高產(chǎn)靛藍(lán)色素大腸桿菌工程菌的構(gòu)建及靛藍(lán)色素穩(wěn)定性

, ,,,, ,*,,*

(1.北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京工商大學(xué),北京 100048;2.北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心,北京工商大學(xué),北京 100048;3.北京市經(jīng)濟(jì)管理學(xué)校,北京 100142)

高產(chǎn)靛藍(lán)色素大腸桿菌工程菌的構(gòu)建及靛藍(lán)色素穩(wěn)定性

杜靈燕1,2,張策3,車逸心1,劉雯嫻1,王孟菲1,尹勝1,2,*,王成濤1,2,*

(1.北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京工商大學(xué),北京 100048;2.北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心,北京工商大學(xué),北京 100048;3.北京市經(jīng)濟(jì)管理學(xué)校,北京 100142)

目前國內(nèi)外天然食用藍(lán)色素資源稀缺,利用微生物發(fā)酵制備的靛藍(lán)色素是天然藍(lán)色素的重要來源之一。本文克隆了假單胞菌B3的苯乙烯單加氧酶基因styAB,將其在大腸桿菌中進(jìn)行了異源超量表達(dá),構(gòu)建了高產(chǎn)靛藍(lán)色素的基因工程菌株E-AB,并研究了溫度和光照等環(huán)境因素對靛藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明,工程菌以吲哚為底物合成靛藍(lán)色素最高產(chǎn)量為68.9 mg/L,較野生型菌株提高約5.4倍。溫度和光照條件對靛藍(lán)色素色度穩(wěn)定性具有顯著性影響,低溫和避光條件能顯著延緩靛藍(lán)色素的降解,而高溫和紫外光則加速其降解;靛藍(lán)色素降解反應(yīng)較復(fù)雜,靛紅是主要的降解產(chǎn)物之一。研究結(jié)果將為天然靛藍(lán)色素的高效生物轉(zhuǎn)化制備及應(yīng)用提供了理論支持和技術(shù)指導(dǎo)。

靛藍(lán)色素,基因工程菌株,苯乙烯單加氧酶,發(fā)酵,色素穩(wěn)定性

靛藍(lán)又名藍(lán)靛、靛青,是一種廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、印染和化妝品等行業(yè)的古老傳統(tǒng)色素[1-2]。天然靛藍(lán)色素主要從木藍(lán)、菘藍(lán)、蓼藍(lán)、馬藍(lán)、野青樹等植物中提取,顏色鮮艷而耐久,安全性高。隨著藍(lán)色素市場需求不斷擴(kuò)大,傳統(tǒng)植物提取法受到資源、成本以及工藝技術(shù)限制,逐漸被化學(xué)合成法所替代。我國目前廣泛使用的化學(xué)合成靛藍(lán)色素主要是“亮藍(lán)”和“亮藍(lán)鋁色淀”?；瘜W(xué)合成法具有生產(chǎn)工藝簡便、色素產(chǎn)量高且穩(wěn)定等優(yōu)勢,但因使用苯胺、硝基苯等化工原料,產(chǎn)生有毒廢料廢水,危害環(huán)境和人體健康,不符合“環(huán)境友好型”、“生產(chǎn)者友好型”的發(fā)展要求。因此,新型“綠色制備技術(shù)”是靛藍(lán)色素制造的重要發(fā)展方向[3]。上世紀(jì)90年代,研究者首次報(bào)道了微生物合成靛藍(lán)色素現(xiàn)象[4-7]。后期研究發(fā)現(xiàn),具有合成靛藍(lán)能力的微生物大多數(shù)都是芳烴降解菌,通過單加氧酶或雙加氧酶催化吲哚或其氧化物合成靛藍(lán)色素。與化學(xué)合成色素相比,微生物發(fā)酵不受原料資源限制,且具有高效、高選擇性、條件溫和以及綠色安全等特點(diǎn)。野生型菌株催化合成靛藍(lán)體系中因存在旁路反應(yīng)、副反應(yīng),靛藍(lán)產(chǎn)量一般較低。因此,利用基因工程技術(shù)構(gòu)建催化靛藍(lán)合成關(guān)鍵酶的超量表達(dá)菌株,是提高靛藍(lán)生物合成量的有效途徑[8-11]。

