類芽孢桿菌BD3526在無氮固體培養(yǎng)基上產(chǎn)胞外多糖的研究

(乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室,上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心,光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院,上海 200436)

類芽孢桿菌BD3526在無氮固體培養(yǎng)基上產(chǎn)胞外多糖的研究

徐曉芬

(乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室,上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心,光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院,上海 200436)

為了研究Paenibacillusbovissp. nov BD3526在無氮培養(yǎng)基上產(chǎn)的胞外多糖的結(jié)構(gòu)和生物活性,本文制得了其在無氮培養(yǎng)基平板上分泌的胞外多糖,并用離子交換層析法對此胞外多糖進行分離純化,得到了一個主要組分的純品(F1);凝膠滲透色譜(GPC)的結(jié)果顯示F1的分子量是3.76×107Da,用紅外光譜(FT-IR)和核磁共振氫譜(1H NMR)表征其化學(xué)結(jié)構(gòu),結(jié)果表明F1是直鏈的左聚糖;熱重分析(TGA)和差示掃描量熱法(DSC)的結(jié)果表明左聚糖具有良好的熱穩(wěn)定性;動態(tài)光散射儀(DLS)測定其在水溶液中形成的聚集體的粒徑約為163.2 nm,而透射電鏡(TEM)照片表明其在水溶液中呈緊實的球型,粒徑在50～100 nm;最后采用細胞實驗評價其免疫增強作用,體外實驗結(jié)果表明此左聚糖在低濃度時即可顯著促進脾細胞的增殖,具有很強的免疫增強活性。此左聚糖可以作為免疫增強劑應(yīng)用于功能性食品領(lǐng)域。

胞外多糖,左聚糖,熱分析,免疫增強

類芽孢桿菌(Paenibacillus)屬于兼性厭氧或嚴格好氧菌,含有內(nèi)生孢子。這一種類曾歸屬在芽孢桿菌屬內(nèi),隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,1993年由Ash等人[1]應(yīng)用PCR探針技術(shù)將原屬于Bacillus的11個種分出來,建立了新屬,即類芽孢桿菌屬,此屬的細菌傾向會產(chǎn)生膨脹的、橢圓形的芽孢,并將Paenibacilluspolymyxa(多粘類芽孢桿菌)作為新屬的模式種。這個屬的細菌大多數(shù)來源于土壤,且在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用[2],如多粘類芽孢桿菌因其產(chǎn)具有眾多生理功能和生物活性的多糖、細菌素等而備受關(guān)注[3-8]。Paenibacillusbovissp. nov BD3526是Gao等人[9]從西藏牦牛奶中分離到的一種類芽孢桿菌,經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)其是類芽孢桿菌屬的一個新種,其在產(chǎn)糖培養(yǎng)基中產(chǎn)的胞外多糖是分子量大于2.6×106Da的直鏈左聚糖(levan),產(chǎn)量達36.25 g/L,具有免疫增強活性[10]。

大部分微生物胞外多糖具有獨特的理化性質(zhì)和生物活性,如抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、免疫增強等,此外,其生產(chǎn)過程可控、不受天氣季節(jié)影響,生產(chǎn)周期短,因此,被廣泛應(yīng)用于各個行業(yè)。微生物胞外多糖在食品中主要用作增稠劑、穩(wěn)定劑、膠凝劑和乳化劑,如黃原膠和結(jié)冷膠。左聚糖主要來源于微生物發(fā)酵,分子量一般在2×06～1×108Da范圍內(nèi)[11],它具有良好的水溶性、生物相容性和生物可降解性,還具有較多的生物活性,如抗氧化[12-15]、抗腫瘤[12,16-19]、抗炎[20]、降膽固醇[21]、降血糖[22]等;此外,有研究表明低分子量的左聚糖能促進雙歧桿菌特別是青春雙歧桿菌的增殖[23],也有文獻報道高分子量的左聚糖在經(jīng)過胃腸道時能被降解成重均分子量為～4000 Da的左聚糖[24],本實驗室的前期研究表明從BD3526在產(chǎn)糖培養(yǎng)基中產(chǎn)的左聚糖[10]制備得到的低分子量左聚糖(Mw=4200 Da)能促進雙歧桿菌特別是嬰兒雙歧桿菌和長雙歧桿菌生長[25],因此,左聚糖又可以作為潛在的益生元被應(yīng)用于功能性食品和保健品等領(lǐng)域。

