轉(zhuǎn)基因作物中常見Bt基因PCR檢測方法的建立

邵改革+閆偉+夏蔚+李蔥蔥+龍麗坤+李飛武

摘要：建立基于常見外源基因的轉(zhuǎn)基因成分檢測方法是開展轉(zhuǎn)基因生物監(jiān)測與檢測活動的技術(shù)支撐，Bt基因作為目前商業(yè)化應(yīng)用最廣泛的一類外源基因，已成為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品篩選檢測的重要靶標(biāo)。依據(jù)轉(zhuǎn)基因作物中常見的6種Bt基因（cry1F、cry1C、cry1Ie、cry34Ab、cry35Ab、vip3A）的核苷酸序列設(shè)計特異性PCR引物，并經(jīng)過特異性、靈敏度等一系列測試，建立上述6種Bt基因的定性PCR檢測方法。結(jié)果顯示，應(yīng)用這些方法均可從含有相應(yīng)Bt基因的樣品中正確檢測出預(yù)期轉(zhuǎn)基因成分，方法的靈敏度可達0.10%。上述方法具有特異性強、靈敏度高等特點，適用于轉(zhuǎn)基因作物中常見Bt基因的篩選檢測。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因作物；Bt基因；定性PCR方法

中圖分類號： Q785文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）12-0031-04

與全球轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化蓬勃發(fā)展相對應(yīng)的是人們對于轉(zhuǎn)基因技術(shù)產(chǎn)品的安全性越來越重視。加強轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品監(jiān)管，已成為世界各國管理轉(zhuǎn)基因技術(shù)的一貫做法，開發(fā)行之有效的檢測技術(shù)則成了轉(zhuǎn)基因監(jiān)管技術(shù)支撐機構(gòu)的一項重要工作[1]。PCR技術(shù)兼具特異性強、靈敏度高、結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點，在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測方法研究中被廣泛應(yīng)用，根據(jù)檢測靶標(biāo)功能的不同，又分為篩選PCR檢測、基因特異性PCR檢測、構(gòu)建特異性PCR檢測、轉(zhuǎn)化體特異性PCR檢測4類，其中基因特異性PCR檢測方法以轉(zhuǎn)基因作物中的外源目的基因為檢測靶標(biāo)，是一類常見的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品成分檢測方法[2]。

在已商業(yè)化應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因作物中，抗蟲性是僅次于抗除草劑的第二大性狀，2015年抗蟲轉(zhuǎn)基因作物種植面積達到 8 370萬hm2（包括單一抗蟲性狀和含有抗蟲的復(fù)合性狀），占全球轉(zhuǎn)基因作物總面積的46.6%[3]。此外，從我國轉(zhuǎn)基因作物研發(fā)進展來看，抗蟲性是第一大目標(biāo)性狀，除了大規(guī)模商業(yè)化應(yīng)用的抗蟲棉花外，也有多種抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米、水稻、大豆新品系進入安全評價階段[4-6]。其中，Bt基因是國內(nèi)外應(yīng)用最主要的抗蟲外源基因，包括cry1A、cry2Ab、cry1F、cry1C、cry1Ie、cry34Ab、cry35Ab、vip3A等。以Bt基因作為檢測靶標(biāo)的轉(zhuǎn)基因檢測方法已有諸多報道，Dinon等開發(fā)了轉(zhuǎn)基因玉米MON89034中cry1A.105、cry2Ab2基因的實時熒光PCR方法[7]；李飛武等報道了轉(zhuǎn)基因作物中cry1Ab、cry2Ab、cry3A等常見Bt基因的單一和多重PCR檢測方法[8]；吳孝槐等建立了轉(zhuǎn)基因大米中Bt基因的實時熒光PCR方法[9]；Liang等建立了MIR162玉米及COT102棉花中vip3A基因的實時熒光PCR方法[10]；有些Bt基因的PCR檢測方法已成為國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[11-12]，但未見cry1F、cry1C、cry1Ie等Bt基因檢測方法的報道。

本研究以抗蟲轉(zhuǎn)基因作物中常見的cry1F、cry1C、cry1Ie、cry34Ab、cry35Ab、vip3A等6種Bt基因為對象，建立每種基因的定性PCR檢測方法，為轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管提供有效的技術(shù)手段。

1材料與方法

1.1材料與試劑

轉(zhuǎn)Bt基因玉米TC1507、IE034、59122、MIR162、MON89034、MON810、Bt11、Bt176、Bt38、SK12-5、MON863、MON88017、MIR604，轉(zhuǎn)Bt基因大豆MON87701，轉(zhuǎn)Bt基因棉花MON531、MON15985，轉(zhuǎn)Bt基因水稻T1c-19、G6H1、KF6、KMD、T2a-1、TT51-1，及非轉(zhuǎn)基因玉米、水稻、大豆、棉花均為筆者所在實驗室保存樣品。將TC1507、IE034、59122、MIR162、T1c-19等量混合后作為陽性對照樣品，將非轉(zhuǎn)基因玉米、水稻、大豆、棉花等量混合后作為陰性對照樣品。

植物基因組DNA提取試劑盒：北京天根生物技術(shù)有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs等PCR反應(yīng)試劑：大連寶生物工程有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

C1000型PCR儀（美國Bio-Rad公司）；GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；ND1000紫外/可見光分光光度計（美國Thermo Fisher公司）。