本課題組在前期研究中,篩選獲取具有靛藍(lán)合成能力的野生型菌株假單胞菌B3(PseudomonasputidaB3),明確了其是以吲哚為底物由styAB基因編碼的苯乙烯單加氧酶(SMO)催化合成靛藍(lán)色素。該靛藍(lán)色素合成途徑單一,無副產(chǎn)物生成,是靛藍(lán)色素的高效轉(zhuǎn)化途徑[12]。為實(shí)現(xiàn)SMO異源超量表達(dá)和靛藍(lán)色素高效合成,本研究擬通過基因工程技術(shù),在大腸桿菌中超量表達(dá)styAB基因,構(gòu)建靛藍(lán)色素高效轉(zhuǎn)化菌株[13-20]。

靛藍(lán)色素是一種脂溶性偶氮類色素,能夠溶解于少數(shù)幾種有機(jī)溶劑,且穩(wěn)定性較差,容易褪色[21-24]。目前關(guān)于環(huán)境因素對靛藍(lán)穩(wěn)定性的研究較少,靛藍(lán)降解機(jī)制仍不明確。因此本研究將探究不同的光照和溫度環(huán)境因素對天然靛藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響,并通過分析靛藍(lán)色素降解產(chǎn)物初探其降解機(jī)制,旨在為靛藍(lán)色素工業(yè)化生產(chǎn)制備和應(yīng)用提供理論支持和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

PseudomonasputidaB3、大腸桿菌表達(dá)載體質(zhì)粒pET-28a 由本實(shí)驗(yàn)室保存;EscherichiacoliDH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞 北京天根生化科技有限公司;靛藍(lán)、靛紅、吲哚、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇等 半夏生物科技有限公司;PrimeSTAR Max Premix(2×)DNA聚合酶、核酸限制性內(nèi)切酶BamHI、HindIII和T4 DNA連接酶等 寶生物工程(大連)有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、高純質(zhì)粒小量制備試劑盒和多功能DNA純化回收試劑盒 北京天根生化科技有限公司;LB液體、固體培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基 按文獻(xiàn)配制[17]。

C1000 Touch PCR儀、PowerPac Basic電泳儀(水平電泳槽) 美國BIO-RAD公司;3K15高速離心機(jī) 美國SIGMA公司;SPX-150B生化培養(yǎng)箱 上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司;1290 Infinity高效液相色譜 美國Agilent Technologies公司;CM-3610色差儀 日本柯尼卡美能達(dá)公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 苯乙烯單加氧酶基因styAB的克隆及表達(dá)載體pET28a-styAB的構(gòu)建 提取野生型菌株P(guān)seudomonasputidaB3基因組作為模板,按照GenBank中苯乙烯單加氧酶基因序列(Accession no. DQ177365.1)設(shè)計(jì)引物:

F-AB-BamHI(CGGGATCCATGAAAAAGCGT ATCGGTATTG)

R-AB-HindIII(CCCAAGCTTTCAATTCAGTGG CAACGGGTT)。

利用PCR技術(shù)擴(kuò)增styAB基因,電泳檢測,純化回收并測序分析。目的基因和質(zhì)粒pET-28a經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切并純化回收,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài),在含有50.0 μg/mL卡那霉素LB固體培養(yǎng)基平板上篩選陽性重組子;挑取單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng),提取質(zhì)粒,酶切鑒定并測序分析,篩選獲得構(gòu)建正確的表達(dá)載體pET28a-styAB。

1.2.2styAB基因表達(dá)工程菌E-AB的構(gòu)建及培養(yǎng)方式 將表達(dá)載體pET28a-styAB化學(xué)轉(zhuǎn)化至宿主菌E.coliBL21(DE3),于含有50.0 μg/mL卡那霉素LB固體培養(yǎng)基平板上篩選獲得陽性重組子E-AB。培養(yǎng)方式:挑取單菌落E-AB接種至含50.0 μg/mL卡那霉素LB液體培養(yǎng)基中,于37 ℃,200 r/min過夜培養(yǎng);按1%接種量重新接種至新鮮LB液體培養(yǎng)基中,當(dāng)OD600達(dá)0.4時(shí),加入0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng);至OD600為0.8,收集菌液(二級種子液)備用。