在前期研究中,發(fā)現(xiàn)Paenibacillusbovissp. nov BD3526在無氮培養(yǎng)基平板上生長良好,且其菌落非常黏稠、可拉絲,可能是其分泌高分子量的胞外多糖所致。因此,本文提取并制備該黏性多糖粗品,用離子交換層析進行分離純化,用凝膠滲穩(wěn)定色譜(GPC)測定主要組分的分子量及分子量分布,用紅外光譜和核磁氫譜表征純品的結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)其是分子量超大的直鏈左聚糖;用差示掃描量熱法(DSC)和熱重分析(TGA)進一步表征其熱性能,用動態(tài)光散射儀(DLS)和透射電鏡(TEM)研究其在水溶液中的構(gòu)象;最后,用MTS法研究其免疫增強活性。本研究進一步豐富了BD3526產(chǎn)的胞外多糖的數(shù)據(jù),為將其胞外多糖應(yīng)用于功能性食品領(lǐng)域提供理論基礎(chǔ),同時也為BD3526作為新資源的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

無氮固體培養(yǎng)基(1 L) 蔗糖10 g,磷酸二氫鉀0.2 g,七水合硫酸鎂0.2 g,氯化鈉0.2 g,二水合硫酸鈣0.2 g,碳酸鈣5 g,瓊脂12 g,上述培養(yǎng)基成分均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris) 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;窄分布標樣(PEO24k)和寬分布標樣(Dextran73k) 英國Malvern公司;類芽孢桿菌(Paenibacillusbovissp. nov BD3526) 本實驗室保藏菌種;DEAE-Sepharose Fast Flow GE公司;透析袋 MWCO 14000 Da,華美生物工程公司;BALB/C小鼠 6周齡,雄性,體重(20.0±1.0) g，上海斯萊克動物實驗中心;脂多糖(LPS) Sigma;RPMI1640培養(yǎng)液 美國Gibco公司；CellTiter 96 Aqueous One Solution細胞增殖試劑盒 美國Promega公司。

J-30I高效冷凍離心機 Bechman 公司;DHL-A型電腦恒流泵 上海滬西分析儀器廠;TH-500型梯度混合儀 上海滬西分析儀器廠;FreeZone臺式凍干機 美國LABCONCO公司;GPC270Max凝膠滲透色譜儀 英國馬爾文公司;Nicolet6700傅里葉變換紅外光譜儀 Thermo Fisher,USA;Avance III 400 MHz核磁共振儀 德國Bruker公司;JEM-2100透射電鏡(TEM) 日本JEOL公司;Heraguard ECO超凈工作臺 美國Thermo公司;Nano-S動態(tài)光散射儀(DLS) 英國Malvern公司;HD-97-1核酸蛋白檢測儀 上海金鵬分析儀器有限公司;銅網(wǎng) 北京新網(wǎng)微拓科技有限公司；DSC204F1差示掃描量熱儀 德國耐馳儀器制造有限公司；Q600 SDT熱重分析儀 美國TA儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 胞外粗多糖的制備 在超凈工作臺中用接種環(huán)蘸取少量新鮮的BD3526種子劃到新制備的無氮培養(yǎng)基平板上,將平板放入培養(yǎng)箱中,30 ℃,好氧培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束后,取出平板,刮取平板上黏稠的菌落(約0.2 g),用蒸餾水將其溶解或分散均勻,離心(12000 r/min,4 ℃,20 min),取上清,然后邊攪拌邊向上清液中加入質(zhì)量分數(shù)為80%的三氯乙酸溶液至其終質(zhì)量分數(shù)為5%,4 ℃,靜置過夜,再離心(12000 r/min,4 ℃,20 min),棄沉淀,取上清,上清液用流動自來水透析24 h(截留分子量14000 Da),然后換用去離子水繼續(xù)4 ℃透析48 h,每8 h換一次水,冷凍干燥(-80 ℃預(yù)凍12 h,冷阱溫度-50 ℃,真空度10-3mBar,凍干48 h)得胞外多糖粗品(NEP)。Bradford法[26]檢測此胞外多糖粗品中是否含有蛋白。

