芪楂口服液藥渣發(fā)酵前后對斷奶仔豬結腸微生物、代謝產(chǎn)物及細胞因子表達的影響

蘇家宜 耿梅梅 陳 聞 印遇龍 王占彬 孔祥峰,3*

(1.中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術研究中心，長沙410125；2.河南科技大學動物科技學院，洛陽471003；3.湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，長沙410128)

芪楂口服液藥渣發(fā)酵前后對斷奶仔豬結腸微生物、代謝產(chǎn)物及細胞因子表達的影響

蘇家宜1,2耿梅梅1陳 聞1印遇龍1王占彬2孔祥峰1,3*

(1.中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術研究中心，長沙410125；2.河南科技大學動物科技學院，洛陽471003；3.湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，長沙410128)

為了探討中藥渣用于斷奶仔豬養(yǎng)殖的可行性，比較研究了芪楂口服液藥渣發(fā)酵前后對斷奶仔豬結腸微生態(tài)和健康的影響。試驗選用21日齡斷奶仔豬120頭，隨機分為空白對照組、芪楂口服液藥渣組(添加5 kg/t芪楂口服液藥渣)、發(fā)酵芪楂口服液藥渣組(添加5 kg/t發(fā)酵芪楂口服液藥渣)和陽性對照組(添加0.04 kg/t維吉尼亞霉素+0.2 kg/t硫酸黏桿菌素+3 000 mg/kg氧化鋅)，每組5個重復，每個重復6頭。于試驗第28天，分別取結腸內(nèi)容物及其組織，測定微生物數(shù)量、代謝產(chǎn)物含量以及細胞因子mRNA表達量。結果表明：芪楂口服液藥渣組和發(fā)酵芪楂口服液藥渣組的7種細菌及總細菌數(shù)量與空白對照組相比均無顯著差異(P>0.05)，白細胞介素(IL)-12 mRNA表達量顯著低于2個對照組(P<0.05)，吲哚含量顯著低于陽性對照組(P<0.05)；發(fā)酵芪楂口服液藥渣組乙酸、丁酸、戊酸、異丁酸、直鏈脂肪酸和總短鏈脂肪酸含量以及結腸組織IL-4 mRNA表達量顯著低于芪楂口服液藥渣組(P<0.05)；陽性對照組粒細胞巨噬細胞集落刺激因子mRNA表達量顯著高于、梭菌ⅩⅣa和雙歧桿菌數(shù)量顯著低于空白對照組(P<0.05)。綜上所述，芪楂口服液藥渣可增加斷奶仔豬結腸短鏈脂肪酸含量，調節(jié)結腸細胞因子表達；芪楂口服液藥渣發(fā)酵前后均不影響腸道菌群穩(wěn)態(tài)，但抗生素和氧化鋅會影響仔豬腸道菌群的穩(wěn)態(tài)；微生物發(fā)酵未增強芪渣口服液藥渣對腸道微生物代謝的改善作用。

芪楂口服液藥渣；發(fā)酵；斷奶仔豬；結腸微生態(tài)；細胞因子

斷奶應激常引起仔豬胃腸道結構和功能的紊亂，進而引起腹瀉、生長性能降低等問題。目前，在養(yǎng)豬生產(chǎn)中常通過在飼糧中添加多種抗生素和高劑量氧化鋅來預防仔豬腹瀉。這雖然具有一定的效果，卻引發(fā)了機體免疫抑制、腸道菌群失衡、細菌耐藥性和藥物殘留等一系列問題[1]。因此，減少飼糧中抗生素和氧化鋅的用量已成為養(yǎng)豬業(yè)亟待解決的問題。中草藥作為功能性飼料添加劑，具有資源豐富、綠色無污染、生物學功能突出等優(yōu)點。由于受提取手段和提取效率的制約，中藥加工企業(yè)產(chǎn)生的中藥渣中仍殘留有多種生物活性成分和營養(yǎng)物質[2]。但由于植物性中藥渣中胞內(nèi)活性物質不易被動物直接吸收和利用，且含有大量的纖維素，從而導致其在飼糧中添加量大、適口性差，在浪費中藥資源的同時也破壞了飼糧的營養(yǎng)配比[3]。而利用現(xiàn)代發(fā)酵工藝對中藥渣進行發(fā)酵處理，不僅能夠破壞植物細胞壁、降解植物藥材中的纖維素，微生物酶還可定向轉化某些化合物而產(chǎn)生新的功能性化合物[4]。黎智華等[2]報道，滋腎補腦液和柴胡等中藥的藥渣在發(fā)酵后粗蛋白質和氨基酸含量均有所升高。李華偉等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在圍產(chǎn)期母豬飼糧中添加由黃芪、當歸、益母草和金銀花等組成的發(fā)酵中藥渣可提高母豬產(chǎn)活仔數(shù)和仔豬斷奶窩增重；添加由黃芪、當歸、熟地黃和白芍等組成的中藥渣發(fā)酵產(chǎn)物可顯著提高仔豬的斷奶窩增重[6]。筆者前期研究也發(fā)現(xiàn)，飼糧添加5 kg/t發(fā)酵芪楂口服液藥渣(Qi-Zhaoral solution residues，QOR)可使斷奶仔豬平均日采食量提高4.8%、平均日增重提高8.3%，且能降低料重比；另外，其改善腸道形態(tài)結構的效果優(yōu)于芪楂口服液藥渣[7]。結腸中棲息著的大量微生物可代謝多種營養(yǎng)物質，生成氨、短鏈脂肪酸、生物胺、酚類和吲哚類化合物等代謝產(chǎn)物，影響宿主代謝和機體健康[8]。但目前關于發(fā)酵中藥渣影響仔豬結腸微生物及其代謝的研究并不多見。因此，本試驗通過測定芪楂口服液藥渣發(fā)酵前后對結腸微生物、代謝產(chǎn)物以及細胞因子表達的影響，評價其對結腸微生態(tài)和健康的調控作用，為其在斷奶仔豬飼養(yǎng)中的應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1發(fā)酵芪楂口服液藥渣制備