1.2.3 靛藍(lán)色素發(fā)酵制備 分別制備P.putidaB3和E-AB二級種子液,按1.0%接種至50.0 mL含吲哚濃度為40.0、80.0、120.0、160.0、200.0和240.0 μg/mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中,30 ℃,200 r/min培養(yǎng)24 h,測定發(fā)酵液中靛藍(lán)產(chǎn)量。

1.2.4 靛藍(lán)濃度的測定

1.2.4.1 酶標(biāo)儀法測定發(fā)酵液中靛藍(lán)產(chǎn)量 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:將靛藍(lán)標(biāo)品用N,N-二甲基甲酰胺溶解定容成50.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,然后依次稀釋成7.0、9.0、11.0、13.0和15.0 μg/mL的濃度梯度,用酶標(biāo)儀測定610 nm波長處吸光值,以濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=0.0507X-0.0227，R2=0.999。

發(fā)酵培養(yǎng)基接入底物色氨酸反應(yīng)一段時(shí)間后,9000 r/min離心20 min,沉淀物加入適量N,N-二甲基甲酰胺,超聲處理20 min,待沉淀全部溶解后用酶標(biāo)儀測定610 nm波長處吸光值,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算靛藍(lán)濃度。

1.2.4.2 高效液相法測定靛藍(lán)濃度 采用高效液相色譜發(fā)測定靛藍(lán)濃度,色譜條件為:C18色譜柱;流動相:甲醇∶水(60∶40);柱溫:30 ℃;流速:100 μL/min;紫外檢測波長:298 nm;進(jìn)樣量:1 μL,出峰時(shí)間2.1 min[17]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:將靛藍(lán)標(biāo)品用DMF溶解定容成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,然后依次稀釋成70.0、60.0、40.0、20.0、10.0 μg/mL的濃度梯度,用高效液相色譜測定298 nm波長處吸收峰面積,以濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=9.3582X+35.296，R2=0.993。

1.2.5 高效液相法測定靛紅濃度 采用高效液相色譜測定靛紅濃度,除出峰時(shí)間為1.2 min外,具體條件同1.2.4.2,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=11.048X+23.685，R2=0.996。

1.2.6 靛藍(lán)和靛紅DMF溶液色差測定 取適量靛藍(lán)和靛紅標(biāo)品DMF溶液分別注入石英石比色皿內(nèi),用色差儀測量溶液的L*值(亮度值)、a*值(綠值)、b*值(藍(lán)值),并根據(jù)公式計(jì)算色差ΔE。

ΔE=(ΔL*2+Δa*2+Δb*2)1/2

式中,ΔL*-樣品與初始標(biāo)準(zhǔn)品亮度差;Δa*-樣品與初始標(biāo)準(zhǔn)品綠值差;Δb*-樣品與初始標(biāo)準(zhǔn)品藍(lán)值差。

1.2.7 環(huán)境因素對靛藍(lán)穩(wěn)定性影響 以靛藍(lán)、靛紅含量和色差指標(biāo),研究不同溫度和光照對靛藍(lán)穩(wěn)定性的影響。

1.2.7.1 光照對靛藍(lán)穩(wěn)定性影響 取100 mL 70.0 μg/mL靛藍(lán)標(biāo)品DMF溶液注入數(shù)個(gè)無菌小瓶中,室溫靜置,分別置于紫外線、自然光、避光條件下,每隔24 h取樣測定(紫外條件下每隔1 h取樣)溶液中靛藍(lán)、靛紅含量以及與靛藍(lán)、靛紅初始標(biāo)準(zhǔn)DMF溶液的色差,平行重復(fù)三次,取平均值進(jìn)行計(jì)算。

1.2.7.2 溫度對靛藍(lán)穩(wěn)定性影響 取100 mL 70.0 μg/mL靛藍(lán)標(biāo)品DMF溶液注入數(shù)個(gè)無菌小瓶中,室溫靜置,分別置于4 ℃、室溫和37 ℃條件下,每隔24 h取樣測定溶液中靛藍(lán)和靛紅含量、色度,平行重復(fù)三次,取平均值進(jìn)行計(jì)算。