1.2.2 胞外多糖的分離純化 胞外多糖粗品用Tris-HCl洗脫緩沖液溶解后(20 mg/mL),經(jīng)DEAE-Sepharose FF離子交換(D 2.6 cm×30 cm)層析,上樣量100 mg,依次用Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L,pH7.6)和0.2～1.2 mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液線性梯度洗脫,洗脫速度為3 mL/min,每管收集6 mL,核酸蛋白檢測儀在線檢測蛋白質(zhì)含量(紫外A280 nm),用苯酚-硫酸法檢測每管中多糖含量(A490 nm),按多糖含量檢測值分別合并收集單一組分(Tris-HCl-NaCl洗脫部分未檢測到多糖),去離子水透析48 h,每8 h換水一次,將透析液濃縮后冷凍干燥,即得各純化的樣品(F1、F2和F3)。

1.2.3 F1的分子量及分子量分布的測定 用馬爾文多檢測器GPC測定F1的純度和分子量及分子量分布。采用馬爾文A6000(300 mm×7.8 mm,13 μm)凝膠柱,流動相是0.1 mol/L NaNO3溶液,流速1.0 mL/min,溫度35 ℃,進樣體積50 μL。用窄分布標樣(PEO24k)和寬分布標樣(Dextran73k)校正儀器。將F1溶于0.1 mol/L NaNO3溶液,濃度為1 mg/mL,0.22 μm濾膜過濾后進樣,洗脫結(jié)束后,用馬爾文OmniSEC軟件計算該樣品的分子量及分子量分布。

1.2.4 F1的結(jié)構(gòu)鑒定 用FT-IR和1H NMR表征F1的結(jié)構(gòu)特征:將2.0 mg F1與KBr研磨壓片,在4000～500 cm-1區(qū)域內(nèi)進行紅外光譜掃描(Nicolet 6700,Thermo Fisher,USA);將10 mg F1溶于1 mL D2O,進行核磁共振儀1H NMR分析,3-(三甲基硅烷)丙酸鹽(TSP)作內(nèi)標,測試溫度25 ℃。

1.2.5 F1的熱分析 在氮氣氣氛中,以流量為45 mL/min,升溫速度為10 ℃/min,在20～890 ℃溫度范圍內(nèi)對F1進行熱失重(TGA)和差示掃描量熱法(DSC)分析測定。

1.2.6 F1的構(gòu)象 采用動態(tài)光散射儀測定F1多糖在水溶液中的聚集體的粒徑大小。用0.22 μm濾膜將F1溶液直接過濾到無塵處理的散射池中,4.0 mW He-Ne激光光源,測定角度為173,激光波長是633 nm,25 ℃恒溫測定,數(shù)據(jù)分析采用儀器自帶軟件進行。

