沙蒿籽總黃酮和總多酚及其抗氧化活性

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(1.陜西省食品綠色加工與安全控制工程實(shí)驗(yàn)室,陜西西安 710119;2.陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710119;3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 100193)

沙蒿籽總黃酮和總多酚及其抗氧化活性

郜安寧1,2,周志昊1,2,黃峰3,邵紅軍1,2,張泓3,*,楊興斌1,2,*

(1.陜西省食品綠色加工與安全控制工程實(shí)驗(yàn)室,陜西西安 710119;2.陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710119;3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 100193)

本文測(cè)定了沙蒿籽的四種不同極性溶劑提取物中總黃酮和總多酚的含量、化學(xué)成分及其體外抗氧化活性。結(jié)果顯示:沙蒿籽總黃酮和總多酚的提取含量與溶劑的極性相關(guān),甲醇提取物的總黃酮(33.30±0.11) mg/g和總多酚(80.1±0.16) mg/g含量最高,其次是丙酮和乙酸乙酯提取物,氯仿提取物含量較低。相對(duì)應(yīng)的是,甲醇提取物的DPPH和ABTS自由基清除能力最強(qiáng),其IC50分別是19.09、26.30 μg/mL,其鐵離子還原能力也明顯高于其它三種提取物。通過(guò)HPLC法檢出槲皮素和兒茶素兩種黃酮,均在甲醇提取物中含量最高,分別為5.15、28.24 mg/g。這表明,甲醇更適宜于沙蒿籽中總多酚和總黃酮的提取,這為沙蒿籽作為抗氧劑的開(kāi)發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

沙蒿籽,總黃酮,總多酚,抗氧化活性

白沙蒿(AretmsiaspshaerocephalaKrasch)是菊科蒿屬多年生、超旱生沙生植物,又名黃蒿、籽蒿或黃毛菜籽、圓頭沙蒿,廣泛分布在我國(guó)騰格里沙漠、烏蘭布和沙漠等西北部地區(qū)[1-3]。白沙蒿植株產(chǎn)籽量大,枝葉常作為飼料,籽粒藥食兼用,我國(guó)西北地區(qū)就有使用沙蒿籽粉增加面條延展性的習(xí)慣[4-5]?，F(xiàn)對(duì)沙蒿籽的研究多集中于沙蒿油、沙蒿多糖和沙蒿膠,研究發(fā)現(xiàn)沙蒿油中不飽和脂肪酸含量高于90%,且富含維生素E[6]。沙蒿多糖具有顯著的抗氧化、降血糖和抗腫瘤活性[7-8],而沙蒿膠可起到改善食品口感,增加食品持水性、穩(wěn)定性的作用[9-10]。

更為重要的是,沙蒿富含黃酮等生物活性成分。張杰對(duì)白沙蒿全草的化學(xué)成分進(jìn)行了研究,從中分離鑒定出了包括橙皮素、金合歡素、金圣草黃素在內(nèi)的11個(gè)黃酮類化合物;趙東保等也在沙蒿的乙醇提取物中分離并鑒定出了8種黃酮類化合物[11-14]。但目前對(duì)沙蒿籽總黃酮、總多酚的提取及活性研究鮮有報(bào)道。因此,本研究以沙蒿籽為研究對(duì)象,研究不同溶劑提取對(duì)沙蒿籽中總黃酮和總多酚的影響,并測(cè)定其抗氧化活性,以期為沙蒿籽植物資源在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

沙蒿(AretmsiaspshaerocephalaKrasch)籽 購(gòu)于甘肅武威,根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》的鑒定標(biāo)準(zhǔn),經(jīng)鑒定為白沙蒿籽;DPPH、TPTZ、ABTS、乙酸乙酯、沒(méi)食子酸 Sigma公司;標(biāo)準(zhǔn)品(原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素、咖啡酸、阿魏酸、蘆丁、槲皮素) 中國(guó)藥品生物制品所;乙腈、甲醇 色譜級(jí),美國(guó)Honeywell公司;Folin-Ciocalteu 上海瑞谷生物科技公司;其它試劑 均為分析純。

