毛木耳多糖對乙醇性肝損傷的保護作用

趙爽+榮成博+張淑曼+劉宇+陳杰

摘要：采用乙醇誘導(dǎo)正常人肝細(xì)胞L02形成乙醇性肝損傷的體外模型，通過檢測細(xì)胞內(nèi)甘油三酯（TG）、活性氧（ROS）含量、胞外谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性等指標(biāo)，評價毛木耳多糖提取物對乙醇性肝損傷的的保護作用及機理。結(jié)果表明，毛木耳多糖提取物的最佳作用濃度為40 μg/mL時，與模型組相比較，細(xì)胞的存活率提高了26.84百分點，細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的含量顯著下降，胞外轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST的活性降低。這一結(jié)果說明毛木耳多糖提取物能夠提高損傷細(xì)胞的存活率，降低乙醇引發(fā)的肝內(nèi)脂肪堆積，減少細(xì)胞凋亡，同時游離活性氧的檢測結(jié)果顯示毛木耳多糖提取物能夠顯著降低細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量，從而可推斷其可能是通過抗氧化途徑發(fā)揮防護作用。

關(guān)鍵詞：毛木耳；多糖；乙醇性肝損傷；活性氧；胞外轉(zhuǎn)氨酶

中圖分類號： R284.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）12-0142-03

乙醇進入體內(nèi)后主要是通過肝臟來完成代謝的，如果攝入的乙醇量過大，細(xì)胞色素P450 2E1（CYP2E1）會被誘導(dǎo)表達(dá)參與乙醇的代謝，產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）。ROS能夠與生物大分子反應(yīng)造成蛋白變性、酶失活、DNA結(jié)構(gòu)改變、脂質(zhì)過氧化，從而造成細(xì)胞的損傷[1]。大量攝入乙醇不僅引發(fā)肝損傷，還會促使乙醇性脂肪肝的形成，并向乙醇性肝炎、乙醇性肝纖維化、肝硬化轉(zhuǎn)變[2]。據(jù)2006年公布的我國首部《中國居民營養(yǎng)與健康之行為和生活方式調(diào)查報告》中顯示，我國居民現(xiàn)在飲酒率為21%，這一數(shù)字還在不斷上升[3]，乙醇已成為繼病毒性肝炎之后導(dǎo)致肝損害的第二大病因。

食用菌類多糖是一種非特異性免疫促進劑，能增強網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能，提高調(diào)整機體免疫功能[4]；研究表明大多數(shù)食用菌多糖對各種病毒如流感病毒、單純胞疹病毒等具有抑制作用[5]；研究發(fā)現(xiàn)多糖的多種生物活性均與抗氧化性有關(guān)，通過緩解疾病、輻射、代謝等引起的氧化應(yīng)激達(dá)到治療和預(yù)防腫瘤發(fā)生、免疫力低下等疾病[6]。多糖的抗氧化性可能是其多種活性的作用機理之一。毛木耳多糖具有抗氧化[7]、提高免疫[8]、降低血糖血脂[9]等功能，并且可以抑制化學(xué)致癌物及促癌物對腫瘤的誘發(fā)[10]，因此在保健食品方面具有廣闊的應(yīng)用前景。毛木耳多糖保護乙醇性肝臟損傷功能研究是一個全新的領(lǐng)域。本研究主要目的是在乙醇性肝損傷模型的基礎(chǔ)上，探索毛木耳多糖提取物保護肝細(xì)胞乙醇性損傷的作用，為毛木耳多糖的開發(fā)以及深加工食品的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

細(xì)胞株L02，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院；毛木耳3號菌株，筆者所在實驗室保藏菌株；胎牛血清（FBS）、RPMI 1640培養(yǎng)液、胰酶和雙抗（青霉素和鏈霉素），購自美國Invitrogen公司；MTT測試液，購自美國Sigma公司；二甲基亞砜（DMSO），購自美國Amresco公司；臺盼藍(lán)染液和無水乙醇，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；BCA蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒，購自北京博邁德生物技術(shù)有限公司；甘油三酯（TG）酶法測定試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）測試盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）測試盒和細(xì)胞活性氧（ROS）試劑盒，購自南京建成科技有限公司。

MSC-1.2生物安全柜，購自美國Thermo公司；Steti-cycle371 CO2培養(yǎng)箱，購自美國Thermo公司；R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購自瑞士Buchi公司；HYC-360藥品保存箱，購自中國海爾公司；SHZ-88A恒溫水浴鍋，購自北京精科華瑞儀器有限公司；5810R冷凍離心機，購自美國Eppendrof公司；IX-71倒置顯微鏡，購自日本Olympus公司；移液器，購自美國Drummond公司。

