13 COⅠ DNA sequences at the length of 680-930 bp;two sequences of P.wilsoni and two sequences of M.sanguinea are unavailable in BOLD’s collection;one sequence shares 88%similarity with a sequence of H.brevisetos on Gen－Bank;The average K-2-P distance within species is 2.8%and between species within family is 23.9%.The significant gap in K-2-P distance between-species and within-species suggests that COⅠsequence is suitable for DNA barcoding in Polychaeta.In addition,we designed a pair of primers for amplifying CO I DNA fragment of polychaete species,especially of species that have high A+T composition in the gene.

DNA barcoding;mitochondrial COⅠsequence;morphology;polychaete;Zhejiang coastal sea

Q959.192

A

1008－830X(2017)02－095－08

2016-11-02

科技部基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)（2014FY110500）

姚瑞（1992-），男，河南平頂山人，碩士研究生，研究方向：海洋生物學(xué).

陳永久（1969-），男，浙江舟山人，博士，副教授，研究方向：海洋生物學(xué).E-mail:yongjiu.chen@gmail.com