LC-2010A高效液相色譜 日本shimadzu公司;Multiskan Go全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 美國(guó)熱電公司;MILLI-Q超純水儀 美國(guó)MILLIPORE公司;Q/BKYY31-2000電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療機(jī)械廠;R-3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 BUCHI公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取物的制備 將干燥的沙蒿籽粉碎過(guò)60目篩得沙蒿籽粉末,分別精密稱取20 g沙蒿籽粉末,按照1∶20 (g/mL)比例分別加入甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿于室溫下浸提24 h,重復(fù)浸提三次,合并不同溶劑提取濾液并用無(wú)水硫酸鈉干燥,后于40 ℃減壓濃縮,得到沙蒿籽不同溶劑粗提取物浸膏。精密稱取各提取物浸膏10 mg,分別用甲醇溶解置于-4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總多酚含量的測(cè)定 總多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線建立:利用Folin-Ciocalteu法測(cè)定樣品總多酚(total polyphenols content,TPC)含量[15]。精確稱取0.2 g沒(méi)食子酸(Gallic acid)標(biāo)準(zhǔn)品,用50%乙醇定容至1000 mL,分別取0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL標(biāo)準(zhǔn)品,各加入福林酚試劑2.4 mL,充分振蕩后靜置3～4 min,再分別加入12%的Na2CO3溶液4.8 mL,用50%的乙醇定容至10 mL容量瓶中。室溫條件下避光反應(yīng)2 h,以試劑空白為對(duì)照,在760 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值,記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),以濃度為橫坐標(biāo)吸光度值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為Y=0.616X+0.11,R2=0.9941。配制濃度為1 mg/mL的不同溶劑提取物樣品溶液,取1 mL按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作步驟進(jìn)行反應(yīng),之后測(cè)定吸光度值,重復(fù)三次并記錄。根據(jù)沒(méi)食子酸測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出樣品中的TPC含量,表示為沒(méi)食子酸當(dāng)量(GAE,mg GAE/g提取物)。

1.2.3 總黃酮含量的測(cè)定 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:黃酮含量用NaNO2-Al(NO3)3比色法[16]測(cè)定。精確稱取0.25 g蘆丁,用50%乙醇溶解,稀釋到1000 mL,分別吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2、2.4 mL蘆丁溶解液,加入0.4 mL 5% NaNO2,室溫靜置6 min;然后加入0.4 mL的10% Al(NO3)3,放置6 min后再加入4%的NaOH 4.0 mL,搖勻使其充分反應(yīng),加50%乙醇定容至10 mL,放置15 min使其反應(yīng)充分,在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度大小,記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),以濃度為橫坐標(biāo)吸光度值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為Y=0.6732X-0.1111,R2=0.9961。取1 mL不同溶劑提取物樣品溶液,按上述操作步驟進(jìn)行反應(yīng),測(cè)定其吸光值,重復(fù)三次并記錄。以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)曲線,樣品中總黃酮的含量表示為蘆丁當(dāng)量(RE,mg RE/g提取物)。

1.2.4 樣品化學(xué)成分的HPLC分析 采用色譜條件[17]:色譜柱:Venusil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相A:含0.5%的甲酸水溶液,流動(dòng)相B:乙腈/甲醇,80∶20,v/v,梯度洗脫程序設(shè)置為:0～5 min,8%溶劑B;5～15 min,8%～16% B;15～40 min,16%～30% B;40～55 min,30%～60% B;55～60 min,60% B;60～70 min,60%～30% B。柱溫為30 ℃,流速為1.0 mL/min,進(jìn)樣量:20 μL,檢測(cè)器:UV檢測(cè)器,檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm。樣品經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和濃度對(duì)樣品中的黃酮和酚類化學(xué)成分進(jìn)行定性和定量分析。