1.3數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理平行重復(fù)3次,采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和分析,采用Excel進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1苯乙烯單加氧酶基因styAB的克隆及重組表達(dá)載體pET28a-styAB的構(gòu)建

以PseudomonasputidaB3全基因組為模板,PCR擴(kuò)增styAB基因,經(jīng)電泳檢測,擴(kuò)增條帶約為1900 bp(圖1);將純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序分析,其核苷酸序列與GenBank中報(bào)道[11]的假單胞菌苯乙烯單加氧酶基因相似度達(dá)100%。將經(jīng)雙酶切的styAB基因PCR產(chǎn)物插入表達(dá)載體pET28a中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-styAB。酶切鑒定電泳圖(圖2)表明,7400 bp的重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后呈現(xiàn)1900 bp和5500 bp兩條條帶,分別與styAB基因PCR產(chǎn)物和空載質(zhì)粒pET28a大小一致,表明重組表達(dá)載體pET28a-styAB構(gòu)建成功。

圖1 styAB基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of the styAB gene PCR product注:M:DL2000 DNA Marker;1、2:styAB基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖2 重組質(zhì)粒pET28a-styAB雙酶切電泳圖Fig.2 Double digestion of the recombinant plasmid pET28a-styAB注:M:DL10000 DNA Marker;1:重組質(zhì)粒pET28a-styAB雙酶切電泳條帶。

2.2styAB基因表達(dá)工程菌E-AB的構(gòu)建及靛藍(lán)色素發(fā)酵

將質(zhì)粒pET28a-styAB轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,在含卡那霉素的LB抗性平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子,獲得工程菌株E-AB。將工程菌株E-AB接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,發(fā)酵培養(yǎng)液中呈現(xiàn)大量藍(lán)色顆粒沉淀,而野生型菌株E.coliBL21(DE3)中并未出現(xiàn)藍(lán)色顆粒沉淀,表明苯乙烯單加氧酶styAB基因在工程菌株E-AB中成功表達(dá),具有催化吲哚合成靛藍(lán)色素的能力。此外,通過與野生型靛藍(lán)合成菌株P(guān)seudomonasputidaB3對比底物吲哚不同濃度下靛藍(lán)色素產(chǎn)量,發(fā)現(xiàn)二者有明顯差異(圖3)。如圖3所示,隨著吲哚濃度的增加,兩株菌靛藍(lán)產(chǎn)量均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,出現(xiàn)此現(xiàn)象與吲哚對菌體的毒副作用相關(guān)。此外,明顯發(fā)現(xiàn)PseudomonasputidaB3在吲哚濃度為80.0 μg/mL時(shí),靛藍(lán)產(chǎn)量最高為10.8 mg/L,而E-AB在濃度為160.0 μg/mL時(shí),靛藍(lán)產(chǎn)量最高為68.9 mg/L,較野生型菌株提高近5.4倍?？梢奅-AB能明顯提高吲哚的利用量,顯著提高靛藍(lán)色素產(chǎn)量(p<0.05)。上述結(jié)果表明,styAB基因大腸桿菌異源表達(dá),可實(shí)現(xiàn)苯乙烯單加氧酶的高效表達(dá),進(jìn)一步提高靛藍(lán)色素產(chǎn)量。

圖3 吲哚濃度對Pseudomonas putida B3和E-AB產(chǎn)靛藍(lán)色素的影響Fig.3 The effect of indole concentration on indigo production from Pseudomonas putida B3 and E-AB

