青葉膽乙醇提取物有效成分的含量測(cè)定

王龍+何旭+郝長(zhǎng)敏

摘 要：[目的] 建立青葉膽乙醇提取物中1，5，8-三羥基-3-甲氧基口山酮的含量測(cè)定方法。[方法] 采用反相高效液相法對(duì)其主要成分1，5，8-三羥基-3-甲氧基口山酮進(jìn)行含量測(cè)定，測(cè)定條件為：色譜柱：Diamonsil C18（4.6×250mm，5μm）不銹鋼柱，流動(dòng)相：乙腈-水（50：50）；流速：1ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；[結(jié)果] 建立了高效液相法測(cè)定青葉膽乙醇提取物中1，5，8-三羥基-3-甲氧基口山酮含量的方法，進(jìn)樣量在0.056-0.280μg之間，呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.9999；

關(guān)鍵詞：青葉膽 含量測(cè)定 1，5，8-三羥基-3-甲氧基口山酮

青葉膽S.mileensisT.N.HoetW.I.Shi系龍膽科獐牙菜屬植物，在民間屬于該屬中的青葉膽類，主要分布于我國(guó)云南，在云南哈尼族、彝族、及周邊地區(qū)民間常用于治療肝膽類疾病[1]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，從青葉膽中分離得到的齊墩果酸、環(huán)烯醚萜類成分、口山酮類成分具有保肝、抗炎的作用。其中環(huán)烯醚萜類成分含量最高，而近年來(lái)，隨著對(duì)化學(xué)成分研究的深入，口山酮類成分的抗肝炎成為了青葉膽研究的熱點(diǎn)，其中最主要的成分為1，5，8-三羥基-3-甲氧基口山酮，其與齊墩果酸可發(fā)生協(xié)同作用，達(dá)到良好的抗肝炎效果。青葉膽中口山酮類成分較多存在于乙醇提取物中[2-3]。而對(duì)此成分的含量測(cè)定文獻(xiàn)報(bào)道較少，因此本文對(duì)1，5，8-三羥基-3-甲氧基口山酮進(jìn)行了含量測(cè)定方法的研究。

1 試劑及儀器

1.1試劑

三批青葉膽乙醇提取物干粉（自制，80%乙醇回流提取），批號(hào)2016001、2016002、2016003，1，5，8-三羥基-3-甲氧基口山酮對(duì)照品（購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，歸一化法檢查，含量為98%以上），甲醇為色譜純（河北邢臺(tái)化學(xué)試劑有限責(zé)任公司），磷酸為分析純（河北邢臺(tái)化學(xué)試劑有限責(zé)任公司），水為超純凈水。

1.2儀器

HP1100型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司），G1314A型紫外檢測(cè)器（安捷倫科技有限公司），C18色譜柱4.6×250mm，5μm（迪馬科技有限公司）、BP211D型電子分析天平（南京創(chuàng)瑞科技儀器儀表有限公司）、SY型超聲提取器（上海寧商超聲儀器有限公司）

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件的選擇

色譜柱：Diamonsil C18（4.6×250mm，5μm），填料為十八烷基硅烷健合硅膠；流動(dòng)相：乙腈-水（50：50）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm； 流速：1ml/min；柱溫：30℃。

2.2 樣品的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取1，5，8-三羥基-3-甲氧基口山酮對(duì)照品5.60mg，置200ml量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成0.0280mg/ml的對(duì)照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備

取2011001批青葉膽乙醇提取物約30mg，精密稱定，置100ml容量瓶中，加入甲醇80ml，超聲處理30分鐘，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，靜置。精密吸取上清液5ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得1，5，8-三羥基-3-甲氧基口山酮供試品溶液。

2.3 流動(dòng)相的吸收度，柱效及分離度

經(jīng)過(guò)測(cè)試，流動(dòng)相的吸收度為0.05，符合《中國(guó)藥典》2015年版要求。

柱效測(cè)定：取對(duì)照品溶液適量，注入色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算1，5，8-三羥基-3-甲氧基口山 酮的理論板數(shù)。N=5.54×tR/W1/2=16523。

分離度：從樣品圖看1，5，8-三羥基-3-甲氧基口山 酮和雜質(zhì)峰能達(dá)到基線分離，雜質(zhì)峰對(duì)樣品峰沒(méi)有影響，見(jiàn)圖2。

