CEUS評價大鼠肝泡狀棘球蚴病灶血流灌注的動態(tài)演變

曾紅春，王穎鑫，王俊華，韓 偉，劉文亞

(1.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院超聲診斷科，2.新疆包蟲病基礎(chǔ)醫(yī)學重點實驗室，3.影像中心，新疆 烏魯木齊 830011)

CEUS評價大鼠肝泡狀棘球蚴病灶血流灌注的動態(tài)演變

曾紅春1，王穎鑫1，王俊華2，韓 偉1，劉文亞3*

(1.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院超聲診斷科，2.新疆包蟲病基礎(chǔ)醫(yī)學重點實驗室，3.影像中心，新疆 烏魯木齊 830011)

目的探討CEUS評價不同時期大鼠肝泡狀棘球蚴病(HAE)血流灌注的價值。方法采用CEUS觀察70只成功感染HAE的大鼠在接種后不同時期(9、28、50周)的血流灌注特征，并與病理結(jié)果對照。結(jié)果接種9周時55個(55/70，78.57%)病灶表現(xiàn)為高回聲，15個(15/70，21.43%)病灶表現(xiàn)為混合性回聲，病理表現(xiàn)為乳白色單/多囊泡樣結(jié)構(gòu)。隨接種時間的延長(28、50周)，病灶最大徑逐漸增大，病灶內(nèi)部實性成分及鈣化灶逐漸增多，部分病灶可出現(xiàn)液化壞死。鏡下病灶周邊纖維組織逐漸增厚，周邊見微血管聚集區(qū)。接種9周時CEUS顯示病灶呈環(huán)狀強化及分隔樣強化，28周及50周時呈環(huán)狀強化或伴細線樣強化及無強化。CEUS后病灶邊緣增強帶最大寬度與病灶最大徑比值隨接種時間延長而逐漸減小(P=0.02)。結(jié)論接種后不同時期大鼠HAE病灶的超聲征象漸趨復(fù)雜，壞死區(qū)及鈣化灶增加，CEUS可顯示不同時期病灶周邊及內(nèi)部的血流灌注特征。

泡狀棘球蚴；肝；超聲檢查

常規(guī)影像學方法(超聲、CT及MRI等)對肝泡狀棘球蚴病(hepatic alveolar echinococcosis, HAE)的診斷有重要價值，但均不能準確評價病灶活性狀態(tài)[1]。FDG-PET可通過病灶攝取FDG的情況，反映HAE病灶周圍的炎性反應(yīng)而間接評價蟲體的活性狀態(tài)[2-3]，但PET設(shè)備昂貴，普及率差，不適合作為常規(guī)檢查方法。故本研究利用CEUS可直觀定量評價病灶微血供情況[4-6]的優(yōu)勢，通過評價大鼠HAE的微血流灌注情況，觀察接種后不同時期HAE病灶血流灌注的演變規(guī)律。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SD大鼠70只(由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供)，雌雄不限，清潔級，體質(zhì)量(220±20)g，鼠齡8～10周。種鼠為經(jīng)腹腔感染泡狀棘球蚴的長爪沙鼠2只(由新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院動物實驗科學部提供)，體質(zhì)量65 g。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審查通過(審批號：IACUC20150423-06)。

1.2模型制備 處死種鼠，剖腹取出泡狀棘球蚴組織，除去壞死組織，剩余組織稱重、剪碎、研磨、過篩，制成勻漿；生理鹽水反復(fù)沖洗沉淀3次、過濾；剩余組織加生理鹽水，配制成濃度為20%的混懸液(20 000個原頭節(jié)/ml)，加入適量青霉素和鏈霉素注射液(藥物濃度為250 U/ml)。將SD大鼠麻醉，開腹直視下選較厚的肝葉，注射器針頭斜行刺入肝實質(zhì)約1 cm，注入20%原頭節(jié)混懸液0.2 ml，紗布壓迫止血，絲線逐層縫合關(guān)閉腹腔。

1.3CEUS檢查 采用Siemens Sequia 512超聲儀，高頻探頭，頻率8～15 MHz，選用CPS模式，機械指數(shù)為0.08～0.11。70只成功感染HAE的大鼠于接種后第9周、28周、50周分別進行常規(guī)超聲及CEUS檢查。大鼠麻醉后備皮，充分暴露上腹部，取仰臥位或左側(cè)臥位，先行常規(guī)超聲、CDFI檢查，詳細記錄病灶部位、大小、形態(tài)、邊界、內(nèi)部回聲以及有無血流信號等。造影劑為聲諾維(SonoVue)，使用前注入5 ml 生理鹽水，搖勻，配置成混懸液，留置備用。經(jīng)大鼠尾靜脈注入混懸液0.5 ml，隨即用1 ml生理鹽水進行沖管，觀察持續(xù)2 min以上。觀察并記錄CEUS增強模式，留取較為清晰的圖像儲存于超聲工作站。