1.2試驗方法

1.2.1毛木耳多糖提取物的制備將毛木耳子實體放入高速萬能破碎機進行破碎制備成約100目的均一干粉。稱取50 g干粉，按1 ∶60比例加入去離子水，靜置3 h，利用水浴搖床控制溫度和轉(zhuǎn)速對混合溶液進行提取，條件控制為 90 ℃、水浴4 h，6 000 r/min離心30 min，取上清，將沉淀物以上述方法再提取1次，合并上清液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)技術(shù)濃縮，確定多糖溶液的體積，加入4倍體積的無水乙醇使多糖析出，靜置過夜待固液分離。通過6 000 r/min離心30 min，獲得固體多糖，放至60 ℃的烘箱中烘干直至質(zhì)量恒定，研磨成粉末狀待用。功能檢測時將多糖粉末配制成500 μg/mL的母液，其中多糖濃度以硫酸-苯酚法測定[11]。

1.2.2乙醇性損傷模型的建立L02細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液（含1%青霉素、鏈霉素混合液）置 37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度以 8×103 個/孔的細(xì)胞量接種于96孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)液，使培養(yǎng)液中乙醇濃度達(dá)到1.6%、1.8%、2.0%、2.2%、2.5%、3.0%，設(shè)置對照組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。以MTT方法測定細(xì)胞的存活率，以未加入乙醇的空白組作為對照，設(shè)定其細(xì)胞存活率為100%。

1.2.3毛木耳多糖提取物對乙醇性肝損傷的保護作用

1.2.3.1毛木耳多糖提取物對L02細(xì)胞的毒性評價取對數(shù)生長期的L02細(xì)胞，以8×103個/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入含多糖的培養(yǎng)液，使終濃度達(dá)到0、50、100、200、500、1 000 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，測定細(xì)胞存活率，分析多糖對L02細(xì)胞的毒性作用，設(shè)定對照組的細(xì)胞存活率為100%。

1.2.3.2毛木耳多糖提取物保肝作用細(xì)胞以濃度為 8×103 個/孔的接種量置于96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，設(shè)置對照組（不加乙醇）和損傷模型組（乙醇終濃度為3%），治療組的細(xì)胞中加入終濃度為3%的乙醇和不同濃度的多糖提取物（10、20、30、40、50 μg/mL），37 ℃培養(yǎng)48 h后，測定細(xì)胞存活率，設(shè)定對照組的細(xì)胞存活率為100%。endprint

1.2.3.3肝細(xì)胞特征性指標(biāo)檢測細(xì)胞以3×105個/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，選用多糖提取物終濃度為40 μg/mL和損傷模型37 ℃培養(yǎng)48 h后，分別收集培養(yǎng)液和細(xì)胞，利用胞外谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒測定培養(yǎng)液中的酶活力，利用組織甘油三酯測定試劑盒測定TG含量，用BCA法測定蛋白含量，細(xì)胞中加入熒光探針，利用組織內(nèi)活性氧（ROS）測定試劑盒測定ROS的含量。

1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，試驗結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）”表示，采用 One-way ANOVA檢驗，P<0.05表示具有顯著性差異。

2結(jié)果與分析

2.1肝細(xì)胞乙醇性損傷模型

本研究采用正常肝臟細(xì)胞株L02為載體細(xì)胞，以不同濃度的乙醇作為誘導(dǎo)條件建立損傷模型，評價毛木耳多糖對乙醇性肝損傷的改善作用。以前期建立模型的條件為基礎(chǔ)[12]，檢測乙醇刺激對L02細(xì)胞存活率的影響。從表1可知，在單純乙醇因素的刺激下，隨著乙醇濃度增加，細(xì)胞存活率明顯下降，從86.59%下降到50.77%，各處理組與對照組比較均達(dá)到顯著性差異（P<0.05）。這一檢測結(jié)果與之前的研究結(jié)果相近，具有良好的重復(fù)性，說明此誘導(dǎo)方法能夠建立起穩(wěn)定的乙醇性肝損傷模型。細(xì)胞存活率檢測結(jié)果顯示30%乙醇對細(xì)胞損傷較大，細(xì)胞存活率降低至 50.77%，滿足模型的需求，設(shè)定其為模型損傷濃度。

2.2毛木耳多糖提取物細(xì)胞毒性檢測

多糖以終濃度0～1 000 μg/mL直接處理細(xì)胞，通過MTT檢測發(fā)現(xiàn)所有細(xì)胞處理組的細(xì)胞存活率均在90%以上，且與對照組未達(dá)到顯著性差異（P≥0.05），說明毛木耳多糖對