將F1溶于超純水中,濃度為2.5 mg/mL,用0.22 μm濾膜過濾,滴一滴到銅網(wǎng)上,室溫干燥,然后用TEM觀察F1的構(gòu)象。

1.2.7 F1的免疫增強活性 采用斷頸法處死BALB/C小鼠,在75%的酒精中浸泡3 min消毒。取出轉(zhuǎn)入超凈工作臺的解剖盤中,逐層剪開腹腔,無菌操作取出脾臟,去除周圍的脂肪組織,并用PBS緩沖液淋洗,轉(zhuǎn)入盛有預(yù)冷的RPMI1640培養(yǎng)液的平皿中。用無菌注射器反復(fù)注射RPMI1640培養(yǎng)液到脾臟中沖出脾細胞,然后將脾細胞剪碎,無菌注射器芯研磨并過細胞篩網(wǎng)(40 μm),將脾細胞懸液收集到離心管中,室溫,2000 r/min離心10 min,去上清,加入紅細胞裂解液,5 min后離心去除紅細胞,用預(yù)冷的PBS洗滌2次,最后重懸于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,即得脾細胞懸液,采用臺盼藍染色計數(shù),調(diào)整細胞濃度為1×106cells/mL。

用脾細胞懸液鋪96孔板,每孔加入上述調(diào)整好濃度的脾淋巴細胞200 μL和50 μL 不同濃度的F1母液樣品,使得F1的終濃度分別為2、4、8、32、128 μg/mL,脂多糖(LPS,終濃度為5 μg/mL)作為陽性對照,添加完全RPMI1640培養(yǎng)基作為陰性對照。每組設(shè)置5個復(fù)孔,置于二氧化碳培養(yǎng)箱中,37 ℃,培養(yǎng)44 h。培養(yǎng)結(jié)束后,按照CellTiter 96 Aqueous One Solution試劑盒的說明加入MTS溶液,再將96孔板放入二氧化碳培養(yǎng)箱孵育6 h,然后用酶標儀測定各孔在490 nm的吸光度值。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 采用單因素方差分析和Student’s t檢驗,以p<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 BD3526無氮培養(yǎng)基胞外多糖的制備及分離純化

BD3526是本實驗室從西藏牦牛奶中分離得到的一株菌,經(jīng)鑒定其為類芽孢桿菌屬的一個新種[9]。在實驗過程中,發(fā)現(xiàn)BD3526在無氮培養(yǎng)基平板上分泌非常粘稠的物質(zhì),極有可能是分子量很高的胞外多糖,因此,刮取平板上的菌落,按照提取胞外多糖的方法制備得到粗品。對此胞外多糖粗品用終濃度5%三氯乙酸去蛋白,透析72 h、凍干,凍干后的樣品用DEAE-Sepharose FF進行分離純化,結(jié)果如圖1所示,F1、F2和F3均是中性多糖,在NaCl梯度洗脫部分沒有檢測到多糖組分(數(shù)據(jù)未列出),這與BD3526在TYC(胰蛋白胨酵母粉胱氨酸培養(yǎng)基)中產(chǎn)的胞外多糖的組成有所不同,其在TYC培養(yǎng)基中產(chǎn)的胞外多糖含有一個中性多糖左聚糖和兩個帶陰離子電荷的多糖組分,這種差異可能與培養(yǎng)基成分不同有關(guān)。F1是BD3526在無氮培養(yǎng)基平板上產(chǎn)的胞外多糖中的主要成分,含量為96.8%,F2和F3的含量極少,幾乎得不到純品,因此,本文重點研究F1的理化性質(zhì)和生理功能;Bradford法[26]檢測結(jié)果表明,F1樣品中不含有蛋白質(zhì)。

圖1 BD3526在無氮培養(yǎng)基上產(chǎn)的胞外多糖(NEP)的DEAE-Sepharose FF柱洗脫曲線Fig.1 DEAE-Sepharose FF chromatographic profile of exopolysaccharides produced by BD3526 in medium without nitrogen source

