探索合成生物學(xué)的方法大規(guī)模生產(chǎn)中藥天然產(chǎn)物

鄧偉欽

摘要：中藥中的有效成分絕大多數(shù)來(lái)源于植物的次生代謝的天然產(chǎn)物，而許多有效天然產(chǎn)物都來(lái)源于珍貴藥材。人們可以通過(guò)合成生物學(xué)的途徑對(duì)表達(dá)有效產(chǎn)物的基因進(jìn)行挖掘，然后對(duì)其進(jìn)行設(shè)計(jì)和標(biāo)準(zhǔn)化，通過(guò)在底盤細(xì)胞中進(jìn)行裝配，可以重建細(xì)胞的代謝途徑，使之生產(chǎn)單一的目標(biāo)產(chǎn)物。且合成生物學(xué)最大的特點(diǎn)就是工程化，將傳統(tǒng)的種植提取轉(zhuǎn)變?yōu)槲⑸锇l(fā)酵，進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：合成生物學(xué) 天然產(chǎn)物 微生物發(fā)酵

大多數(shù)天然產(chǎn)物來(lái)源于植物的次生代謝途徑。在生物體內(nèi)，初生代謝產(chǎn)物作為底物，再經(jīng)復(fù)雜的體內(nèi)化學(xué)反應(yīng)生成了各種不同的天然產(chǎn)物。如萜類化合物的生物合成，它們均是由初級(jí)代謝產(chǎn)物IPP/DMAPP等前體經(jīng)過(guò)一系列體內(nèi)催化得到。早在2006年，美國(guó)加州大學(xué)伯克利分校就人工構(gòu)建了酵母菌的代謝途徑并成功合成了青蒿素的前體—青蒿酸，充分證實(shí)了合成生物學(xué)方法的可行性和巨大的潛在價(jià)值。下面簡(jiǎn)單闡述中藥天然產(chǎn)物的合成途徑：

一、 對(duì)中藥藥用成分次生代謝途徑關(guān)鍵酶基因的篩選與克隆

得益于高通量基因測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，目前人類已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)自然界任一物種進(jìn)行基因測(cè)序并獲得其完整基因組信息。與此同時(shí)，自然界生物的基因庫(kù)信息日趨完整，人們將資料共享，也使得工作進(jìn)展更加順利。人們可以通過(guò)對(duì)比前后兩種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，判斷其缺少哪些化學(xué)基團(tuán)，并推斷其由什么酶系進(jìn)行催化，再通過(guò)尋找其基因家族逐個(gè)進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)直到有目標(biāo)產(chǎn)物的生成。確定下來(lái)催化基因后，只需提取其RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再由確定下來(lái)的基因設(shè)計(jì)PCR引物，即可對(duì)催化基因進(jìn)行克隆。

二、 次生代謝途徑的解析

有機(jī)化學(xué)合成歷史悠久，積累了豐富的物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)及其合成過(guò)程經(jīng)驗(yàn)。人們現(xiàn)在可以在有機(jī)化學(xué)書(shū)本上找到許多物質(zhì)的化學(xué)合成途徑。與中藥天然產(chǎn)物合成密切相關(guān)的途徑主要有乙酸-丙二酸途徑（脂肪酸類、酚類、醌類），甲戊二氫酸途徑（萜類、甾體化合物），莽草酸途徑（苯丙素類、木質(zhì)素類、香豆素類），氨基酸途徑（生物堿），復(fù)合途徑（查爾酮類、二氫黃酮類）。

三、 生物元件的改造與標(biāo)準(zhǔn)化

生物元件主要有三種類型：

① 基因表達(dá)的調(diào)控元件：?jiǎn)?dòng)子、終止子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、核糖開(kāi)關(guān)等；

② DNA序列及質(zhì)粒載體骨架序列；

③ 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和蛋白質(zhì)編碼序列。

如今人們已經(jīng)構(gòu)建了豐富的生物元件庫(kù)，如Igem registry。目前實(shí)現(xiàn)了強(qiáng)度跨度大，梯度密集的元件庫(kù)的構(gòu)建，且其強(qiáng)度可以由軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)，為后續(xù)生物合成途徑的代謝流平衡優(yōu)化與復(fù)雜遺傳環(huán)路的設(shè)計(jì)提供了堅(jiān)實(shí)的保障。