1.2.5 抗氧化性的測(cè)定

1.2.5.1 樣品對(duì)DPPH自由基的清除作用 參照文獻(xiàn)[18-19]的方法并稍作修改,評(píng)價(jià)樣品溶液對(duì)DPPH自由基的清除能力。將3.0 mL DPPH(0.1 mmol/L)溶液與1.0 mL不同濃度的樣品溶液分別加入試管中,充分混合,黑暗處理30 min,在517 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)1,相同條件下的DPPH自由基吸光度值A(chǔ)0為對(duì)照。樣品對(duì)DPPH的清除率按以下方法計(jì)算:

DPPH自由基清除率(%)=(A0-A1)/A0×100

1.2.5.2 樣品對(duì)ABTS自由基的清除作用 參照之前的測(cè)定方法[20]。配制ABTS自由基母液,將7 mmol/L的ABTS溶液和2.45 mmol/L的過(guò)硫酸鉀等體積混合后,室溫條件下避光12 h以便生成ABTS自由基。將ABTS自由基母液用甲醇適當(dāng)稀釋作為工作液使用。取0.5 mL的樣品溶液和2.7 mL的ABTS自由基工作液在30 ℃下混合均勻并孵育6 min,在745 nm條件下測(cè)定其吸光值A(chǔ)s,以在相同條件下0.5 mL甲醇和2.7 mL的ABTS自由基工作液的混合溶液的吸光值A(chǔ)C為對(duì)照,每個(gè)樣品對(duì)ABTS自由基的清除能力用以下公式進(jìn)行算:

ABTS自由基的清除率(%)=(Ac-As)/Ac

1.2.5.3 鐵離子還原能力 分別取濃度為50、100、200、400、800、1000 μmol/mL的FeSO4·7H2O溶液0.5 mL,加入4.5 mL FRAP試劑(由0.3 mol/L醋酸緩沖液、25 mL 10 mmol/L TPTZ溶液、2.5 mL 20 mmol/L FeCl3溶液及2.5 mL組成),室溫下靜置30 min,于593 nm處測(cè)定吸光值,記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),以FeSO4濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法,取濃度為1 mg/mL的樣品溶液0.5 mL,加入FRAP試劑,靜置后于593 nm處測(cè)定吸光值,空白組由甲醇溶液代替樣品溶液,樣品的還原能力以達(dá)到相同吸光度值所用μmol Fe2+/g表示,FRAP值越大表示其抗氧化活性越高[21]。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理分析 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)測(cè)定3次,所有數(shù)據(jù)均用Origin 7.0軟件處理作圖,并采用DPS 9.5數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行顯著性分析。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差,p<0.05認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1總多酚和總黃酮含量

用不同溶劑提取的沙蒿籽中總多酚和總黃酮含量測(cè)定結(jié)果如表1所示。從表1中可以看出,沙蒿籽中總多酚和總黃酮含量隨著提取溶劑的不同有明顯差異,溶劑極性越大,總多酚和總黃酮含量越高。其中,甲醇溶劑提取物的總多酚和總黃酮含量最高,其次分別是丙酮提取物、乙酸乙酯提取物和氯仿提取物。

表1 沙蒿籽不同溶劑提取物的總多酚和總黃酮含量Table 1 The total polyphenolic content and total flavonoids indifferent solvent extracts of A. sphaerocephala Krasch seeds content

2.2 HPLC分析

進(jìn)一步利用HPLC對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品與樣品進(jìn)行了分析,7種標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖如圖1(A)所示,在測(cè)定條件下7種標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)現(xiàn)了良好的分離。從圖1(B～E)可知,不同極性溶劑的提取物組分和含量差異明顯,甲醇和丙酮大極性提取物中黃酮類化合物種類較氯仿提取物的多,這與Alothman對(duì)三種熱帶水果不同極性提取物中黃酮類化合物含量的研究結(jié)果一致,大極性溶劑提取物的黃酮含量也比較高[22-23]。將樣品色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖對(duì)照,發(fā)現(xiàn)沙蒿籽提取物中存在槲皮素和兒茶素2種化合物,槲皮素在4種提取物中均有檢出,含量在0.49～5.15 mg/g之間;而兒茶素僅在甲醇和丙酮提取物中檢測(cè)出,含量分別為28.24、24.26 mg/g。

