蒽對刺參、鮑魚體內GSH酶活性的影響研究

王紅永

摘要：本實驗研究了刺參、鮑魚（在實驗條件下暴露在不同濃度的蒽后，刺參和鮑魚體內谷胱甘肽酶活性在不同時間段的動態(tài)變化情況，并分析了刺參、鮑魚體內GSH酶活性與蒽濃度之間的劑量、時間-效應之間的關系。結果表明，在實驗中海水空白與丙酮對照組之間沒有顯著差異。在蒽對刺參的污染實驗中，筆者發(fā)現(xiàn)隨著污染物濃度的增加GSH酶活性也增加，并且蒽對GSH酶活性誘導效應最強的時間是在12h。在凈化實驗中，各污染物濃度組GSH酶活性與對照組相比差異不太明顯，說明實驗濃度沒有嚴重的超出刺參自身抗氧化系統(tǒng)的能力，在此濃度范圍內被污染的刺身可以通過凈化實驗來恢復自身的抗氧化功能。

關鍵詞：蒽（anthracene）；刺參；鮑魚；GSH酶活性

1引言

我國由于歷史原因對有機物化學藥品的重視程度還不夠，故相應的研究還比較滯后，相關的資料比較匱乏。尤其是有關難降解有機物的研究更少。由于難降解有機物在環(huán)境中的停留時間較長，尤其是在海洋中的停留時間，所以未來對難降解有機物影響的研究將是重點。因此，研究多環(huán)芳烴——蒽對海洋生物的致毒效應對于整個海洋生物資源乃至整個海洋生態(tài)系統(tǒng)的保護都具有非常重要的意義。

2實驗材料

2.1實驗生物

刺參、鮑魚（長約3cm）購自大連海寶生物有限公司，養(yǎng)在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中每隔三天更換一次新鮮海水，并且每天分別投喂魚粉和海帶。

2.2實驗藥品

蒽純度大于99%，購自Sigma試劑公司（Sigma—Aldrich，St.Louis，MO）、其它試劑TCA（三氯乙酸）、Tris、DTNB、丙酮、GSH等均為國產(chǎn)分析純。

2.3實驗儀器

燒杯（1000mL）、10mL比色管、2cm石英比色皿、10～50uL、50～100uL、100～1000uL移液槍三支、鑷子、電子稱量平、稱量紙、擦鏡紙、量筒若干、試管架、曝氣頭、721光分光光度器、25攝氏度水浴箱（一個）、計時器、剪刀、離心機、刻度吸管、試劑瓶、玻璃勻漿管。

2.4海水

取自大連市黑石礁海區(qū)，并經(jīng)砂濾后抽取使用。溫度為14±1℃，pH為7.9-8.1，鹽度為30。

3實驗方法

3.1 GSH標準曲線的繪制

配制25？MGSH儲備液，分別取0、0.6、1.2、1.8、2.4、3mL的GSH儲備液于6支10mL的比色管中，然后分別向比色管中加入3、2.4、1.8、1.2、0.6、0mL的純水，混勻后各加100？LTCA，同時加入2mLTris緩沖溶液，在25C的恒溫水浴鍋中加熱5分鐘后在分別加入20uLDTNB，混勻顯色25分鐘后，分光光度計（波長為415nm）測吸光值（第一個管為對照管），以X軸為GSH的濃度，Y軸為吸光度值（A-A0），制作標準曲線。得到標準曲線方程 y=21.609x+0.0660。

3.2慢性毒性實驗

1.將刺參和鮑魚清洗干凈，選取18個1000mL的燒杯中分別加入1000mL海水（每4個燒杯為一組，刺參設置兩組平行，鮑魚不設平行），另外兩個燒杯分別為空白和丙酮對照組（對照組投入海參）。并分別在實驗組中依次投入蒽使溶液，使每個燒杯中蒽的濃度分別是1、5、10、20 ？g/L，對照組不加蒽溶液（海水對照組不加任何污染物、丙酮對照組加20 ？L的丙酮），并且曝氣。

2.從第一次加入蒽試劑開始每隔三天更換一次新鮮海水，并依次按前面的步驟加入藥品，直至第14d后不再加入蒽試劑。

3.在實驗開始后在2h、6h、12h、24h、48h、4d、7d、21d后分別依次在每個燒杯中取樣（刺參每個濃度下取3個，鮑魚每個濃度取一只），裝入小塑料袋放在冰箱中進行冰凍待測。在暴露14d后刺參和鮑魚在海水中凈化一個星期，在第21d再取樣觀察其自身恢復情況。然后測定刺參和鮑魚體內GSH酶活性，實驗期不投喂。