四、 底盤細(xì)胞的設(shè)計(jì)與構(gòu)建

為使細(xì)胞能夠?qū)Ｒ坏厣a(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物，人們需要對(duì)微生物的基因進(jìn)行改造，即敲除掉大部分對(duì)表達(dá)產(chǎn)物無(wú)關(guān)的基因，留下的基因使其僅僅能夠維持自身基礎(chǔ)的生命代謝與合成目標(biāo)產(chǎn)物。底盤細(xì)胞的設(shè)計(jì)同時(shí)遵守兩種設(shè)計(jì)思路，一種是“自上而下”的改造，即通過(guò)敲除的方法減少其基因組，實(shí)現(xiàn)最小基因組的裝配；另一種思路則是“自下而上”的設(shè)計(jì)，通過(guò)預(yù)測(cè)生物合成所需要的基因進(jìn)行完整基因組的設(shè)計(jì)。目前大腸桿菌、啤酒酵母、鏈霉菌及枯草芽孢桿菌已被證明是非常具有潛力的異源合成細(xì)胞。但在目前技術(shù)條件下，不同來(lái)源的基因還無(wú)法與宿主基因直接整合表達(dá)，往往需要進(jìn)行表達(dá)調(diào)控原件替換、密碼子優(yōu)化等操作來(lái)消除種屬差異。

五、代謝途徑的裝配與集成

主要包括兩個(gè)方面：基因組裝與基因組編輯

基因組裝目前使用最廣泛的方法是GIBSON等溫一步法：需要一個(gè)線性化的載體和若干個(gè)PCR產(chǎn)物，在相鄰兩個(gè)DNA片段之間有20-40bp的重疊區(qū)。在反應(yīng)階段，T5外切酶將DNA5端序列消化，形成了3突出的粘端，然后再50℃下使得T5外切酶失活的同時(shí)，片段之間的重疊區(qū)退火連接，最后在phusion聚合酶的作用下補(bǔ)平片段間的間隔區(qū)，利用Taq DNA連接酶連接DNA缺刻。

基因組編輯技術(shù)目前最普遍的莫過(guò)于CPISPR-CAS9/CRISPR-CFP1，下面講講CRISPR-CAS9：

CPISPR：規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)，是細(xì)菌面對(duì)噬菌體侵染的一種自我免疫機(jī)制。主要分為三個(gè)階段：

① 獲取侵染的DNA序列并插入到CPISPR基因座的重復(fù)序列中；

② CAS蛋白表達(dá)，含spacer的CRISPR序列轉(zhuǎn)錄為前體crRNA，接著加工成成熟的crRNA，在typeII中，非編碼的traRNA與crRNA的重復(fù)序列結(jié)合；

③ CAS蛋白在crRNA的介導(dǎo)下識(shí)別指定靶標(biāo)序列并切割。

CPISPR-CAS9由sgRNA（traRNA與crRNA結(jié)合）引導(dǎo)與特定DNA結(jié)合，特定DNA上必須含有PAM序列（NGG），DNA被CAS9蛋白切割后雙鏈斷裂，引發(fā)體內(nèi)兩套修復(fù)系統(tǒng)的修復(fù)，一種是錯(cuò)誤傾向的非同源末端連接修復(fù)（NHEJ），一種是精確的同源重組修復(fù)（HR）（需加入一段供體DNA作為模板）。通過(guò)引入多個(gè)sgRNA，CAS9可以同時(shí)切割多個(gè)位點(diǎn)，可應(yīng)用于大規(guī)模的染色體重排。

六、 藥用活性成分的異源合成與結(jié)構(gòu)鑒定

典型例子就是青蒿酸的合成、紫杉二烯的生物合成。

在大腸桿菌內(nèi)，IPP/DMAPP不是通過(guò)MVP途徑獲得的，敲除DXP還原酶基因，抑制其本身的非甲羥戊酸途徑，然后將酵母的甲羥戊酸途徑及優(yōu)化密碼子的紫穗槐二烯合酶（ADS）基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌體內(nèi)，誘導(dǎo)其產(chǎn)生紫穗槐二烯。最后將源于青蒿的細(xì)胞色素P450單加氧酶基因?qū)氪呋洚a(chǎn)生青蒿酸。

七、 代謝途徑的優(yōu)化與改造

a） 密碼子偏好性優(yōu)化；

b） 啟動(dòng)子強(qiáng)弱調(diào)節(jié)；

c） 代謝支路抑制。

八、 目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量提高

中藥類目標(biāo)產(chǎn)物主要有苯丙素類、黃酮類、萜類、生物堿、甾體。

根據(jù)分離物質(zhì)的極性不同，我們可以采用柱色譜進(jìn)行分離，如硅膠柱色譜、大孔吸附樹(shù)脂柱色譜等，還可以通過(guò)HPLC、紫外分光光度法、薄層硅膠層析等方法鑒定物質(zhì)的種類，測(cè)定其含量等。

九、 總結(jié)與展望

隨著合成生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，底盤細(xì)胞的不斷完善及基因編輯技術(shù)的不斷改進(jìn)，用微生物進(jìn)行天然產(chǎn)物的合成必將會(huì)有一個(gè)光明的前景。

參考文獻(xiàn)：

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