2.3毛木耳多糖提取物的保肝功能

以3.0%乙醇濃度的損傷條件和毛木耳多糖共同處理細(xì)胞48 h后發(fā)現(xiàn)，不同濃度的多糖均對細(xì)胞具有保護作用，但是保護效果并未呈現(xiàn)出劑量的依賴性。圖2顯示的是各濃度多糖對肝細(xì)胞的保護作用，其中多糖終濃度為10、20、30、 40 μg/mL 的處理組與模型組比較都能夠顯著性提高細(xì)胞存活率。其中多糖終濃度為40 μg/mL時，細(xì)胞的存活率最高，為84.79%，與模型組比較提高了26.86百分點，設(shè)定其為最佳護肝劑量。

2.4多糖提取物對肝細(xì)胞特征指標(biāo)的影響

本試驗不僅研究了多糖對細(xì)胞存活率的影響，同時以TG、胞外AST和ALT的指標(biāo)反映多糖對肝細(xì)胞功能的保護作用。胞內(nèi)TG含量檢測結(jié)果顯示毛木耳多糖提取物具有降低肝細(xì)胞中TG的作用，與模型組比較能夠降低76.51%，說明其可以減少乙醇引起的胞內(nèi)脂肪堆積；胞外轉(zhuǎn)氨酶的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)多糖可以明顯減少ALT和AST的胞外釋放，保護肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性。ROS檢測結(jié)果顯示多糖提取物能夠降低胞內(nèi)活性氧的含量，說明毛木耳多糖具有抗氧化的作用，可以減小細(xì)胞因氧化而發(fā)生的損傷，推斷其是通過抗氧化途徑來發(fā)揮護肝功效的。

3結(jié)論與討論

乙醇在肝細(xì)胞內(nèi)主要是由乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶催化代謝的，攝入肝內(nèi)后在脫氫酶和乙醇氧化酶系統(tǒng)作用下被氧化成乙醛，再氧化成乙酸，最后進入三羧酸循環(huán)被徹底氧化成CO2和H2O，并釋放出能量[13]。此過程使輔酶不斷轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型輔酶，二者比例的改變抑制線粒體內(nèi)三羧酸循環(huán)，脂肪氧化減弱，肝內(nèi)脂肪酸合成增多[14]，最終導(dǎo)致肝臟中脂肪含量升高，因此TG是評價肝損傷的特征指標(biāo)。從表2可知，48 h后提取物處理組的TG含量較模型組明顯降低，說明毛木耳多糖能夠有效緩解細(xì)胞中的脂質(zhì)沉積作用。

ROS是以氧原子為中心的自由基及其活性衍生物[15-16]，細(xì)胞內(nèi)線粒體是ROS產(chǎn)生的最主要來源[17]。氧化應(yīng)激與乙醇性肝損傷關(guān)系密切，當(dāng)體內(nèi)產(chǎn)生的ROS過多，無法被抗氧化物質(zhì)完全清除時，會發(fā)生氧化應(yīng)激，過量的ROS會與生物大分子反應(yīng)，造成機體的損傷，甚至導(dǎo)致疾病。從表2可知，經(jīng)提取物處理48 h后，ROS指標(biāo)檢測結(jié)果表明毛木耳多糖提取物有效改善了肝細(xì)胞內(nèi)的氧化水平。

ALT、AST是反映肝細(xì)胞損害情況最常用的酶學(xué)檢查指標(biāo)。AST是一種線粒體酶，乙醇在代謝過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物乙醛、自由基等，可導(dǎo)致氧應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，造成線粒體損傷，使大量存在于線粒體的AST進入周圍的循環(huán)系統(tǒng)[1]，因此乙醇性肝損傷細(xì)胞的培養(yǎng)液中AST升高。ALT主要分布于胞漿，在肝細(xì)胞質(zhì)中有傳輸氨基酸的作用，研究表明僅有1%的肝細(xì)胞壞死，就可以使ALT增高1倍，因此，ALT被世界衛(wèi)生組織推薦為肝功能損害最敏感的檢測指標(biāo)[18]。從表2可知，經(jīng)提取物處理48 h后，ALT和AST的釋放量降低，說明毛木耳多糖提取物能夠保護細(xì)胞的完整性，具有保肝的作用。

本研究通過細(xì)胞毒性檢測表明毛木耳多糖提取物對肝細(xì)胞不具有細(xì)胞毒性，其能夠提高肝損傷細(xì)胞的存活率，具有保護乙醇性損傷的作用。在多糖作用濃度為40 μg/mL時，細(xì)胞存活率與模型組比較可提高26.86百分點，細(xì)胞內(nèi)甘油三酯和ROS的含量分別降低了76.51%和50.15%，培養(yǎng)液中ALT、ASL含量分別降低了35.76%、57.61%。研究結(jié)果證明毛木耳多糖不僅對肝細(xì)胞具有保護作用，而且可以促進肝細(xì)胞行使功能，具有開發(fā)應(yīng)用前景。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.12.038endprint