1.4CEUS評價 注射造影劑后2～20 s為動脈期，肝動脈顯影，肝組織為低回聲；21～40 s為門靜脈期，門靜脈開始顯影，肝實質(zhì)回聲均勻性增強；41 s后為延遲期，肝實質(zhì)回聲均勻性減低。觀察造影增強模式，選擇動脈期病灶周邊環(huán)狀增強帶最寬處測量其最大徑，即病灶增強的范圍；同時測量病灶最大徑，均測量3次取平均值。計算增強帶與病灶最大徑的比值。

1.5病理檢查 接種后9、28、50周CEUS檢查結(jié)束后，隨機抽取10只大鼠進行病理檢查。剖腹取出大鼠肝臟，觀察病灶的形態(tài)，測量病灶大小。對所取肝組織常規(guī)石蠟包埋、切片(厚5 μm)，進行HE染色、Masson染色，觀察病灶的炎性反應(yīng)、微血管和纖維組織。

1.6統(tǒng)計學分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件，不同時期病灶最大徑、增強帶最大徑、增強帶與病灶最大徑的比值均不符合正態(tài)分布和方差齊性，以中位數(shù)表示，組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。兩兩比較采用Wilcoxon秩和檢驗，根據(jù)比較次數(shù)調(diào)整檢驗水準，P<0.017為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1大鼠HAE不同時期CEUS特征及病理基礎(chǔ)

2.1.1接種9周 接種9周時(n=70)，病灶最大徑中位數(shù)5.86 mm，55個(55/70，78.57%)病灶表現(xiàn)為高回聲，包括點狀高回聲(1型；10/70，14.29%)、簇狀細小高回聲(2型；21/70，30.00%)、灶狀高回聲(3型；24/70，34.29%)；15個病灶(4型；15/70，21.43%)表現(xiàn)為肝內(nèi)混合性回聲(無回聲伴高回聲分隔)。8個(8/70，11.43%)最大徑≥7 mm的4型病灶內(nèi)可見鈣化灶。

55個(55/70，78.57%；圖1A)病灶CEUS表現(xiàn)為動脈期環(huán)狀強化，門靜脈期廓清(圖1B)，見于直徑<3 mm的病灶；15個(15/70，21.43%)表現(xiàn)為動脈期環(huán)狀強化伴分隔強化，類似“調(diào)色碟樣”改變，靜脈期開始廓清，見于直徑≥3 mm的病灶。病理表現(xiàn)為米黃色或乳白色單/多囊泡樣結(jié)構(gòu)，HE染色病灶周邊可見紅染纖維結(jié)構(gòu)，內(nèi)呈空泡樣改變，與肝組織交界區(qū)可見微血管聚集(圖1C)。Masson染色可清晰顯示病灶周邊藍染纖維結(jié)構(gòu)(圖1D)。

2.1.2接種28周 接種28周時(n=56)，病灶最大徑中位數(shù)8.40 mm，34個(34/56，60.71%)病灶表現(xiàn)為高回聲；22個(22/56，39.29%)病灶表現(xiàn)為混合性回聲，病灶內(nèi)部實性高回聲成分較9周時增多。11個病灶(11/56，19.64%)內(nèi)部及邊緣可見數(shù)量不等的鈣化灶。34個(34/56，60.71%)病灶CEUS表現(xiàn)為動脈期環(huán)狀強化，22個(22/56，39.29%)表現(xiàn)為內(nèi)部伴線樣增強，門靜脈期持續(xù)強化，延遲相廓清(圖2A、2B)。大體病理見病灶外觀呈不規(guī)則石灰色或米黃色，類似“樹根樣”盤置于肝內(nèi)，剖面呈多房狀改變，其間夾雜少量黏液，HE染色可見紅染纖維組織與不規(guī)則液性區(qū)域交織分布，病灶邊緣處可見微血管及炎性細胞(圖2C)。Masson染色可顯示藍染纖維結(jié)構(gòu)和液性無染色區(qū)(圖2D)。