圖1 沙蒿籽不同溶劑提取物的液相色譜圖Fig.1 The chromatogram of the different solvent extracts of A.sphaerocephala Krasch seeds注:A～E分別表示黃酮類標(biāo)準(zhǔn)品、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿提取物的液相色譜圖;1-原兒茶酸;2-兒茶素;3-表兒茶素;4-咖啡酸;5-阿魏酸;6-蘆丁;7-槲皮素。

圖2 沙蒿籽不同溶劑提取物對(duì)DPPH的清除作用Fig.2 The DPPH radical scavenging ability of the different solvent extracts of A. sphaerocephala Krasch seeds

2.3抗氧化性的測(cè)定

2.3.1 DPPH的清除作用 DPPH是一種穩(wěn)定自由基,其電子在517 nm附近有較強(qiáng)的吸收峰,在實(shí)驗(yàn)中常被用來(lái)檢測(cè)物質(zhì)的自由基清除活性。由圖2可以看出,DPPH自由基的清除率隨著不同溶劑提取物的濃度的增加而增加,并在該濃度范圍內(nèi)(10～50 μg/mL)呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系,其中甲醇提物對(duì)DPPH自由基的清除能力最強(qiáng),其IC50值為19.09 μg/mL,其次是丙酮提取物,IC50值為23.27 μg/mL。不同溶劑提取物清除DPPH自由基能力由大到小分別是:甲醇提取物>丙酮提取物>乙酸乙酯提取物>氯仿提取物,不同溶劑提取物之間清除能力差異顯著(p<0.05),這一結(jié)果與劉曦等人對(duì)不同溶劑提取藍(lán)莓葉的活性成分研究所得到的甲醇提取物總黃酮含量最高,抗氧化能力最強(qiáng)的結(jié)果一致[24-26]。

2.3.2 ABTS自由基的清除作用 不同溶劑提取物在不同濃度條件下對(duì)ABTS自由基的清除效果如圖3所示。結(jié)果表明,各樣品有一定的清除ABTS自由基的能力,且仍是甲醇提取物活性最好,在濃度為100 μg/mL時(shí),清除率高達(dá)90.02%，其IC50是26.30 μg/mL,丙酮提取物次之,為89.24%,在濃度為80 μg/mL時(shí),極性由大到小,各提取物的ABTS自由基清除率分別是89.41%、88.56%、75.69%、62.84%。不同溶劑提取物的ABTS自由基清除率,分別是甲醇提取物>丙酮提取物>乙酸乙酯提取物>氯仿提取物。甲醇、丙酮、乙酸乙酯及氯仿提取物組間差異顯著(p<0.05)。

圖3 沙蒿籽不同溶劑提取物對(duì)ABTS的清除作用Fig.3 The ABTS radical scavenging ability of the different solvent extracts of A. sphaerocephala Krasch seeds

2.3.3 鐵離子還原能力 由圖4可知,不同溶劑提取物均有一定的抗氧化活性,其對(duì)鐵離子的還原能力存在明顯差異,其中甲醇提取物的活性最強(qiáng)(920.45 μmol Fe2+/g),而氯仿提取物的活性最弱(621.76 μmol Fe2+/g)。

圖4 沙蒿籽不同溶劑提取物鐵離子還原能力Fig.4 The ferric-reducing power assay of the different solvent extracts of A. sphaerocephala Krasch seeds