2.3環(huán)境因素對靛藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

2.3.1 不同光照條件下靛藍(lán)色素溶液顏色和物質(zhì)含量的變化 前期研究發(fā)現(xiàn),靛藍(lán)色素DMF溶液顏色隨時(shí)間不斷變化,由最初的藍(lán)色最終變化為橘紅色,該顏色與靛紅DMF溶液顏色接近[21-23]。為了揭示靛藍(lán)色素DMF溶液的變化規(guī)律,研究了不同光照條件下靛藍(lán)色素DMF溶液顏色隨時(shí)間變化與初始靛藍(lán)和靛紅標(biāo)準(zhǔn)液顏色差異情況。結(jié)果如圖4所示。隨著時(shí)間增加,靛藍(lán)色素DMF溶液顏色與初始靛藍(lán)DMF標(biāo)準(zhǔn)液總色差不斷增加,即呈現(xiàn)與靛藍(lán)DMF標(biāo)準(zhǔn)液顏色差異增加的趨勢;而與初始靛紅DMF標(biāo)準(zhǔn)液總色差不斷減小,即顏色上不斷接近的趨勢。上述結(jié)果從色差水平說明靛藍(lán)色素DMF溶液在變化過程中可能有靛紅的生成,但因其與初始靛紅DMF標(biāo)準(zhǔn)液仍存在色差,說明可能有某種中間產(chǎn)物的存在。此外,不同光照條件下,呈現(xiàn)類似變化規(guī)律,但顏色變化速率明顯不同,光照對靛藍(lán)色素穩(wěn)定性影響極顯著(p<0.01)。自然光條件下,顏色緩慢變化,紫外線照射能顯著增加變化速率,避光處理能顯著延緩顏色變化。

圖4 不同光照條件下靛藍(lán)色素DMF溶液色度的變化 Fig.4 The colourity change of the indigo DMF solution under different light conditions注:A:避光和自然光條件下靛藍(lán)色素DMF溶液色度的變化; B:紫外光條件下靛藍(lán)色素DMF溶液色度的變化。

為了進(jìn)一步探究不同光照條件下靛藍(lán)色素DMF溶液色度變化的原因,利用高效液相色譜方法對靛藍(lán)色素DMF溶液中的靛藍(lán)和靛紅含量變化進(jìn)行了檢測。結(jié)果如圖5所示。自然光條件下,靛藍(lán)色素含量緩慢降低,72 h后靛藍(lán)降解量達(dá)到初始含量的50%以上,同時(shí)靛紅含量增加至靛藍(lán)初始量的65%。紫外光照射下,靛藍(lán)降解速率明顯加快,6 h后靛藍(lán)含量幾乎為0,而靛紅含量為靛藍(lán)初始量的16%;隨著時(shí)間增加,靛紅含量不斷增多,72 h靛紅含量增加至靛藍(lán)初始量的65%左右。避光條件下,72 h靛藍(lán)含量幾乎不變化且靛紅基本不生成。上述結(jié)果表明靛藍(lán)降解與靛紅生成具有正相關(guān)性,但二者變化速率存在差異。根據(jù)靛紅和靛藍(lán)結(jié)構(gòu)式可知,理論上一份子靛藍(lán)可降解為兩分子靛紅,而上述變化量明顯不符合上述規(guī)律,由此推測靛藍(lán)降解產(chǎn)物組成復(fù)雜,靛紅是主要產(chǎn)物,此外可能有其他中間產(chǎn)物生成。

圖5 不同光照條件下靛藍(lán)色素DMF溶液中靛藍(lán)和靛紅含量的變化Fig.5 The indigo and isatin concentration changes in the indigo DMF solution under different light conditions

2.3.2 不同溫度下靛藍(lán)色素溶液色度和物質(zhì)含量的變化 實(shí)驗(yàn)研究了不同溫度對靛藍(lán)色素DMF溶液穩(wěn)定性的影響。由圖6可知，色度變化監(jiān)測結(jié)果為不同溫度條件下,靛藍(lán)色素DMF溶液顏色變化速率呈顯著性差異(p<0.05),4 ℃下靛藍(lán)溶液色度變化受到顯著抑制,室溫條件下靛藍(lán)溶液色度變化緩慢,而37 ℃下色度變化速度明顯加快,但后期變化較慢,具體原因仍待進(jìn)一步確認(rèn)。由圖7可知，物質(zhì)含量的變化情況與光照條件下檢測結(jié)果相似,靛藍(lán)的降解與靛紅的生成同步發(fā)生,但其變化量無對應(yīng)關(guān)系,表明靛藍(lán)降解產(chǎn)物包括靛紅等多種成分。4 ℃下,靛藍(lán)色素降解速率和靛紅合成速率最低,30 h之前,隨著溫度的增加,速率明顯加快,30 h之后,室溫條件下的反應(yīng)速率明顯高于37 ℃下反應(yīng)速率,該結(jié)果與色度變化實(shí)驗(yàn)一致,具體原因仍待進(jìn)一步確認(rèn)。

