神經(jīng)外科ICU鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥基因檢測(cè)分析

馬英花 曹銀光

神經(jīng)外科ICU鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥基因檢測(cè)分析

馬英花 曹銀光

目的分析ICU中109株鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性及β-內(nèi)酰胺酶基因型。方法測(cè)定109株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)13種抗菌藥的耐藥性及β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因型。結(jié)果109 株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)13種抗菌藥的敏感率均較低，除AMS、LEV和IPM，均≤36．7%，耐藥較高。109株鮑不動(dòng)桿菌中有11株擴(kuò)增到的基因大小一致，約1 000 bp的條帶，為blaOXA-23；109株鮑不動(dòng)桿菌中有5株擴(kuò)增出條帶，其中3株為3條單一條帶，分別約150 bp、300 bp和450 bp，分別是blaSHV、blaCTX-M-14和blaCTX-M-3，2株出現(xiàn)大小一致的雙條帶，均為 150 bp、300 bp，分別為blaSHV、blaCTX-M-1兩種基因型。結(jié)論ICU病房常見(jiàn)鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥，是否與鮑曼不動(dòng)桿菌基因型有關(guān)仍需要考察。

鮑曼不動(dòng)桿菌；β-內(nèi)酰胺酶；基因型

鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii，Ab）具有不發(fā)酵糖類(lèi)和氧化酶陰性等生理特征，是近年來(lái)醫(yī)院感染中增長(zhǎng)較快最常見(jiàn)的不動(dòng)桿菌。該菌生存能力較強(qiáng)，在醫(yī)院內(nèi)分布廣泛，且存活時(shí)間長(zhǎng)，很容易造成院內(nèi)感染，因此常從被感染患者的血、體液、膿液及呼吸道分泌物等標(biāo)本中分離出，其中危重患者因抵抗力嚴(yán)重降低，是鮑曼不動(dòng)桿菌感染的高發(fā)人群[1-2]。本研究檢測(cè)了2014年3月—2016年3月收集的109株鮑曼不動(dòng)桿菌標(biāo)本的耐藥表型及β-內(nèi)酰胺酶基因類(lèi)型。

1 材料與方法

1.1 研究材料

2014年3月—2016年3月從聊城市人民醫(yī)院神經(jīng)外科ICU住院患者送檢標(biāo)本中分離出鮑曼不動(dòng)桿菌109株作為研究對(duì)象。標(biāo)本類(lèi)型包括痰液、創(chuàng)面分泌物、血液、導(dǎo)管等。

1.2 藥敏試驗(yàn)

采用K-B法測(cè)定13種抗菌藥物的敏感性。本實(shí)驗(yàn)采用的方法和判讀標(biāo)準(zhǔn)均按照美國(guó)CLSI2014的規(guī)定進(jìn)行。

1.3 AmpC粗提酶液制備與三維試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[3]，在Eppendorf管中加入無(wú)菌蒸餾水1.5 ml，加入35℃過(guò)夜培養(yǎng)的菌落3個(gè)，菌液濃度調(diào)整為1×109個(gè)/ml，放入-20℃環(huán)境反復(fù)凍融6次，取出后，0℃解凍，10 000 rpm離心5 min，取上清液，即得AmpC粗提酶液。將大腸埃希菌ATCC25922稀釋為0.5麥?zhǔn)蠁挝?，平涂?0 mm M-H平板，平板中心貼頭孢西丁紙片，距離紙片邊緣5 mm，采用無(wú)菌刀片向外切1 mm×15 mm的長(zhǎng)方條形，剔除瓊脂，將30 μl AmpC粗提酶液置于長(zhǎng)方條中，35℃培養(yǎng)過(guò)夜觀察。

1.4 PCR法檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶基因

采用PCR法，檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶基因[4]，本研究共進(jìn)行了18種β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷類(lèi)修飾酶基因檢測(cè)，引物和產(chǎn)物見(jiàn)表1。通過(guò)加熱裂解法制備總DNA模板，采用PCR篩選所提取的總DNA。

2 結(jié)果

2.1 109株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)13種抗菌藥的藥敏

109株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)13種抗菌藥的敏感率均較低，除了AMS、LEV和IPM，均≤36.7%，耐藥較高。見(jiàn)表2。