2.1.3接種50周 接種50周時(n=45)，病灶最大徑中位數(shù)10.20 mm，25個(25/45，55.56%)病灶表現(xiàn)為高回聲；20個(20/45，44.44%)病灶表現(xiàn)為高回聲、極低回聲及無回聲區(qū)混合分布。17個(17/45，37.78%)病灶內(nèi)部及周邊可見鈣化灶。38個(38/45，84.44%)病灶動脈期周邊呈不規(guī)則環(huán)狀強化，門靜脈期持續(xù)強化，延遲相廓清(圖3A、3B)；7個(7/45，15.56%)病灶周邊及內(nèi)部造影全程均未見強化。大體病理見病灶外觀呈石灰色或米黃色，外形不規(guī)則；剖面以火山石樣結(jié)構(gòu)為主，夾雜少量黏液。HE染色病灶周邊呈厚壁紅染纖維結(jié)構(gòu)，病灶與肝組織交界處見微血管伴炎性細胞(圖3C)。Masson染色可清晰顯示病灶周邊藍染纖維結(jié)構(gòu)(圖3D)。

2.2病灶周邊增強帶與病灶最大徑之比在接種不同時期的變化 隨著病程進展，病灶最大徑逐漸增大，病灶周邊增強帶與最大徑的比值逐漸減小，總體差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。接種50周時病灶周圍增強帶與最大徑比值均小于28周和9周病灶(P均<0.01)。接種后不同時期病灶周圍增強帶最大徑差異無統(tǒng)計學意義(P=0.17)。見表1。

表1 不同接種時間病灶最大徑、病灶周圍增強帶最大徑及兩者比值比較(中位數(shù))

圖1 接種9周時大鼠HAE病灶CEUS及病理圖 A.動脈期病灶呈環(huán)狀強化(箭); B.門靜脈期廓清(箭); C.病理圖(HE，×100)示病灶邊壁(箭)見多個芽生子囊(箭頭); D.病理圖(Masson，×100)示邊壁呈藍染纖維結(jié)構(gòu)(箭) 圖2 接種28周時大鼠HAE病灶CEUS及病理圖 A.動脈期病灶內(nèi)呈分隔樣強化(箭); B.門靜脈期持續(xù)強化(箭); C.病理圖(HE，×40)示病灶周邊纖維組織; D.病理圖(Masson，×20)邊壁呈藍染纖維結(jié)構(gòu)(箭) 圖3 接種50周時大鼠HAE病灶CEUS及病理圖 A.動脈期病灶呈環(huán)狀強化(箭); B.門靜脈期病灶持續(xù)強化(箭); C.病理圖(HE，×40)示病灶周邊纖維組織; D.病理圖(Masson，×20)示邊壁呈藍染纖維結(jié)構(gòu)(箭)

3 討論

HAE病灶不同時期血管化及纖維化狀態(tài)的交替出現(xiàn)，構(gòu)成了該病進展的基本病理改變，血管化貫穿整個病程。因此，HAE病灶周邊及內(nèi)部血管的多少決定病灶的活性狀態(tài)。CT灌注、MR擴散加權(quán)成像、CEUS研究[7-9]均表明HAE與肝組織交界處存在富含微血管的區(qū)域，但血管化狀態(tài)在HAE進展中的演變規(guī)律，以及與病灶活性狀態(tài)的關(guān)系，仍有待進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)接種9周時大鼠HAE的增強方式主要有2種，最大徑<3 mm的病灶，增強模式主要為動脈期環(huán)狀增強，靜脈期逐漸消退；最大徑≥3 mm的病灶，增強模式主要為動脈周邊環(huán)狀增強伴內(nèi)部分隔強化，靜脈期開始消退。由于本研究采用純血池顯像造影劑，因此，HAE病灶增強區(qū)域與病理顯示的病灶周邊有豐富微血管增殖的炎性反應(yīng)區(qū)一致。造影過程中無增強的區(qū)域為囊泡樣結(jié)構(gòu)[10-11]，且早期大鼠HAE在病理上既可表現(xiàn)為單囊泡也可表現(xiàn)為多囊泡樣結(jié)構(gòu)。

