通過(guò)式固相萃取結(jié)合超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜篩查魚肉中多類獸藥殘留

李佩佩，張小軍，張 帥，嚴(yán)忠雍，陳 思，方 益，龍 舉

（浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316021）

通過(guò)式固相萃取結(jié)合超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜篩查魚肉中多類獸藥殘留

李佩佩，張小軍，張 帥，嚴(yán)忠雍，陳 思，方 益，龍 舉

（浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316021）

采用通過(guò)式固相萃取技術(shù)作為樣品凈化方法，液相色譜-四級(jí)桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜（HPLC-Q-TOF/MS）作為檢測(cè)手段，建立了水產(chǎn)品中磺胺類、β-內(nèi)酰胺類、頭孢類、苯并咪唑類衍生物、氟喹諾酮類等37種獸藥的高通量快速篩查技術(shù)。樣品經(jīng)80%乙腈水溶液提取，Oasis PRiME HLB固相萃取小柱通過(guò)式凈化，分析物經(jīng)Waters ACQUITY UPLC BEH C18反相柱分離，以0.1%甲酸水溶液-乙腈作為流動(dòng)相梯度洗脫，電噴霧正離子模式檢測(cè)，以保留時(shí)間、化合物精確分子離子質(zhì)量和特征碎片離子質(zhì)量對(duì)藥物進(jìn)行定性定量分析。37種獸藥在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.98，定量限為5.0～50 μg/kg，3個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率為66.2%-86.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=5）均小于15.0%。本方法前處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)快速高效準(zhǔn)確，適用于實(shí)際水產(chǎn)品中多種獸藥的篩查和確證。將建立的方法應(yīng)用于農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)、浙江省風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)和舟山市投入品篩查等的獸藥殘留的篩查工作中，篩查出一例利福平殘留和一例紅霉素殘留。

獸藥殘留；通過(guò)式固相萃?。怀咝б合嗌V-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜；魚肉

目前，添加不同類別和功效的“復(fù)合抗生素”、使用新型獸藥代替重點(diǎn)監(jiān)管種類、將人用抗生素添加到水產(chǎn)品中等行為導(dǎo)致了水產(chǎn)品中獸藥殘留問(wèn)題愈加復(fù)雜。獸藥殘留不僅會(huì)污染環(huán)境，更會(huì)通過(guò)食物鏈的富集作用最終危害人體健康[1-2]。目前的水產(chǎn)品抽查僅針對(duì)幾種常用獸藥進(jìn)行定量檢測(cè)，對(duì)于不常用的種類很少關(guān)注，雖然有些風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目新增了可能使用的獸藥品種，但檢測(cè)方法仍以分類定量檢測(cè)為主[3-10]，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，效率不高，不能實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品中多種獸藥的全面快速篩查。三重四級(jí)桿質(zhì)譜具備檢出限低和靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，可同時(shí)定量測(cè)定幾類藥物，但不能對(duì)化合物進(jìn)行精確相對(duì)分子質(zhì)量和斷裂途徑的測(cè)定。四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜屬于高分辨質(zhì)譜，能測(cè)定得到精確質(zhì)量數(shù)（精確到小數(shù)點(diǎn)后4位），還可通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行一級(jí)和二級(jí)質(zhì)量數(shù)匹配以確證化合物的存在[11-14]。在實(shí)際應(yīng)用中，可以先利用UPLC-QTOF-MS對(duì)多種藥物開展高通量篩查，在大量樣品中排查出獸藥，然后再利用UPLC-MS/MS對(duì)結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確定量確證。這樣的技術(shù)路線可以大大縮短樣品分析時(shí)間、減少人力物力消耗、提高檢測(cè)效率。