芪楂口服液藥渣由湖南圣雅凱生物科技有限公司提供，活性成分主要為黃芪甲苷、大黃酚和大黃酸等。取黃芪、山楂、蒼術、麥芽、大黃和大青葉等中藥經(jīng)水提后的藥渣，其總含水量控制在40%～60%。首先對藥渣進行滅菌，接種枯草芽孢桿菌和酵母菌，通入氧氣于28～32 ℃條件下發(fā)酵22～26 h；然后接種乳酸菌和丁酸梭菌，31～34 ℃厭氧條件下發(fā)酵24 h。枯草芽孢桿菌∶酵母菌∶乳酸菌∶丁酸梭菌=5∶2∶2∶1，活菌數(shù)≥2×1010CFU/g，每天翻動1～2次。發(fā)酵后，減壓真空干燥，粉碎后備用。測得芪楂口服液藥渣發(fā)酵前和發(fā)酵后的干物質、粗蛋白質、粗纖維、粗脂肪和粗灰分的含量以及總能分別為95.04%和95.84%、7.72%和8.55%、2.46%和1.09%、5.70%和3.85%、25.38%和25.82%及13.09和13.64 MJ/kg[7]。

1.2試驗動物、分組與飼養(yǎng)管理

動物試驗在中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所新五豐永安試驗基地進行，時間為2015年7月16日至8月12日。選用21日齡斷奶的杜×長×大雜交仔豬120頭，平均體重6 kg左右，公、母各占1/2，根據(jù)窩來源和體重隨機分為4組，每組5個重復，每個重復6頭仔豬?？瞻讓φ战M仔豬飼喂基礎飼糧，中藥渣組、發(fā)酵中藥渣組和陽性對照組仔豬分別飼喂在基礎飼糧中直接添加5 kg/t芪楂口服液藥渣、5 kg/t發(fā)酵芪楂口服液藥渣和0.04 kg/t維吉尼亞霉素+0.2 kg/t硫酸黏桿菌素+3 000 mg/kg氧化鋅的飼糧。芪楂口服液藥渣發(fā)酵前后的添加劑量根據(jù)預試驗的生長性能和腹瀉率結果確定；維吉尼亞霉素、硫酸黏桿菌素和氧化鋅的添加劑量根據(jù)商業(yè)化飼料生產(chǎn)要求確定?；A飼糧為商品化仔豬保育料(不添加抗生素和氧化鋅)，營養(yǎng)水平稍低于NRC(2012)標準，其組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗期為28 d。試驗豬飼養(yǎng)在高床保育欄內(nèi)，每次飼糧添加量以吃飽后槽內(nèi)略有余料為度，自由飲水。飼養(yǎng)管理和免疫程序按商業(yè)化養(yǎng)豬場規(guī)范進行操作。