2.4 提取方法的考察

取2016001批青葉膽乙醇提取物，采用不同的提取溶劑進(jìn)行提取， 進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

試驗(yàn)結(jié)果表明不同提取方法均能將1，5，8-三羥基-3-甲氧基口山 酮提取完全，為簡(jiǎn)便操作，故選擇甲醇超聲提取。

2.5 提取時(shí)間的考察

取2016001批青葉膽乙醇提取物，采用不同時(shí)間甲醇超聲提取，結(jié)果見(jiàn)表2。

試驗(yàn)結(jié)果表明采用甲醇超聲提取30分鐘，即可將提取物中的1，5，8-三羥基-3-甲氧基口山 酮提取完全。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 對(duì)照品和樣品的色譜圖

分別取1，5，8-三羥基-3-甲氧基口山酮供試品溶液、對(duì)照品溶液各10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1、2。

2.6.2 線性關(guān)系考察

分別吸取1，5，8-三羥基-3-甲氧基口山酮對(duì)照品溶液5ml、10ml、15ml、20ml、25ml至25ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配制濃度為0.0056 mg/ml、0.0112 mg/ml、0.0168 mg/ml、0.0224 mg/ml、0.0280 mg/ml的對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣10μl，測(cè)得峰面積，結(jié)果見(jiàn)表3。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作圖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3，在進(jìn)樣量為0.056-0.280μg之間，呈良好的線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=5488.3X-24.539，相關(guān)系數(shù)r=0.9999。

2.6.3 精密度試驗(yàn)

取供試品溶液15ml置于25ml容量瓶中，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積為880.976，892.564，890.146，899.489，894.856 ，平均峰面積X=891.606 ，計(jì)算 RSD（%）=0.77%，表明本方法精密度良好。

2.6.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取2016001批青葉膽乙醇提取物，精密稱取5份，按供試品制備法處理，進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表16。X=9.33% ，RSD（%）=0.87%，結(jié)果表明，測(cè)定方法的重現(xiàn)性良好，見(jiàn)表4。

2.6.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取2016001批青葉膽乙醇提取物，按供試品制備方法處理，得樣品溶液，每隔2小時(shí)進(jìn)樣1次，結(jié)果見(jiàn)表5。X=9.46%，RSD（%）=1.46%，表明樣品在16小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.6 回收率試驗(yàn)

取已知含量的2016001批青葉膽乙醇提取物5份，各約15mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加入濃度為0.0345mg/ml的對(duì)照品溶液，按法處理，各取10μl進(jìn)樣，結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果平均回收率X=98.47%，RSD=0.95%。

2.6.7 樣品測(cè)定

取三批青葉膽乙醇提取物干粉，取約30mg，按供試品制備方法處理，各取10μl進(jìn)樣，結(jié)果見(jiàn)表 7。

3 結(jié)論

青葉膽乙醇提取物的保肝利膽活性成分主要為總口山酮和齊墩果酸的有效部位。其總口山酮中又以1，5，8-三羥基-3-甲氧基口山酮的保肝降酶作用最為關(guān)鍵，并與齊墩果酸之間存在協(xié)同關(guān)系，本文主要針對(duì)1，5，8-三羥基-3-甲氧基口山酮進(jìn)行了含量測(cè)定方法的研究。實(shí)驗(yàn)對(duì)提取時(shí)間及提取溶劑進(jìn)行了考察，經(jīng)過(guò)超聲等處理后，干擾比較少，且穩(wěn)定性和重復(fù)性好，在達(dá)到了含量測(cè)定的要求，是一種理想的1，5，8-三羥基-3-甲氧基口山酮含量測(cè)定方法。

參考文獻(xiàn)：

[1] 周榮漢，段金廒.植物化學(xué)分類學(xué)[M].上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2005：987-988.

[2] 何仁遠(yuǎn)，馮樹基，聶瑞麟.青葉膽口山酮成分的分離和鑒定[J].云南植物研究，1982，4（1）：68，76.

[3] 劉嘉森，黃梅芬.青葉膽中雛菊葉龍膽酮成分的分離和鑒定[J].中草藥，1982，13（10）：433-434.

作者簡(jiǎn)介：

王龍（1986-），男，河北內(nèi)丘人，碩士，研究方向：中藥學(xué)