本研究發(fā)現(xiàn)隨接種時間的延長，在接種不同時期大鼠HAE病灶周邊環(huán)狀增強區(qū)的寬度差異無統(tǒng)計學意義(P=0.17)。由于病灶體積逐漸增大，但病灶周邊的微血管富集區(qū)并未隨病灶體積增大而增寬，因此病灶周邊增強帶與病灶最大徑的比值逐漸減小。接種后50周顯著小于接種后9周和28周，提示相對于病灶體積的增大，病灶周邊的滋養(yǎng)血管不能充分滿足其生長需求，加之病灶邊緣小囊泡釋放囊液刺激周圍組織，導致纖維組織增生，病灶呈相對乏血供狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)CEUS后病灶內(nèi)部未見強化或僅可見分隔樣強化，提示HAE病灶內(nèi)部為乏血供狀態(tài)。既往研究[12-13]通過CT灌注成像、DWI及PET/CT檢查亦有類似發(fā)現(xiàn)。

接種早期HAE病灶動脈期呈環(huán)狀增強，門靜脈期呈低增強，提示病灶血供主要來源于肝動脈。隨病程進展，病灶周圍動脈血管截斷，門靜脈逐漸參與供血，因此，中晚期病灶出現(xiàn)門靜脈期持續(xù)強化的特征。HAE病灶內(nèi)部鈣化灶被視為與肝內(nèi)其他病變鑒別的特異性影像學表現(xiàn)，并可用來評價對HAE病灶的藥物治療效果[14]。本研究中隨著接種時間延長，病灶內(nèi)部鈣化灶逐漸增多，提示HAE病灶伴鈣化或液化壞死多預(yù)示病灶處于較晚期[15]。

本研究的不足：目前該類研究僅限于動物實驗階段，采用CEUS評價HAE病灶生物學活性的臨床價值，仍有待通過大量臨床研究驗證；由于HAE的演變及活性狀態(tài)過程復(fù)雜，期間是否有除新生血管化因素外其他機制的參與仍有待進一步研究。

總之，本研究對成功感染HAE后不同時期的大鼠進行CEUS，結(jié)果表明隨病程進展，病灶邊緣增強帶與病灶最大徑的比值逐漸減小，提示病灶血供逐漸減少。因此，采用CEUS可動態(tài)反映HAE病灶的血流灌注情況。

(致謝：本文英文摘要承蒙美國國家癌癥研究所 弗雷德里克國家實驗室圖像分析及可視化研究項目組負責人劉雁翎博士修改潤色，特此表示由衷的感謝！)

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CEUSindynamiclyassessingbloodperfusionofhepaticalveolarechinococcosisinrats

ZENGHongchun1,WANGYingxin1,WANGJunhua2,HANWei1,LIUWenya3*

(1.DepartmentofUltrasonography, 2.XinjiangKeyLaboratoryofBasedMedicineandHydatid, 3.ImagingCenter,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

ObjectiveTo evaluate the value of CEUS in dynamicly assessing the blood perfusion of hepatic alveolar echinococcosis (HAE) in rats.MethodsThe experimentally induced secondary HAE in totally 70 rats were studied at different time periods (9th week, 28th week, and 50th week) with CEUS, and compared to pathology results.ResultsAt the 9th week, 55 HAE lesions (55/70, 78.57%) presented hyperechoic and the rest of 15 HAE lesions (15/70, 21.43%) presented mixed echogenicity. The single or multiple vesicular structures were found as pathological feature. At later stages (28th week and 50th week), the size of lesions increased compared to 9th week with more solid structures and the calcifications found in HAE lesions. Microscopically, the fibrous tissues surrounding the lesions gradually thickened and the microvascular accumulation were visible around the lesions. The HAE lesions at the 9th week showed the ring enhancement and central septa enhancement in CEUS. The HAE lesions at the 28th week and 50th week showed combinations of no enhancement, ring enhancement, and central septa enhancement in CEUS. The ratio of edge enhancement to maximum diameter of lesions decreased with the progression (P=0.02).ConclusionThe ultrasonographic features in HAE lesions become more complicated with increasing calcifications and enlarged necrosis areas with the progression. The CEUS can reveal the dynamics of blood perfusion of HAE lesions at different stages.

Alveolar echinococcosis; Liver; Ultrasonography

國家自然科學基金(81460267)。

曾紅春(1977—)，女，山東菏澤人，博士，主任醫(yī)師、副教授。研究方向：腹部及淺表器官的超聲診斷。

E-mail: zenghongchun1168@126.com

劉文亞，新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院影像中心，830011。E-mail: dr_ykdxlwy@163.com

2017-03-17 [

] 2017-07-09

10.13929/j.1672-8475.201703026

R383.3; R445.1

A

1672-8475(2017)09-0566-05