2.4不同溶劑提取物中總多酚、總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性

4種溶劑提取物中總多酚、總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)系數(shù)如表2所示?？偠喾优cDPPH、ABTS、FRAP的R2分別是0.96、0.88、0.89,相關(guān)性顯著,表明沙蒿籽提取物中總多酚含量的高低反映了其抗氧化能力的強(qiáng)弱,提取物中總多酚含量增加,抗氧化活性也隨之增加。這與Alothman M等人的研究結(jié)果一致[23]?？傸S酮與抗氧化活性的相關(guān)系數(shù)分別是0.80、0.92、0.63,有顯著的正相關(guān)性(p<0.05)。

表2 提取物中總多酚、總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性Table 2 The correlation between content of the total polyphenolic content and total flavonoids and the antioxidant activity of different extracts

注:*:相關(guān)性顯著,p<0.05。

3 結(jié)論

研究了4種溶劑提取對(duì)沙蒿籽中總黃酮和總多酚含量及抗氧化活性的影響,發(fā)現(xiàn)提取物總黃酮和總多酚的含量與提取溶劑極性正相關(guān),甲醇提取物總黃酮和總多酚的含量最高,體外抗氧化活性最強(qiáng)。同時(shí),不同溶劑提取物中黃酮類化合物種類也有所差別,甲醇和丙酮提取物中含有兒茶素和槲皮素兩種常見(jiàn)黃酮類物質(zhì),而氯仿和乙酸乙酯提取物中僅有槲皮素。

沙蒿籽是營(yíng)養(yǎng)和食品加工價(jià)值兼具的野生食用資源,本研究對(duì)沙蒿籽?？寡趸钚缘难芯拷Y(jié)果表明沙蒿籽具有開(kāi)發(fā)為天然抗氧化劑的潛力,同時(shí)其體內(nèi)抗氧化活性和抗氧化機(jī)理有待深入研究。

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Totalflavonoidsandtotalpolyphenoliccontent,anditsantioxidantabilityofArtemisiasphaerocephalaKraschseeds

GAOAn-ning1,2,ZHOUZhi-hao1,2,HUANGFeng3,SHAOHong-jun1,2,ZHANGHong3,*,YANGXing-bin1,2,*

(1.Shaanxi Engineering Laboratroy for Food Green Processing and Security Control,Xi’an 710119,China;2.College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Normal University,Xi’an 710119,China;3.Institute of Food Science and Technology,Chinese Academy of Agriculture Sciences,Beijing 100193,China)

The total flavonoids content(TFC),total polyphenoliccontent(TPC),chemical composition and antioxidant activity of the different solvent extracts ofArtemisiasphaerocephalaKrasch seeds were investigated. The results showed that the TFC and TPC were correlated with the polarity of solvents used here,the methanol extracts was showed to contain the highest level of TFC(33.30±0.11) mg/gand TPC(80.1±0.16) mg/g which followed by acetone,ethyl acetate and chloroform extracts. Furthermore,the methanol extracts was the most potent DPPH and ABTS radical-scavenger,the inhibitory concentration 50%(IC50)were 19.09,26.30 μg/mL,respectively. The ferric reducing activity of the methanol extracts was also higher than the other three extracts. Meanwhile,both quercetin and catechin were validated by HPLC in the methanol extracts with higher content of 5.15,28.24 mg/g,respectively. In short,methanol is suitable for the total polyphenolic and flavonoids extraction from seeds ofA.sphaerocephalaKrasch,and the extracts might be a valuable antioxidant resource.

ArtemisiasphaerocephalaKrasch seeds;total flavonoids;total polyphenols;antioxidant activity

2017-02-07

郜安寧(1993-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與衛(wèi)生，E-mail：anningg123@163.com。

*通訊作者:張泓(1958-)，男，博士，研究員，研究方向：食品工程，E-mail:zhanghong03@cas.cn。 楊興斌(1969-)，男，博士，教授，研究方向：食品科學(xué)與工程，E-mail：xbyang@snnu.edu.cn。

農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題項(xiàng)目(2015007)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金項(xiàng)目(GK20102001)。

TS201.1

:A

:1002-0306(2017)16-0005-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.002