圖6 不同溫度下靛藍(lán)色素DMF溶液色度的變化Fig.6 The colourity change of the indigo DMF solution at different temperature

圖7 不同溫度下靛藍(lán)色素DMF溶液中靛藍(lán)和靛紅含量的變化Fig.7 The indigo and isatin concentration changes in the indigo DMF solution at different temperature

3 結(jié)論

本研究利用基因工程技術(shù),通過異源表達(dá)苯乙烯單加氧酶基因styAB,構(gòu)建了高產(chǎn)靛藍(lán)色素大腸桿菌工程菌E-AB與野生型靛藍(lán)合成菌株對比,E-AB靛藍(lán)色素最高產(chǎn)量為68.9 mg/L,較野生型菌株最高產(chǎn)量提高約5.4倍,說明大腸桿菌可進(jìn)一步提高靛藍(lán)色素合成產(chǎn)量。進(jìn)一步研究了光照和溫度等環(huán)境因素對微生物產(chǎn)靛藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明,避光和低溫條件下,靛藍(lán)色素穩(wěn)定性較好,而高溫和紫外光等條件則加劇靛藍(lán)色素的降解。通過檢測靛藍(lán)色素降解過程中物質(zhì)含量和色度的變化,發(fā)現(xiàn)靛紅是靛藍(lán)色素降解的主要產(chǎn)物之一。綜上所述,靛藍(lán)色素的穩(wěn)定性與環(huán)境因素密切相關(guān),其降解機(jī)制復(fù)雜,仍有待進(jìn)一步研究。

[1]孫寶國. 食品添加劑[M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2008:25-58.

[2]徐春明,李婷,王英英,等. 食用藍(lán)色素及其使用現(xiàn)狀研究進(jìn)展[J]. 中國食品添加劑,2014(1):208-214.

[3]Sandberg G. Indigo Textiles:Technique and History[M]. London:A & C Black,1989.

[4]Shi K,Song D,Chen G,et al. Controlling composition and color characteristics of Monascus pigments by pH and nitrogen sources in submerged fermentation[J]. Journal of Bioscience & Bioengineering,2015,120(2):145-154.

[5]馬橋,曲媛媛,張旭旺,等. 靛藍(lán)的微生物合成研究新進(jìn)展[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2012(2):344-350.

[6]Pathak H,Madamwar D. Biosynthesis of indigo dye by newly isolated naphthalene-degrading strainPseudomonassp. HOB1 and its application in dyeing cotton fabric[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology,2010,160(6):1616-1626.

[7]韓曉紅,王偉,肖興國. 靛藍(lán)及其同類色素的微生物生產(chǎn)與轉(zhuǎn)化[J]. 生物工程學(xué)報(bào),2008(6):921-926

[8]Han G H,Bang S E,Babu B K,et al. Bio-indigo production in two different fermentation systems using recombinantEscherichiacoli,cells harboring a flavin-containing monooxygenase gene

(fmo)[J]. Journal of Biotechnology,2010,150(3):369.

[9]Yoo M,Kim D,Zylstra G J,et al. Biphenyl hydroxylation enhanced by an engineered o-xylene dioxygenase fromRhodococcus,sp. strain DK17[J]. Research in Microbiology,2011,162(7):724.

[10]Jeun J,Jung H,Kim J H,et al. Effect of the Monascus pigment threonine derivative on regulation of the cholesterol level in mice[J]. Food Chemistry,2008,107(3):1078-1085.

[11]O’Leary N D,O’Connor K E,Dobson A D W. Biochemistry,genetics and physiology of microbial styrene degradation[J]. FEMS Microbiology Reviews,2002,26(4):403-417.

[12]Beltrametti F,Marconi A M,Bestetti G,et al. Sequencing and functional analysis of styrene catabolism genes fromPseudomonasfluorescensST[J]. Applied & Environmental Microbiology,1997,63(6):2232.

[13]程雷,尹勝,孫寶國,等. 高產(chǎn)靛藍(lán)色素大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建及其發(fā)酵條件優(yōu)[J]. 食品科學(xué),2016(23):184-190.

[14]李陽,朱俊歌,王建軍,等. 組合蛋白質(zhì)工程和代謝工程設(shè)計(jì)全細(xì)胞催化劑合成靛藍(lán)和靛玉紅[J]. 生物工程學(xué)報(bào),2016(1):41-50.