1.3樣品采集與處理

在試驗第28天08:00，即仔豬空腹14 h后，稱取所有仔豬的體重，每欄取1頭中等大小的仔豬進行屠宰。取結腸組織及其內(nèi)容物，液氮速凍后-80 ℃保存。

1.4腸道微生物數(shù)量的測定

取結腸內(nèi)容物，按照試劑盒QIAamp DNA Stool Mini Kit(QIAgen,德國)的方法提取微生物DNA，用于微生物定量PCR分析。微生物定量PCR測定參考焦金真等[9]的方法。微生物絕對定量PCR的特異性引物見表2，由上海生工基因技術有限公司合成。

1.5微生物代謝產(chǎn)物含量的測定

采用氣相色譜法[10]測定其中直鏈脂肪酸(包括乙酸、丙酸、丁酸和戊酸)、支鏈脂肪酸(包括異丁酸和異戊酸)以及總短鏈脂肪酸(直鏈脂肪酸+支鏈脂肪酸)的含量，高效液相色譜法[11]測定吲哚的含量。

1.6腸道細胞因子mRNA表達量的測定

取-80 ℃保存的結腸組織，利用RNA Isolation Solvent試劑提取總RNA，PrimeScript RT試劑盒反轉錄。以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參，利用實時熒光定量PCR測定腸道促炎細胞因子[白細胞介素(IL)-4、IL-10和IL-18]和抗炎細胞因子[粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-6和IL-12]mRNA表達量。引物序列見表2，由上海生工基因技術有限公司合成。反應體系為10.0 μL：5.0 μL Luminaris Color Higreen high ROX qPCR Master Mix (2×)，0.4 μL上游引物，0.4 μL下游引物，2.2 μL Nuclease-free H2O，2.0 μL cDNA模板。反應程序為：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環(huán)。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(飼喂基礎)

1)預混料為每千克飼糧提供The premix provided the following per kg of the diet：VA 6 200 IU，VD3700 IU，VE 88 IU，VK 4.4 mg，VB28.8 mg，泛酸 pantothenate 24.2 mg，煙酸 nicotinic acid 33 mg，氯化膽堿 chloride choline 330 mg，Cu 10 mg，Zn 100 mg，F(xiàn)e 145 mg，Mn 40 mg，Se 0.1 mg，I 0.3 mg。

2)營養(yǎng)水平均為計算值。Nutrient levels were all calculated values.

表2 細菌的特異性引物序列

表3 細胞因子引物序列

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)利用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Duncan氏法對各組平均值進行多重比較。結果以“平均值±標準誤”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1芪楂口服液藥渣發(fā)酵前后對斷奶仔豬結腸微生物數(shù)量的影響

由表4可知，陽性對照組的雙歧桿菌和梭菌ⅩⅣa數(shù)量顯著低于空白對照組(P<0.05)；芪楂口服液藥渣組和發(fā)酵芪楂口服液藥渣組的擬桿菌、雙歧桿菌、梭菌Ⅳ、梭菌ⅩⅣa、大腸桿菌、厚壁菌、乳酸桿菌和總細菌數(shù)量均無顯著差異(P>0.05)。

2.2芪楂口服液藥渣發(fā)酵前后對斷奶仔豬結腸微生物代謝產(chǎn)物含量的影響

由表5可知，芪楂口服液藥渣組和發(fā)酵芪楂口服液藥渣組吲哚含量顯著低于陽性對照組(P<0.05)。發(fā)酵芪楂口服液藥渣組結腸內(nèi)容物中乙酸和丁酸含量顯著低于芪楂口服液藥渣組(P<0.05)，與2個對照組無顯著差異(P>0.05)；芪楂口服液藥渣組結腸內(nèi)容物中戊酸、異丁酸、直鏈脂肪酸和總短鏈脂肪酸含量均顯著高于發(fā)酵芪楂口服液藥渣組和陽性對照組(P<0.05)。

表4 芪楂口服液藥渣發(fā)酵前后對斷奶仔豬結腸微生物數(shù)量的影響

同行數(shù)據(jù)肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Data in the same row with different letter superscripts differ significantly (P<0.05). The same as below.

表5 芪楂口服液藥渣發(fā)酵前后對斷奶仔豬結腸微生物代謝產(chǎn)物含量的影響

2.3芪楂口服液藥渣發(fā)酵前后對斷奶仔豬結腸組織細胞因子mRNA表達量的影響

由表6可知，芪楂口服液藥渣組和陽性對照組仔豬結腸組織IL-4 mRNA表達量顯著高于空白對照組和發(fā)酵芪楂口服液藥渣組(P<0.05)；結腸組織IL-10和IL-18 mRNA表達量4個組間均無顯著差異(P>0.05)?？瞻讓φ战MGM-CSFmRNA表達量顯著低于陽性對照組(P<0.05)；芪楂口服液藥渣組和發(fā)酵芪楂口服液藥渣組IL-12 mRNA表達量顯著低于2個對照組(P<0.05)。