2.2 F1的分子量及分布測定

采用馬爾文多檢測器GPC測定F1樣品的純度和分子量及分布,結(jié)果如圖2和表1所示。圖2中F1的RI圖譜和靜態(tài)光散射圖譜中都只有一個尖銳且對稱的峰,表明F1是純度很高的單一多糖組分;由表1可知F1的分子量非常大,其重均分子量(Mw)為3.76×107Da,但分子量分布卻非常窄,只有1.012,這比商業(yè)化的多糖標樣右旋糖酐的分子量分布(1.370)都窄,可以開發(fā)其為多糖的標樣。F1的分子量大于BD3526在產(chǎn)糖培養(yǎng)基中產(chǎn)的主要多糖組分左聚糖的分子量,根據(jù)靜態(tài)光散射信號計算得出F1的均方回轉(zhuǎn)半徑(Rg)是43.4 nm,而BD3526在產(chǎn)糖培養(yǎng)基中產(chǎn)的主要多糖組分左聚糖因其Rg太小而無法計算出具體的數(shù)值[10]。BD3526產(chǎn)的胞外多糖的分子量之間的巨大差異可能與培養(yǎng)其的方式有很大關(guān)系,即是固體培養(yǎng)還是液體培養(yǎng)。

圖2 F1的GPC洗脫曲線Fig.2 The GPC profile of F1注:濃度為1 mg/mL,RLS為直角靜態(tài)光散射檢測器信號,LLS為小角靜態(tài)光散射檢測器信號,RI為示差檢測器信號。

樣品Mw(Da)Mw/MnRg(nm)F13.76×1071.01243.4

2.3 F1的結(jié)構(gòu)表征

首先,采用KBr壓片法對F1進行紅外光譜分析。如圖3所示,3442 cm-1處的峰是F1的O-H鍵的伸縮振動峰,表明F1分子內(nèi)存在很強的氫鍵;2932和2883 cm-1處是C-H的伸縮振動峰,為糖類的特征峰;而1128～1000 cm-1之間存在的峰對應(yīng)多糖C-O-C和C-O-H的伸縮振動峰,同時,在1100和1010 cm-1之間只有兩個吸收峰,說明F1主要是呋喃糖組成的;在927 cm-1處尖銳的吸收峰是由果糖基的呋喃環(huán)的伸縮振動引起的[27],809 cm-1處的吸收峰也是果聚糖的特征吸收峰[28];因此,F1很有可能也是左聚糖。

圖3 F1的FT-IR譜圖Fig.3 The FT-IR spectrum of F1

采用1H NMR繼續(xù)表征F1的結(jié)構(gòu),如圖4所示,F1的氫譜與BD3526在TYC培養(yǎng)基中產(chǎn)的胞外多糖的主要成分左聚糖的譜圖完全相同[10],且圖譜中異頭氫區(qū)域沒有任何信號,表明F1是分子量超大的直鏈左聚糖。

圖4 F1的1H NMR譜圖Fig.4 1H NMR spectrum of F1

2.4 F1的熱分析

熱重分析可以提供F1的水分含量和熱穩(wěn)定性。在測試前,將F1在真空干燥箱(50 ℃)干燥24 h。在氮氣氛圍中加熱,F1經(jīng)歷了幾個階段的熱降解,如圖5所示。在加熱到165 ℃左右時,F1大約失去了4.2%的重量,這可能歸因于殘留的水分和F1的初步分解;F1開始發(fā)生分解的溫度約是165 ℃,而文獻報道一株Bacillussp.產(chǎn)的左聚糖的起始分解溫度是213.7 ℃[29],HalomonassmyrnensisAAD6T產(chǎn)的左聚糖的起始分解溫度是227 ℃[30],F1的分子量雖然高于上述兩株菌產(chǎn)的左聚糖的分子量,但其起始分解溫度卻比這兩株菌產(chǎn)的左聚糖的起始降解溫度降低了約50 ℃左右,這可能是由于三者的化學(xué)結(jié)構(gòu)不完全相同;在165～210 ℃,F1樣品的質(zhì)量顯著地降低,這一階段樣品的質(zhì)量損失率是最大的;在210～300 ℃時,F1的質(zhì)量繼續(xù)減少(10%～15%),但是質(zhì)量損失率越來越小;在溫度為300～890 ℃時,F1進入了最后的分解階段。因此,在150 ℃以下,F1具有良好的熱穩(wěn)定性。