水產(chǎn)品中富含脂肪、磷脂、蛋白等基質(zhì)干擾物質(zhì)，樣品前處理直接影響檢測(cè)結(jié)果。目前水產(chǎn)品中抗生素殘留檢測(cè)的凈化方法主要采用HLB固相萃取法[3,7,9]、QuEChERS方法等。有別于現(xiàn)有方法，本文采用的通過(guò)式固相萃取技術(shù)，以O(shè)asis PRiME HLB柱凈化樣品，上樣前無(wú)需活化和平衡，直接將樣品溶液加載到SPE柱上，比傳統(tǒng)的SPE柱操作簡(jiǎn)便。其填料是一種反相固體萃取吸附劑，是在水可浸潤(rùn)性O(shè)asis吸附劑為基礎(chǔ)而特殊設(shè)計(jì)的一種SPE。目前通過(guò)式固相萃取方法在篩查和快速檢測(cè)水產(chǎn)品中全氟化合物、青霉素等藥物中有良好的吸附脂肪和磷脂類化合物等雜質(zhì)和富集效果[15-16]。在保證凈化效果的同時(shí)簡(jiǎn)化了前處理步驟。本文通過(guò)建立的篩查數(shù)據(jù)庫(kù)，可以對(duì)目標(biāo)未知化合物進(jìn)行快速篩查與鑒定。將方法應(yīng)用于篩查實(shí)際樣品，篩查出的獸藥再通過(guò)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）進(jìn)一步定量分析，可保證結(jié)果的可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

41種標(biāo)準(zhǔn)品包括磺胺喹惡啉、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基異惡唑、磺胺二甲異惡唑、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺對(duì)甲氧基嘧啶、磺胺吡啶、雙氯西林、萘夫西林、青霉素V鉀、氨芐西林、頭孢匹羅、頭孢氨芐、頭孢哌酮、頭孢喹肟、頭孢噻呋、諾氟沙星、依諾沙星、達(dá)氟沙星、沙拉沙星、麻保沙星、司帕沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、雙氟沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、惡喹酸、氟甲喹、萘啶酸、紅霉素、利福平、甲苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑均購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司（純度為98.5%-99.0%）；乙腈、甲醇、甲酸為色譜純；試驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

準(zhǔn)確稱量各標(biāo)準(zhǔn)樣品10.0 mg,置于10 mL容量瓶中，根據(jù)各類獸藥的化學(xué)性質(zhì)，用乙腈或者甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的儲(chǔ)備液，置于-18℃保存，部分不易溶解的氟喹諾酮類物質(zhì)先用少量甲酸溶解，再加乙腈稀釋定容。各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液臨用時(shí)取出，待其恢復(fù)至室溫時(shí)依據(jù)需要用水稀釋成適宜濃度的工作液。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters Acquity超高效液相色譜儀-高分辨-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Waters Xevo G2-S QTof-MS）（美國(guó)Waters公司）；AcquityTM型超高效液相色譜儀（UPLC，美國(guó)Waters公司）；Quattro Premier XE串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）；T18勻漿機(jī)（德國(guó)IKA公司）；IKA MS2漩渦混合器（德國(guó)IKA公司）；Centrifuge 5810高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；VisiprepTMDL固相萃取裝置（美國(guó)Supelco公司）；NEVAP112氮吹儀（美國(guó)Organomation公司）；0.22 μm過(guò)濾膜（美國(guó)Waters公司）；Waters Oasis PRiME HLB固相萃取柱（6 mL，500 mg）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

魚肉樣品（草魚、鯉魚、大菱鲆、大黃魚、烏鱧、羅非魚等）來(lái)自于河南、上海、溫州、舟山等地的水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，按照SC/T 3016的規(guī)定處理后于-18℃密封保存。使用前先解凍。

取均質(zhì)好的樣品2.0 g于15 mL聚丙烯（PP）離心管中，加入80%乙腈水溶液6 mL，旋渦振蕩2 min，超聲提取5 min，8 000 r/min高速離心5 min，移取上清液至10 mL比色管中，用80%乙腈水溶液定容至8 mL。取4 mL上清液直接加載到PRiME HLB固相萃取柱上，控制流速為1滴/s。準(zhǔn)確移取3 mL流出液在45℃水浴下氮?dú)獯抵列∮?.6 mL，殘留液體用10%乙腈水溶液定容至1.00 mL，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，上機(jī)測(cè)試。

1.3.2 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。流動(dòng)相 A 為 0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈。流量0.45 mL/min。柱溫40℃；進(jìn)樣量3 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program of mobile phase