表6 芪楂口服液藥渣發(fā)酵前后對斷奶仔豬結腸組織細胞因子mRNA表達量的影響

3 討 論

動物胃腸道中棲息著的超過100萬億個細菌，并分屬于上千種不同的微生物。它們可廣泛參與宿主對營養(yǎng)素的代謝，增強機體免疫力，防止機體感染有害菌，抑制腸道產(chǎn)生腐敗物質等[12]。如果腸道內(nèi)微生物菌群失衡就會導致腸道健康異常，進而引起腹瀉和炎癥等。厚壁菌門和擬桿菌門是豬腸道內(nèi)的主要優(yōu)勢菌群[13]，其中雙歧桿菌、乳酸桿菌、梭菌Ⅳ和梭菌ⅩⅣa屬于厚壁菌門中對腸道健康有益的菌群。而大腸桿菌是導致仔豬腹瀉的有害菌。本試驗中，飼糧添加抗生素和氧化鋅，可降低結腸中總細菌、大腸桿菌和其他有益菌的數(shù)量，且顯著降低梭菌ⅩⅣa和雙歧桿菌的數(shù)量，提示抗生素和氧化鋅不但能殺滅腸道中的有害菌，同時也殺滅有益菌，破壞腸道菌群的穩(wěn)態(tài)。這和馬麗瓊等[14]報道的廣譜抗生素會破壞SD大鼠腸道微生態(tài)平衡，造成腸道菌群紊亂結果一致。另外，芪楂口服液藥渣組和發(fā)酵芪楂口服液藥渣組結腸細菌數(shù)量無顯著差異，提示腸道菌群穩(wěn)態(tài)不受影響。芪楂口服液藥渣在發(fā)酵過程中添加了一定量的乳酸桿菌，而發(fā)酵芪楂口服液藥渣組的乳酸桿菌數(shù)量卻低于空白對照組和芪楂口服液藥渣組，這可能與中藥渣的發(fā)酵工藝和試驗樣本數(shù)較少有關，具體原因還需要進一步探討。

來源于飼糧蛋白質或腸道脫落上皮細胞中的色氨酸，在豬回腸后段經(jīng)微生物厭氧發(fā)酵產(chǎn)生吲哚乙酸和吲哚等揮發(fā)性物質[15-16]。據(jù)報道，糞便中含有的吲哚基團化合物是豬糞便中主要的臭味物質[17]。本試驗中，陽性對照組的吲哚含量顯著高于芪楂口服液藥渣組和發(fā)酵芪楂口服液藥渣組，這與Han等[18]報道的抗生素可以誘導吲哚的生物合成，從而提高大腸桿菌的耐藥性結果一致。另外，飼糧添加芪楂口服液藥渣和發(fā)酵后芪楂口服液藥渣后，氨氮和吲哚的含量降低，這可以減少豬糞便中揮發(fā)性物質對環(huán)境的污染。糞便中的短鏈和支鏈脂肪酸由腸道菌群代謝腸道內(nèi)的未消化纖維、抗性淀粉和含氮物質產(chǎn)生[19]。發(fā)酵芪楂口服液藥渣組仔豬結腸中的乙酸、丁酸、戊酸、異丁酸和總短鏈脂肪酸含量均顯著低于芪楂口服液藥渣組，這可能與發(fā)酵后芪楂口服液藥渣中粗纖維含量降低，從而使進入結腸的未消化纖維素的量降低有關[20]。另外，微生物發(fā)酵產(chǎn)生的總短鏈脂肪酸含量和組成取決于底物的有效性、內(nèi)容物在腸道中的通過時間和微生物區(qū)系的組成[12]。因此，測得的總短鏈脂肪酸含量和腸道內(nèi)微生物數(shù)量不呈正相關[21]。

促炎細胞因子(GM-CSF、IL-6和IL-12)和抗炎細胞因子(IL-4、IL-10和IL-18)是重要的免疫調節(jié)因子。其中，IL是介導白細胞間和其他細胞間相互作用的細胞因子，GM-CSF可刺激骨髓各系前體細胞生長和分化[22]。因此，多種免疫細胞因子表達的平衡對維持機體正常免疫功能具有重要作用[23]。在本試驗中，與空白對照組相比，飼糧添加芪楂口服液藥渣可顯著上調IL-4 mRNA表達，顯著下調IL-12 mRNA表達，提示芪楂口服液藥渣可增強斷奶仔豬的免疫功能，這可能與腸道微生物代謝產(chǎn)物總短鏈脂肪酸含量的升高有關。總短鏈脂肪酸在宿主細胞和微生物互作過程中發(fā)揮著重要的生理功能，例如為宿主尤其是宿主結腸上皮細胞提供能量、抑制病原微生物、減少免疫細胞因子和趨化因子的釋放而產(chǎn)生抗炎作用等[24]。另外，與空白對照組相比，飼糧添加抗生素和氧化鋅后結腸組織中的促炎細胞因子GM-CSF的mRNA表達量顯著上調，這與抗生素和氧化鋅在殺滅病原菌的同時引起病原菌細胞組分大量釋放進而引發(fā)機體的炎癥反應有關[25]。