1.3試驗方法

1.3.1基因組DNA提取按照植物基因組DNA提取試劑盒的操作說明，提取所有樣品的基因組DNA，并使用ND1000分光光度計測定DNA濃度和純度，用1×TE緩沖液稀釋至25 μg/mL，置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2Bt基因核苷酸序列分析及引物設(shè)計根據(jù)cry1F、cry1C、cry1Ie、cry34Ab、cry35Ab、vip3A等6種不同Bt基因的核苷酸序列，使用Primer Premier 5.0（加拿大Premier公司）設(shè)計每種基因的特異性PCR檢測引物。引物信息詳見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和純化，用純水配制成10 μmol/L溶液備用。

1.3.3PCR擴增在200 μL PCR管中加入2.5 μL 10×PCR buffer[10 mmol/L Tris-HCl（pH值為8.3）、50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2]，2 μL dNTPs混合溶液（每種dNTP的濃度為2.5 mmol/L），1 μL上游引物（10 μmol/L），1 μL下游引物（10 μmol/L），0.2 μL HS-Taq DNA聚合酶（5 U/μL），100 ng DNA模板，用ddH2O補齊至25 μL反應(yīng)體系。PCR擴增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。PCR擴增結(jié)束后，取5 μL擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。endprint

2結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)Bt基因作物及其外源基因檢測引物篩選

商業(yè)化轉(zhuǎn)基因作物數(shù)據(jù)庫（ISAAA GM Approval Database）、美國農(nóng)業(yè)部動植物衛(wèi)生檢驗局網(wǎng)站（USDA APHIS）及國內(nèi)外專利庫等渠道發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，Bt基因是當(dāng)前全球抗蟲轉(zhuǎn)基因作物中應(yīng)用最為廣泛的一類外源基因，包含cry1F、cry1C、cry1Ie等在內(nèi)的10余種基因。本研究收集了我國已批準(zhǔn)的國外抗蟲轉(zhuǎn)基因作物及國內(nèi)自主研發(fā)的重要抗蟲轉(zhuǎn)基因作物轉(zhuǎn)化體共22種，包括轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、棉花、水稻，各個轉(zhuǎn)化體的Bt基因種類詳見表2。針對cry1F、cry1C、cry1Ie、cry34Ab、cry35Ab、vip3A等6種Bt基因的序列，分別設(shè)計了一系列PCR檢測引物，進行適用性測試，最終確定了每種Bt基因的PCR檢測引物（表1）。表2轉(zhuǎn)Bt基因作物信息

2.26種Bt基因的PCR檢測方法特異性測試

以22種轉(zhuǎn)Bt基因作物和1種非轉(zhuǎn)基因作物混合物（含有非轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、水稻、棉花）作為試驗材料，分別對6種Bt基因的PCR檢測方法進行特異性測試，結(jié)果如圖1所示。應(yīng)用cry1F基因檢測方法僅能從陽性對照及TC1507玉米樣品中獲得與預(yù)期大小一致的擴增產(chǎn)物（泳道27～28），同樣應(yīng)用其他5種基因檢測方法也僅能從含有相應(yīng)基因的樣品中獲得預(yù)期擴增產(chǎn)物，而在其他轉(zhuǎn)基因試驗材料、非轉(zhuǎn)基因作物陰性樣品、空白對照中均未出現(xiàn)擴增產(chǎn)物，說明這6種Bt基因檢測方法均表現(xiàn)出對靶標(biāo)基因的嚴格特異性。

2.36種Bt基因的PCR檢測方法靈敏度測試

分別將TC1507玉米、T1c-19水稻、IE034玉米、59122玉米、MIR162玉米與非轉(zhuǎn)基因作物樣品按質(zhì)量比進行混合，制備成相應(yīng)轉(zhuǎn)化體的質(zhì)量分數(shù)分別為10.00%、5.00%、100%、0.50%、0.10%、0.05%、0.01%的梯度樣品，提取DNA進行對應(yīng)Bt基因檢測方法的靈敏度測試，結(jié)果如圖2所示。應(yīng)用cry1F、cry1C、cry1Ie、cry34Ab基因的PCR檢測方法均可從轉(zhuǎn)基因含量為0.05%的樣品中擴增出與預(yù)期大小一致的特異性產(chǎn)物，而應(yīng)用cry35Ab、vip3A基因的PCR檢測方法可從0.10%轉(zhuǎn)基因樣品中獲得預(yù)期擴增，表明針對6種Bt基因檢測方法的檢出限均可達到0.10%，能夠進行相應(yīng)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的高靈敏檢測。

3結(jié)論與討論

轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品種類的不斷增多給轉(zhuǎn)基因檢測工作帶來了一定的挑戰(zhàn)，選擇代表性高、覆蓋面廣的檢測靶標(biāo)，并建立精準(zhǔn)高通量的檢測方法，成為轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)研究的重要方向[13]。Bt基因作為一類應(yīng)用廣泛的外源基因，非常適合作為篩選檢測的靶標(biāo)，cry1Ab、cry2Ab、cry3A等基因的檢測方法也已經(jīng)被開發(fā)出來[14-16]，而針對cry1F、cry1C、cry1Ie等Bt基因的檢測方法尚未見報道。

本研究針對抗蟲轉(zhuǎn)基因作物中cry1F、cry1C、cry1Ie、

cry34Ab、cry35Ab、vip3A等6種常見Bt基因，通過引物設(shè)計與篩選、特異性測試、靈敏度測試等步驟， 建立了能準(zhǔn)確檢測上述Bt基因的PCR檢測方法，上述方法的檢測靈敏度均可達到0.10%，為轉(zhuǎn)基因作物的篩選檢測提供了方法支持。此外，將這些方法與預(yù)制PCR、多重PCR等技術(shù)結(jié)合，還可建立更加快速、便捷、高效的轉(zhuǎn)基因檢測方法，更好地應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品成分檢測工作。

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