1.3.3 質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧正離子源；掃描模式為Full Scan/MSE；檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；毛細(xì)管電壓為3.0 kV；錐孔電壓為35 V;離子源溫度為120℃；脫溶劑氣溫度為380℃；錐孔反吹氣為高純氮?dú)?，流速?0 L/h；脫溶劑氣為高純氮?dú)?，流速?00 L/h；運(yùn)行時(shí)間為15 min。Source Acquisition Mode、Da Range及Collision Energy根據(jù)37種獸藥的特性選擇調(diào)試合適的條件，低碰撞為0 V，高碰撞能為20-30 V；質(zhì)量掃描范圍為100-1 000 Da；采用2.0 μg/L亮氨酸腦啡肽（分子量為556.277 1/554.261 5（+/-））進(jìn)行實(shí)時(shí)校準(zhǔn)以保證目標(biāo)物的質(zhì)量數(shù)精度。

2 結(jié)果與討論

2.1 篩查數(shù)據(jù)庫(kù)的建立及分析

配制各獸藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化好的色譜-質(zhì)譜條件下進(jìn)樣,采用全掃描模式對(duì)每一種目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)品在不同的碰撞電壓下進(jìn)行進(jìn)行MS/MS掃描，收集母離子和子離子的碎片信息。采用MassLynxChromlynx軟件建立抗生素的篩查數(shù)據(jù)庫(kù)。表2列出了篩查數(shù)據(jù)庫(kù)中化合物的名稱、分子式、母離子、保留時(shí)間和質(zhì)譜碎片離子信息。各個(gè)物質(zhì)的的準(zhǔn)分子離子峰的提取范圍為±0.005 Da，保留時(shí)間偏差范圍設(shè)為小于0.3 min。通過(guò)比對(duì)實(shí)測(cè)和數(shù)據(jù)庫(kù)中目標(biāo)物的保留時(shí)間、精確相對(duì)分子質(zhì)量、同位素峰形即可進(jìn)行快速準(zhǔn)確篩查。根據(jù)歐盟2002/657/EC決議[17]規(guī)定高分辨質(zhì)譜需滿足4.5分的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)到1個(gè)具有精確質(zhì)量數(shù)的母離子獲得2個(gè)確證分?jǐn)?shù)，二級(jí)質(zhì)譜中的每個(gè)子離子獲得2.5個(gè)確證分?jǐn)?shù)。因此本實(shí)驗(yàn)選取1個(gè)母離子和1個(gè)特征碎片離子則可以滿足確證要求。為驗(yàn)證篩查方法的可靠性，向空白魚肉樣品中加入37種目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液后按照1.3.1前處理后上機(jī)測(cè)試。加標(biāo)水平為50 μg/kg。結(jié)合本文建立的數(shù)據(jù)庫(kù)，37種獸藥均能被確證。圖1是魚肉中添加37種目標(biāo)物的提取離子流圖。

圖1 37種獸藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取離子流圖Fig.1 High resolution extracted ion chromatograms of 37 veterinary drugs

表2 37種獸藥的分子式、保留時(shí)間、精確分子量以及質(zhì)譜碎片離子信息Tab.2 Formulas,retention times,exact molecular weight and MS fragmentation data of 37 veterinary drugs

2.2 色譜條件的優(yōu)化

分析物中大部分為極性化合物，實(shí)驗(yàn)選取適用范圍廣的ACQUITY UPLC BEH C18柱進(jìn)行分離。由于篩查涉及的抗生素種類多，采用適用范圍廣的流動(dòng)相組成。采用ESI+源，選擇0.1%甲酸水溶液和乙腈作為流動(dòng)相。水相中加入甲酸可明顯改善酸堿化合物的峰形，提高響應(yīng)強(qiáng)度；分析物在乙腈中的離子化效率和靈敏度高于甲醇。良好的色譜分離條件能夠盡可能分離多種物質(zhì)，使質(zhì)譜在合適的掃描頻率范圍內(nèi)得到最佳靈敏度，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的梯度洗脫條件見表1。37種分析物在12 min內(nèi)出峰，峰形較為尖銳。