2.2 109株鮑不動(dòng)桿菌基因擴(kuò)增

109株鮑不動(dòng)桿菌中有11株擴(kuò)增到的基因大小一致，約1 000 bp的條帶，考慮其為blaOXA-23，見(jiàn)圖1；109株鮑不動(dòng)桿菌中有5株擴(kuò)增出條帶，其中3株為3條單一條帶，分別約150 bp、300 bp和450 bp，分別是blaSHV、blaCTX-M-14和blaCTX-M-3；2株出現(xiàn)大小一致的雙條帶，均為 150 bp、300 bp，分別為blaSHV、blaCTX-M-1兩種基因型，見(jiàn)圖2。

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌是醫(yī)院感染重要的條件致病菌，其環(huán)境釋放能力強(qiáng)，傳播速度快，已成為呼吸道院內(nèi)感染的主要致病菌，也可引發(fā)菌血癥、尿道感染、繼發(fā)性腦膜炎等。鮑曼不動(dòng)桿菌的環(huán)境生存能力強(qiáng)、耐藥率高，近年來(lái)已成為重要的院內(nèi)感染條件致病菌，其在醫(yī)院環(huán)境中廣泛分布且可長(zhǎng)期存活，易在老弱危重及免疫力低下的人群中爆發(fā)流行[5-6]。耐藥率相對(duì)較低的為頭孢哌酮/舒巴坦及氨芐西林/舒巴坦，與β-內(nèi)酰胺酶能夠被舒巴坦可抑制有關(guān)。阿米卡星單獨(dú)使用療效不佳，左旋氧氟沙星耐藥率＞39%，與臨床廣泛使用這類(lèi)抗生素有關(guān)。鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)IPM耐藥率最低（3.7%），IPM對(duì)多數(shù)β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定。鮑曼不動(dòng)桿菌已經(jīng)出現(xiàn)廣泛耐藥菌株，除IPM、AMS和LEV，其余藥物耐藥率≥70.6%，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道類(lèi)似[5-7]。

表1 靶基因PCR引物序列

表2 109株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)13種抗菌藥的敏感率（S）、中介（M）和耐藥率（R）（%）

圖1 PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果

圖2 PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果

對(duì)109株鮑曼不動(dòng)桿菌基因行PCR擴(kuò)增，獲得以下幾種基因，分別為1 000 bp的 blaOXA-23、150 bp的blaSHV、300 bp的blaCTX-M-14和450 bp的blaCTX-M-3，2株出現(xiàn)150 bp和300 bp雙條帶分別為blaSHV、blaCTX-M-1兩種基因型。結(jié)合臨床，鮑曼不動(dòng)桿菌的上述基因可能是導(dǎo)致較高的耐藥性的生物學(xué)基礎(chǔ)，研究也顯示鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)IPM和MER等碳青霉烯類(lèi)耐藥可能與鮑曼不動(dòng)桿菌的blaOXA-23基因相關(guān)[8-10]。但是，上述基因檢測(cè)并不是在所有菌株中檢測(cè)到，而且檢測(cè)陽(yáng)性率也較低，提示上述基因型在鮑曼不動(dòng)桿菌少量出現(xiàn)，可能與耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌院感流行無(wú)關(guān)。本課題組認(rèn)為，雖然這些基因型在鮑曼不動(dòng)桿菌中發(fā)生率雖然不高，可能與院感的傳播關(guān)系不大，但質(zhì)粒水平傳遞的可能性應(yīng)引起臨床醫(yī)生高度重視。

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Analysis of the Detection of the Resistance Genes of Acinetobacter Baumannii at ICU, Department of Neurosurgery

MA Yinghua CAO Yin'guang Department of Neurosurgery, Liaocheng People's Hospital, Liaocheng Shandong 252000, China

ObjectiveTo analyze the resistance and β-lactamase genotype of 109 strains of Acinetobacter baumannii in ICU.MethodsThe resistance of 109 strains of Acinetobacter baumannii to 13 types of antimicrobial agents and β-lactamase resistant genotypes of Bauman were measured.Results109 strains of Acinetobacter baumannii on 13 kinds of antimicrobial susceptibility were low, except AMS, LEV and IPM, all susceptibility rate were ≤ 36.7%, resistant rate were high. 109 strains of Acinetobacter baumannii were amplified about 1 000 bp of blaOXA-23in 11 strains; 150 bp of blaSHV, 300 bp of blaCTX-M-14and 450 bp of blaCTX-M-3, respectively in 3strains, 150bp of blaSHVand 300bp of blaCTX-M-1both in 2 strains.ConclusionICU ward have common Acinetobacter baumannii multi-drug resistance, which are not defnitely connected with the genotype of Acinetobacter baumannii and need further study.

Acinetobacter baumannii; β-lactamases; genotype

R97

A

1674-9316（2017）18-0040-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．18．018

聊城市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，山東 聊城 252000