圖5 F1的熱重和差示掃描量熱法分析曲線Fig.5 The TG and DSC curves of F1

真空干燥后的F1樣品經(jīng)歷了升溫-冷卻-升溫的熱循環(huán),對其進行差示掃描量熱法分析。首次升溫掃描階段(圖譜未列出),F1在110～125 ℃溫度上升期間出現(xiàn)了斜率變化,而在后續(xù)的冷卻和再升溫階段卻沒有再出現(xiàn)這樣的特征,這可能是由于F1中殘留的結(jié)合水在第一次升溫時蒸發(fā)完全所致。F1的第一次冷卻掃描(圖譜未列出)和第二次升溫掃描(圖5所示)顯示出可重復(fù)的相同的熱轉(zhuǎn)換階段,由此確定F1的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度約為42.3 ℃;F1的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度顯著低于Chen等[29]報道的一株Bacillussp.產(chǎn)的左聚糖的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(75.5 ℃),這個差異與多種因素相關(guān),如二者的分子量、分子結(jié)構(gòu)以及結(jié)合水的含量。

2.5 F1在水溶液中的構(gòu)象

F1溶于超純水中,濃度達到2.5 mg/mL時,其溶液呈現(xiàn)淡藍色,這可能是因為F1分子量巨大,在溶液中形成了具有一定粒徑大小的顆粒,導(dǎo)致其水溶液具有了膠體溶液的特征,因此,本文采用動態(tài)光散射儀測定水溶液中F1聚集體的粒徑大小,結(jié)果如圖6所示。由圖6可知,F1在水溶液中大部分是以聚集體形顆粒存在,粒徑大約163.2 nm,小部分F1以單分子狀態(tài)存在,其單分子大小只有3.40 nm左右。

圖6 F1在超純水溶液(濃度:2.5 mg/mL)物乳桿菌混合發(fā)酵正交實驗因素水中的流體力學(xué)半徑(Rh)分布Fig.6 Distribution of the hydrodynamic radius Rh for F1 in ultrapure water at concentration of 2.5 mg/mL

圖7是F1的TEM照片,表明F1聚集體顆粒的粒徑在50～100 nm范圍內(nèi);TEM給出的納米粒的粒徑一般都小于DLS測定的數(shù)值,這是由于DLS測定的是粒子的水合半徑而TEM測定的是粒子干燥后的大小。相同濃度下,F1聚集體的粒徑大于BD3526在產(chǎn)糖培養(yǎng)基中產(chǎn)的左聚糖聚集體的粒徑[10],這可能是由于二者分子量大小不同所致。

圖7 F1的TEM圖譜(2.5 mg/mL)Fig.7 The TEM image of F1(2.5 mg/mL)

2.6 F1的免疫增強活性研究

大部分微生物的胞外多糖都能夠增強細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng),如促進T/B淋巴細胞增殖、單核細胞吞噬能力等。脾臟淋巴細胞中包括T淋巴細胞和B淋巴細胞,兩者含量基本相近;T和B淋巴細胞是兩類重要的免疫激活細胞,多糖的免疫調(diào)節(jié)作用是從激活淋巴細胞和巨噬細胞開始的。最近,有文獻報道Bacilluslicheniformis8-37-0-1產(chǎn)的左聚糖能顯著促進脾細胞的增殖[31],而BD3526在產(chǎn)糖培養(yǎng)基中產(chǎn)的左聚糖在濃度大于128 μg/mL時可顯著促進脾細胞的增殖[10]。BD3526在無氮培養(yǎng)基平板上產(chǎn)的多糖雖然也是左聚糖,但其分子量遠大于其在產(chǎn)糖培養(yǎng)基中產(chǎn)的左聚糖的分子量,因此,本文考察此超大分子量左聚糖對脾淋巴細胞增殖的影響,實驗結(jié)果如圖8所示。