2.3 前處理的優(yōu)化

鑒于篩查涉及到多種結(jié)構(gòu)性質(zhì)不同的抗生素，因此需要一種相對(duì)通用的提取溶劑。乙腈、甲醇、乙酸乙酯是比較常見的提取試劑。乙酸乙酯提取物油脂含量較高，甲醇的提取液渾濁，乙腈具有一定的蛋白沉淀作用，鹽析效果相對(duì)較好，相比其他兩種溶劑提取物更干凈，有利于Q-TOF-MS分析。這個(gè)和很多研究選擇乙腈一致[3,12]。有些種類的抗生素具有親水性，因此向乙腈中加入適當(dāng)比例的水適合多種抗生素的提取。實(shí)驗(yàn)比較后發(fā)現(xiàn)80%乙腈水溶液作為提取液時(shí)既能使多目標(biāo)物質(zhì)的回收率在60%以上，又滿足Oasis PRiME HLB柱通過(guò)式凈化方式對(duì)高比例有機(jī)相的要求。Oasis PRiME HLB柱凈化能力優(yōu)于HLB柱，采用通過(guò)式凈化模式，無(wú)需淋洗和洗脫步驟，直接過(guò)柱。不僅有效凈化了樣品提取液，而且提高了前處理效率。實(shí)驗(yàn)通過(guò)綜合比較上樣量對(duì)樣品回收率的影響和Q-TOF-MS的儀器檢測(cè)靈敏度，確定了最佳上樣量。分別取2 mL、3 mL、4 mL、5 mL提取液直接過(guò)柱，接住流出液氮吹上機(jī)檢測(cè)計(jì)算回收率。結(jié)果表明，上樣液分別為2 mL、3 mL和4 mL時(shí)目標(biāo)物的回收率可達(dá)到90%以上，而上樣液為5 mL時(shí)目標(biāo)物回收率低于85%，且部分樣品過(guò)柱速度緩慢。此時(shí)提取液中所含雜質(zhì)過(guò)多引起堵塞。為了盡量保證較低的稀釋倍數(shù)，提高方法的靈敏度，選擇4 mL提取液過(guò)柱凈化。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

對(duì)于水產(chǎn)品等基質(zhì)復(fù)雜的樣品，普遍存在的基質(zhì)效應(yīng)影響測(cè)定結(jié)果精密度和準(zhǔn)確度。本研究通過(guò)配制基質(zhì)匹配工作溶液來(lái)消除基質(zhì)效應(yīng)的影響。分別采用空白草魚、大黃魚、羅非魚樣品制作基質(zhì)提取液和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，根據(jù)目標(biāo)藥物在質(zhì)譜中響應(yīng)的強(qiáng)弱加入不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)系列，得到每種物質(zhì)的線性范圍及相關(guān)系數(shù)。每個(gè)加標(biāo)濃度平行測(cè)定5次，按本方法進(jìn)行檢測(cè)，得到回收率為66.2%～86.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為4.52%～10.1%;按信噪比（S/N）大于等于 10 計(jì)算定量下限（LOQ）為 5.0～50 μg/kg。草魚中 37種獸藥的方法學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

2.5 實(shí)際應(yīng)用

將本文建立的方法應(yīng)用于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估項(xiàng)目的抗生素篩查中。采集大黃魚、鋸緣青蟹、鱸魚、美國(guó)紅魚、青蟹、梭子蟹等水產(chǎn)品種共50批次樣品。利用篩查軟件以±0.05 Da的質(zhì)量范圍提取化合物的準(zhǔn)分子離子峰，保留時(shí)間偏差范圍設(shè)為小于0.3 min。結(jié)果在大部分樣品中未檢出37種目標(biāo)化合物。在一個(gè)樣品中篩查出利福平殘留，在一個(gè)樣品中篩查出一例紅霉素殘留。篩出紅霉素藥物樣品的總離子流圖如圖2。將陽(yáng)性樣品的二級(jí)質(zhì)譜圖和紅霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的二級(jí)質(zhì)譜圖（圖3）相比較，兩者除母離子m/z 734外,均有4個(gè)碎片離子m/z 576、558、522和158，碎片離子分子量的偏差均小于30 mDa。根據(jù)歐盟2002/657/EC的規(guī)定可以對(duì)紅霉素進(jìn)行定性。為獲得精確的含量，再對(duì)樣品進(jìn)行液質(zhì)法測(cè)定精確含量。按照GB 29684-2013方法，經(jīng)測(cè)定紅霉素含量為400 μg/kg。