[15]Han G H,Gim G H,Kim W,et al. Enhanced indirubin production in recombinantEscherichiacoliharboring a flavin-containing monooxygenase gene by cysteine supplementation[J]. Journal of Biotechnology,2012,164(2):179-187.

[16]Lin G H,Chen H P,Huang J H,et al. Identification and characterization of an indigo-producing oxygenase involved in indole 3-acetic acid utilization byAcinetobacterbaumannii[J]. Antonie van Leeuwenhoek,2012,101(4):881-890.

[17]曲媛媛,許炳雯,叢培,等. 兩相體系中固定化聯(lián)苯雙加氧酶全細(xì)胞產(chǎn)靛藍(lán)特性研究[J]. 大連理工大學(xué)學(xué)報(bào),2013(3):340-345.

[18]陸燕. 重組P450 BM3工程菌制備靛藍(lán)過程優(yōu)化、P450 BM3-GDH共表達(dá)體系建立及其在靛藍(lán)制備中的應(yīng)用研究[D]. 杭州:浙江大學(xué),2007.

[19]Qu Y,Ma Q,Zhang X,et al. Optimization of indigo production by a newly isolated Pseudomonas sp. QM[J]. Journal of Basic Microbiology,2012,52(6):687.

[20]肖其敏,徐天虹. 黃素單加氧酶在大腸桿菌中的表達(dá)及靛藍(lán)的生物合成[J]. 江蘇科技信息,2016(3):78-80.

[21]呂海濤,劉靜,單虎,等. 正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選大青葉中靛藍(lán)和靛玉紅的提取工藝[J]. 食品科技,2011(12):246-250.

[22]黃文平,黃鵬. 靛紅的合成與應(yīng)用[J]. 湖北科技學(xué)院學(xué)報(bào),1996(3):45-48.

[23]陳剛,郝小江. 靛紅生物活性研究進(jìn)展[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2010,22(2):356-360.

[24]袁霞. 靛藍(lán)對棉染色機(jī)理的研究進(jìn)展[J]. 上海紡織科技,2013,41(6):1-4.

ConstructionofgeneengineeredEscherichiacolistrainforhigh-yieldproductionofindigoanditsstability

DULing-yan1,2,ZHANGCe3,CHEYi-xin1,LIUWen-xian1,WANGMeng-fei1,YINSheng1,2,*,WANGCheng-tao1,2,*

(1.Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health,Beijing Technology & Business University,Beijing 100048,China;2.Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives,Beijing Technology & Business University,Beijing 100048,China; 3.Beijing Economic Management School,Beijing 100142,China)

As the natural food blue pigment sources are comparatively rare,microbial fermentation is an efficient way to produce the natural indigo pigment. In this study,the styrene monooxygenase genestyABwas cloned fromPseudomonasputidaB3 and then over-expressed inEscherichiacoli,generating the gene engineered strain E-AB for high-yield production of indigo. By fermentation conditions optimization,a maximum yield of 68.9 mg/L of indigo was obtained in E-AB using indole as the substrate,which was 5.4-fold higher than that of wild-type strain B3. The indigo stability was further investigated under different temperature and illumination conditions. High temperature and UV light obviously enhanced indigo degradation,while low temperature and light-proof condition could delay indigo degradation. And it was detected that isatin was the main degradation compound during indigo degradation. These results would provide the theoretical support and technical guidance for high efficient biotransformation preparation and application of the natural indigo pigment.

indigo;gene engineered strain;styrene monooxygenase;fermentation;pigment stability

2017-02-07

杜靈燕(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品微生物與發(fā)酵技術(shù)，E-mail：283604024@qq.com。

*通訊作者:尹勝(1983-)，男，博士，副教授，研究方向：食品微生物與發(fā)酵技術(shù)、食品安全，E-mail：yinsheng@btbu.edu.cn。 王成濤(1969-)，男，博士，教授，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：wct5566@163.com。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31401669,31571801)；北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(5154027)；2016年度大學(xué)生科學(xué)研究與創(chuàng)業(yè)行動計(jì)劃項(xiàng)目(19008001131)。

TS202.3

:A

:1002-0306(2017)16-0229-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.043