由圖8可知,F1促進脾細胞增殖具有濃度依賴性,當濃度大于8 μg/mL時,F1即可顯著刺激脾細胞增殖,且當濃度為128 μg/mL時,其促進脾細胞增殖的作用略強于陽性對照LPS;F1促進脾淋巴細胞增殖作用遠強于BD3526在產(chǎn)糖培養(yǎng)基中產(chǎn)的左聚糖的效果,這說明BD3526產(chǎn)的直鏈左聚糖,分子量越大,促進脾細胞增殖的作用越強。

圖8 F1對脾淋巴細胞增殖的影響Fig.8 The effect of F1 on the proliferation on BALB/C mouse spleen cells in vitro注:*代表差異顯著(p<0.05)。

3 結(jié)論

BD3526是類芽孢桿菌屬的一個新種,其在無氮固體培養(yǎng)基上產(chǎn)的胞外多糖主要是分子量超大的左聚糖(96.8%,w/w),其重均分子量為3.76×107Da,分子量分布只有1.012;此左聚糖的均方回轉(zhuǎn)半徑是43.4 nm,其在水溶液中形成的聚集體的水合半徑是163.2 nm,TEM結(jié)果表明其粒徑在50～100 nm范圍;此左聚糖的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度是42.3 ℃,溫度低于150 ℃時其具有良好的熱穩(wěn)定性,溫度繼續(xù)升高,此左聚糖即開始迅速分解;此左聚糖在低濃度時(8 μg/mL)即可顯著促進脾細胞增殖,在高濃度時,其促進脾細胞增殖的作用略強于LPS;與BD3526在產(chǎn)糖培養(yǎng)基中產(chǎn)的左聚糖相比,其在無氮固體培養(yǎng)基上產(chǎn)的左聚糖的免疫調(diào)節(jié)活性更強。本研究為BD3526產(chǎn)的左聚糖作為功能性成分應(yīng)用于食品行業(yè)提供了數(shù)據(jù)支持,也為將BD3526開發(fā)為食品新資源提供一定的理論基礎(chǔ)。

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StudyontheexopolysaccharidesproducedbyPaenibacillusbovissp.novBD3526innitrogen-freesolidculturemedium

XUXiao-fen

(State Key Laboratory of Dairy Biotechnology,Shanghai Engineering Research Center of Dairy Biotechnology,Dairy Research Institute,Bright Dairy & Foods Co.,Ltd.,Shanghai 200436,China)

This study was aimed to investigate the structure and bioactivities of exopolysaccharides produced byPaenibacillusbovissp. nov BD3526 in nitrogen-free solid culture medium. The exopolysaccharides were prepared,and then separated and purified by DEAE-sepharose fast flow and one main component was obtained(F1). Its molecular weight and molecular weight distribution was determined by gel permeation chromatography while its chemical structure was characterized by FT-IR and1H NMR,indicating F1 was linear levan with ultrahigh molecular weight of 3.76×107Da. It had good thermal stability,which was analyzed by thermogravimetric analysis(TGA)and differential scanning calorimetry(DSC). DLS result indicated the particle size of its aggregates in aqueous solution was 163.2 nm while its conformation was characterized as compact sphere(50～100 nm)by TEM. Finally,its immunological activity was evaluated by aninvitromethod and the result demonstrated F1 could significantly stimulate the proliferation of spleen cells,indicating it can be a potential natural immunomodulator. This levan could be an immunoenhancer to be used in functional food field.

exopolysaccharides;levan;thermal analysis;immunostimulatory activity

2017-02-13

徐曉芬(1986-)，女，博士，工程師，研究方向：乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物的生物活性，E-mail：rachelxu809@163.com。

國家“十二五”科技支撐計劃課題(2013BAD18B01)；上海市科委工程技術(shù)研究中心能力提升項目(16DZ2280600)；上海市閔行區(qū)領(lǐng)軍人才項目(201443)。

TS252.1

:A

:1002-0306(2017)16-0095-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.019