圖2 篩查出紅霉素藥物的樣品的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatograms of erythromycin from sample

圖3 紅霉素在溶劑（a）和在樣品（b）中的MS/MS質(zhì)譜圖Fig.3 MS/MS spectra of erythromycin in solvent(a)and sample(b)

表3 37種獸藥的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、定量限Tab.3 Linear ranges，correlation coefficients(r),recoveries，relative standard deviations and limits of quantitation(LOQ)of 37 target compounds

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了乙腈/水提取，PRiME HLB柱凈化，飛行時(shí)間質(zhì)譜法高通量篩查水產(chǎn)品中多種抗生素和獸藥殘留的技術(shù)方法。與其它高通量篩查方法相比，由于采用了通過(guò)式固相萃取凈化，整體實(shí)驗(yàn)操作更簡(jiǎn)便，耗時(shí)更短，而方法回收率和精密度等參數(shù)和其他方法一致。依據(jù)優(yōu)化好的條件建立了藥物精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)，外標(biāo)法定量完成了實(shí)際樣品中藥物的篩查、確證與定量。本方法前處理簡(jiǎn)便，確證準(zhǔn)確，適用于大批量樣品中多種獸藥的快速篩查。可為保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全提供技術(shù)支持。

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[16]郭萌萌,李兆新,王 智,等.通過(guò)式固相萃取凈化/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測(cè)水產(chǎn)品中11種青霉素殘留[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2017,36(3):337-342.

[17]European Commission.Commission Decision 2002/657/EC Implementing Council Directive 96/23/EC Concerning the Performance of Analytical Methods and Interpretation of Results 2002[Z].2002.

Screening and Confirmation of Multi-classes of Veterinary Drug Residues in Fish Muscle by Pass-Through SPE Purification and Ultra Performance Liquid Chromatography Coupled with Quadrupole/Time of Flight Mass Spectrometry

LI Pei-pei,ZHANG Xiao-jun,ZHANG Shuai,et al
（Marine and Fishery Research Institute of Zhejiang Ocean University,Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang Province,Key Lab of Sustainable Utilization of Technology Research for Fishery Resource of Zhejiang Province,Zhoushan 316021,China）

A method was developed for the rapid high-throughput screening of 37 veterinary drugs(including sulfonamides,β-lactam-antibiotics,cephalosporins,dibenzimidazole derivatives,quinolones)in aquaticproducts by solid phase extraction and liquid chromatography coupled with quadrupole/time of flight mass spectrometry(HPLC-Q-TOF/MS).The sample was extracted with acetonitrile-water(8:2,V/V),cleaned up by solid-phase extraction using Oasis PRiME HLB column.Then 37 target compounds were separated on a Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18 column (100 mm×2.1 mm,1.7 μm).In the process of quantification and qualification,37 drugs were detected under positive electrospray ionization(ESI+)based on retention time,accurate mass and fragmentions information.The separation were achieved by using gradient system consisting of 0.1%formic acid (V/V)-acetonitrile as the mobile phase.The linear ranges of the drugs were in good linearity with the correlation coefficients greater than 0.98.The limits of detection (LOD)were from 5 to 50 μg/kg.At the different spiked levels,the average recoveries were from 66.2%to 86.5%with the relative standard deviations (RSD)less than 15%.With high speed and sensitivity,this novel approach was suitable for the highthroughput and rapid screening analysis of veterinary drugs in aquatic products.The method has been applied to several projects for quality safety risk monitoring of aquatic products,and 2 kinds of veterinary drugs were detected.

veterinary residues;pass-through solid phase extraction;UPLC-Quadrupole/time of flight mass spectrometry;fish muscle

O657.63

A

1008－830X(2017)03－0228－07

2017-03-04

浙江省科技計(jì)劃公共服務(wù)項(xiàng)目（2016F30022）；浙江省自然科學(xué)基金（LY17C200009）

李佩佩（1986-），女，安徽宿州人，工程師，研究方向：漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測(cè)和水產(chǎn)品質(zhì)量安全.E-mail:liwanzhao999@163.com

張小軍，男，高級(jí)工程師，博士，研究方向：水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全.E-mail:xiaojun3627@163.com