低銅飼糧添加枯草芽孢桿菌對(duì)5～16周齡五龍鵝腸道發(fā)育、微生物菌群結(jié)構(gòu)及血清酶活性的影響

張名愛(ài) 楊文嬌 張澤楠 王寶維 史雪萍 岳 斌 葛文華 鄭惠文

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)優(yōu)質(zhì)水禽研究所，國(guó)家水禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系營(yíng)養(yǎng)與飼料功能研究室，青島266109)

低銅飼糧添加枯草芽孢桿菌對(duì)5～16周齡五龍鵝腸道發(fā)育、微生物菌群結(jié)構(gòu)及血清酶活性的影響

張名愛(ài) 楊文嬌 張澤楠 王寶維*史雪萍 岳 斌 葛文華 鄭惠文

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)優(yōu)質(zhì)水禽研究所，國(guó)家水禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系營(yíng)養(yǎng)與飼料功能研究室，青島266109)

本試驗(yàn)旨在研究低銅飼糧添加枯草芽孢桿菌對(duì)5～16周齡五龍鵝腸道發(fā)育、微生物菌群結(jié)構(gòu)及血清酶活性的影響。試驗(yàn)選用29日齡五龍鵝360只，隨機(jī)分為6組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只(公母各占1/2)。Ⅰ組為最適銅添加組(銅添加水平為16 mg/kg，未添加枯草芽孢桿菌)；Ⅱ～Ⅵ組為枯草芽孢桿菌添加組，銅添加水平分別為0、4、8、12、16 mg/kg，枯草芽孢桿菌添加水平均為250 mg/kg。試驗(yàn)期12周。結(jié)果表明：1)Ⅱ～Ⅵ組的空腸絨毛高度和絨腺比極顯著高于Ⅰ組(P<0.01)，空腸隱窩深度顯著或極顯著低于Ⅰ組(P<0.05或P<0.01)；Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ組的空腸腸壁厚度顯著高于Ⅰ組(P<0.05)。Ⅱ～Ⅵ組之間的空腸絨毛高度、腸壁厚度和絨腺比無(wú)顯著差異(P>0.05)；Ⅱ組的空腸隱窩深度顯著低于Ⅴ和Ⅵ組(P<0.05)。2)Ⅱ～Ⅵ組的盲腸大腸桿菌數(shù)量極顯著低于Ⅰ組(P<0.01)，盲腸雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量顯著或極顯著高于Ⅰ組(P<0.05或P<0.01)。Ⅱ～Ⅵ組之間的盲腸大腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量差異不顯著(P>0.05)。3)Ⅳ組的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性顯著低于Ⅰ組(P<0.05)，Ⅴ組血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和乳酸脫氫酶(LDH)活性顯著低于Ⅰ組(P<0.05)；Ⅱ組血清ALT、AST、LDH活性與Ⅰ組差異不顯著(P>0.05)。Ⅳ組血清堿性磷酸酶(AKP)活性顯著高于Ⅰ組(P<0.05)；Ⅱ組血清AKP活性顯著低于Ⅰ組(P<0.05)。由此可見(jiàn)，低銅飼糧添加枯草芽孢桿菌能夠促進(jìn)五龍鵝腸道發(fā)育，優(yōu)化微生物菌群結(jié)構(gòu)；銅對(duì)鵝腸道發(fā)育及微生物菌群結(jié)構(gòu)影響較小。適宜的枯草芽孢桿菌和銅添加水平能夠維護(hù)機(jī)體健康，相互間具有協(xié)同作用。