4 結 論

① 飼糧添加芪楂口服液藥渣可增加斷奶仔豬結腸短鏈脂肪酸含量，調節(jié)細胞因子表達。

② 飼糧添加發(fā)酵前后芪楂口服液藥渣均不影響腸道菌群穩(wěn)態(tài)，但添加抗生素和氧化鋅會影響仔豬腸道菌群的穩(wěn)態(tài)。

③ 本試驗采用的微生物發(fā)酵處理未增強芪渣口服液藥渣對腸道微生物代謝的改善作用。

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*Corresponding author, professor, E-mail: nnkxf@isa.ac.cn

(責任編輯 田艷明)

Effects of Qi-Zha Oral Solution Residues and Their Fermented Product on Microbes, Microbial Metabolites and Cytokine Expression in Colon of Weaned Piglets

SU Jiayi1,2GENG Meimei1CHEN Wen1YIN Yulong1WANG Zhanbin2KONG Xiangfeng1,3*

(1. Key Laboratory of Agro-Ecological Processes in Subtropical Region, Hunan Provincial Engineering Research Center of Healthy Livestock, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China; 2. College of Animal Science and Technology, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China; 3.Hunan Co-Innovation Center of Utilizing Plant Functional Components, Changsha 410128, China)

The present study was conducted to determine the effects ofQi-Zhaoral solution residues (QOR) and their fermented product on colon micro-ecology and health of weaned piglets, to explore the feasibility of dietary supplementation with herbal residues in piglet production. A total of 120 piglets weaned at 21 days of age were randomly assigned to one of four groups with 5 replicates per group and 6 piglets per replicate, representing blank control group, QOR group (supplementing 5 kg/t QOR), fermented QOR group (supplementing 5 kg/t fermented QOR), and positive control group (supplementing 0.04 kg/t virginiamycin, 0.2 kg/t colistin and 3 000 mg/kg zinc oxide). At day 28 of the experiment, the colonic tissue and its content were collected respectively, for determining the amount of microbes, contents of microbial metabolites and mRNA expression levels of cytokines. The results showed that dietary QOR or fermented QOR did not significantly affect the amounts of seven tested bacteria and total bacteria compared with the blank control group (P>0.05), while significantly decreased the expression level of interleukin (IL)-12 mRNA compared with the two control groups (P<0.05), and significantly decreased indole content compared with the positive control group (P<0.05). Dietary fermented QOR significantly decreased the contents of acetate, butyrate, valerate, isobutyrate, straight chain fatty acids and total short chain fatty acids (P<0.05), as well as the expression level of IL-4 mRNA, when compared with the QOR group (P<0.05). The expression level of granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor mRNA was significantly increased (P<0.05), while the amounts ofBacteroidetesandClostridiumclusterⅩⅣa were significantly decreased (P<0.05) in the positive control group when compared with the blank control group. Collectively, these findings suggest that the QOR can increase the contents of short chain fatty acids in colonic content and regulate the colon cytokine expression of weaned piglets; antibiotics and zinc oxide, not QOR or fermented QOR, affect the balance of intestinal microflora; the microbe fermentation doesn’t enhance the improvement of QOR on intestinal microbe metabolism.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2017,29(9)：3240-3247]

Qi-Zhaoral solution residues; fermented; weaned piglets; colon micro-ecology; cytokine

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.09.027

2017-02-24

湖南省戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)科技攻關項目(2014GK1007)；中央駐湘科研機構技術創(chuàng)新發(fā)展專項(2013TF3006)；中國工程院咨詢研究項目(2015-XY-41)

蘇家宜(1992—)，女，河南新鄉(xiāng)人，碩士研究生，從事豬營養(yǎng)生理研究。E-mail: sjy19920406@126.com

*通信作者：孔祥峰，研究員，博士生導師，E-mail: nnkxf@isa.ac.cn

S816.7

：A

：1006-267X(2017)09-3240-08