3.3組織勻漿的制備

將經(jīng)藥物脅迫后的刺參、鮑魚先進行解凍，然后用剪刀剪碎，并用分析天平稱取組織塊0.2～1.0g左右，并加入其質量9倍的冷生理鹽水，在玻璃勻漿管中充分研磨20次左右（6～8分鐘），然后把制備好的組織勻漿用普通離心機4000轉/分，離心l5 min，然后取上清液進行GSH酶活性的測定。

3.4酶活性測定

準備18支用純水清洗干凈的10mL比色管，每組4支（海參設置兩組平行，鮑魚不設平行組），另兩只為照組。分別加入100uL已經(jīng)離心好的濃度為1？g/L、5？g/L、10？g/L、20？g/L勻漿上清液，對照組加對應的對照組上清液，然后加入2mLTris緩沖溶液，100？LTCA搖勻后在25℃的恒溫水浴鍋中加熱5分鐘后加入100？L2.5mMDTNB混勻顯色25分鐘后，在415nm處測定其吸光度。

3.5酶活性計算公式

GSH含量=21.609*（A-A0）+0.066

4數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用平均值±標準偏差表示。采用Excel、Sigmaplot12.5制作圖表，用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。顯著性差異檢驗采用單因素方差分析（ANOVA）和Tukey檢驗法，相關性分析采用皮爾遜（Pearson）方法，P<0.05 時被認為差異顯著，P<0.01 時被認為差異極顯著。

5實驗結果和分析

5.1 蒽對刺參體內GSH酶活性的影響

在一定濃度蒽的脅迫作用下，GSH酶活性含量是個動態(tài)變化的過程 ，蒽濃度和時間是影響GSH酶活性的重要因素。

在劑量一效應關系面，刺參體內GSH酶活性的含量隨著蒽濃度的增加而上升，但只有在2h和24h時有較為顯著的線性關系。高濃度時蒽對GSH酶活性的誘導效應高于低濃度時的誘導效應。但是在有蒽脅迫的情況下，除了12h以外在其他時候GSH的含量均沒有對照組高。在14d時解除暴露后再凈化一個星期后GSH酶活性含量又達到了最高值。

5.2蒽對鮑魚體內GSH酶活性的影響

GSH酶活性含量是個動態(tài)變化的過程，蒽濃度和時間是影響GSH酶活性的重要因素。

在時間一效應關系方面，海參體內GSH酶活性在4d內隨著時間的延長出現(xiàn)了先升后降再升的趨勢，并且在蒽濃度為20？g/L時這種趨勢最為明顯，而且呈現(xiàn)出很明顯的“鐘”型變化趨勢，并且在12h值達到峰值，這說明表明鮑魚體內GSH酶活性可在較短的時間內被誘導，而且是在蒽濃度為20？g/L誘導效果最為顯著，且誘導效應在初期高于后期。但低濃度組（1、5？g/L）在不同時刻之間的變化不太明顯。

6結論

6.1蒽對刺參體內GSH酶活性的影響

在蒽對刺參體內GSH酶活性的影響研究中我們發(fā)現(xiàn)，在12h時蒽對刺參體內GSH酶活性的誘導效應最強。而且隨著污染物蒽濃度的增加GSH酶活性也增強，在21d時GSH含量恢復到了對照組的值，這說明凈化實驗能夠使刺參體內GSH酶活性恢復到正常水平，這與穆景利，王新紅[10]等人關于苯并（a）芘影響黑鯛肝臟EROD活性變化的動力學研究結果正好相同；另一方面也說明，暴露實驗沒有嚴重的超出刺參自身的抗氧化系統(tǒng)能力。

6.2蒽對鮑魚體內GSH酶活性的影響

在蒽對鮑魚體內GSH酶活性影響的研究中我們發(fā)現(xiàn)，隨著污染物蒽濃度的遞增GSH酶活性依次升高，但在第4d時GSH酶活性已經(jīng)不隨污染物濃度的變化而變化了，這說明此時污染物濃度已經(jīng)不是影響GSH酶活性的關鍵因素了。此外我們還發(fā)現(xiàn)在污染物蒽濃度為20ug/L時，GSH酶活性出現(xiàn)了先升后降的趨勢，并且在12h時GSH酶活性達到了最大值，這說明GSH酶活性可以很好地指示有機污染物對海參的生物響應，而且污染物蒽的響應濃度為20g/L。endprint