銅；枯草芽孢桿菌；鵝；腸道發(fā)育；微生物菌群結(jié)構(gòu)；酶活性

銅是動(dòng)物必需的微量元素之一，不僅以酶輔助因子的形式參與體內(nèi)30多種酶的組成和活化，還可以通過(guò)酶的活性中心或激活劑的形式來(lái)影響動(dòng)物的造血、消化、生長(zhǎng)、繁殖、免疫等生理功能。銅還能增強(qiáng)動(dòng)物垂體釋放生長(zhǎng)激素(GH)、促甲狀腺釋放激素(TPH)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)，影響腎上腺皮質(zhì)類固醇和兒茶酚胺的合成[1-2]。研究表明，生長(zhǎng)豬飼糧中添加250 mg/kg銅可改善仔豬生長(zhǎng)速度和飼料利用率[3]。目前，高銅促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)的研究成果得到了許多營(yíng)養(yǎng)配方師的效仿；然而，飼糧中添加高銅使畜禽生長(zhǎng)性能得到提高的同時(shí)，也會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響，導(dǎo)致畜禽排泄物中銅含量明顯升高，其作為農(nóng)用有機(jī)肥長(zhǎng)期使用，加劇了對(duì)環(huán)境的污染[4]。此外，高添加水平的銅可能會(huì)導(dǎo)致畜禽肉、蛋等產(chǎn)品中銅的沉積量上升，作為食物應(yīng)用影響到人體的健康，尤其是對(duì)未成年人的危險(xiǎn)性更大[5]。在規(guī)?；笄蒺B(yǎng)殖狀態(tài)下，如何在保持較高生長(zhǎng)性能的前提下，降低飼料中銅添加水平，減小養(yǎng)殖業(yè)對(duì)環(huán)境的壓力，生產(chǎn)出健康安全的畜禽產(chǎn)品，一致是人們追尋的目標(biāo)。為此，尋求一種能夠降低飼糧中銅添加水平的方法對(duì)保障生態(tài)環(huán)境與人類健康具有重要意義?？莶菅挎邨U菌作為微生態(tài)制劑的一種，可以有效地改善腸道菌群的組成，促進(jìn)機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。López等[6]研究指出，芽孢桿菌屬菌株均有強(qiáng)大的吸附金屬能力，這是因?yàn)榻饘匐x子能夠與芽孢桿菌細(xì)胞表面上的陰離子相互作用而被固定。趙穎等[7]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌對(duì)銅離子具有很強(qiáng)的吸附作用。余成瑤等[8]的研究顯示，雛雞飼喂枯草芽孢桿菌后通過(guò)掃描電鏡觀察腸黏膜結(jié)構(gòu)，可看到小腸黏膜皺壁明顯增多，腸絨毛長(zhǎng)度增長(zhǎng)，柱狀細(xì)胞的微絨毛明顯加粗，小腸吸收面積增大。Lee等[9]的研究也表明，用枯草芽孢桿菌飼喂肉雞能夠促進(jìn)腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，提高小腸絨毛高度，改善腸道黏膜形態(tài)，提高對(duì)養(yǎng)分的吸收能力。翟玲等[10]研究表明，飼糧中添加枯草芽孢桿菌可以顯著改善肝代謝功能。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和乳酸脫氫酶(LDH)廣泛存在于動(dòng)物體肝細(xì)胞漿及線粒體中，反映肝臟合成蛋白質(zhì)及無(wú)氧糖酵解的能力，同時(shí)也是反映機(jī)體健康的重要指標(biāo)，正常情況下其在動(dòng)物血清中活性比較低，當(dāng)出現(xiàn)肝損傷時(shí)或發(fā)生肝細(xì)胞破裂時(shí)才進(jìn)入血液中，使血液中上述酶活性大幅度升高[11]。迄今為止，枯草芽孢桿菌與銅對(duì)畜禽生物學(xué)功能的研究有許多報(bào)道，而飼糧中添加枯草芽孢桿菌降低畜禽微量元素添加水平的研究報(bào)道還鮮有報(bào)道，枯草芽孢桿菌與銅協(xié)同對(duì)鵝腸道發(fā)育、微生物菌群結(jié)構(gòu)及血清酶活性影響的研究還處于空白。為此，本試驗(yàn)以5～16周齡五龍鵝為試驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)在低銅飼糧中添加枯草芽孢桿菌，研究其對(duì)腸道發(fā)育、微生物菌群結(jié)構(gòu)及血清酶活性的影響，旨在進(jìn)一步探索枯草芽孢桿菌與銅在腸道中的協(xié)調(diào)關(guān)系，為低排放生態(tài)飼糧配方技術(shù)研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇29日齡同批孵化、體重相近、體況健康的五龍鵝360只，采用隨機(jī)分配編號(hào)法分為6組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只(公母各占1/2)。Ⅰ組為最適銅添加組(銅添加水平為16 mg/kg[1]，未添加枯草芽孢桿菌)；Ⅱ～Ⅵ組為枯草芽孢桿菌添加組，銅添加水平分別為0、4、8、12、16 mg/kg，枯草芽孢桿菌添加水平均為250 mg/kg。試驗(yàn)期12周。試驗(yàn)鵝由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)優(yōu)質(zhì)水禽研究所育種基地提供；試驗(yàn)用枯草芽孢桿菌形態(tài)為粉末狀，活菌數(shù)為2×109CFU/g，購(gòu)自山東蘇柯漢生物工程股份有限公司；試驗(yàn)用銅源為五水硫酸銅(有效成分含量為98.5%)，購(gòu)自浙江新維普添加劑有限公司。

1.2基礎(chǔ)飼糧

基礎(chǔ)飼糧營(yíng)養(yǎng)水平參照NRC(1994)家禽營(yíng)養(yǎng)需要量設(shè)計(jì)，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。采用等離子體發(fā)射光譜儀測(cè)得基礎(chǔ)飼糧中銅含量為7.32 mg/kg。

1.3試驗(yàn)儀器

主要試驗(yàn)儀器包括托盤、手術(shù)刀、手術(shù)剪、廣口瓶、UV-1100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、TGL-16B高度離心機(jī)、RM2235手動(dòng)轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)、石蠟、干燥箱、OLYMPUS光學(xué)顯微鏡等。

1.4飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)前對(duì)鵝舍進(jìn)行全面消毒；全期采取舍飼，地面厚墊料分欄飼養(yǎng)；試驗(yàn)鵝自由飲水和采食，少添喂勤，注意觀察鵝群的生長(zhǎng)狀況。

1.5測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 腸道發(fā)育指標(biāo)測(cè)定

16周齡末，空腹稱重，各組每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選擇體重相近的2只鵝，共72只，屠宰后無(wú)菌截取其空腸中段，用生理鹽水洗凈后保存于10%甲醛溶液中固定，置于4 ℃冰箱中保存用于制作組織切片。

將已經(jīng)固定好的組織進(jìn)行修整、水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋(石蠟包埋法)、切法，最后用蘇木精-伊紅(HE)染色后制成切片。每個(gè)腸段切片取6張，采用HMIAS-2000彩色圖像分析系統(tǒng)和OLYMPUS光學(xué)顯微鏡，在100×明視野顯微鏡下測(cè)量腸絨毛高度、腸線深度、肌層厚度，并計(jì)算絨毛高度、腸壁厚度、隱窩深度、絨腺比(絨毛高度/隱窩深度)。

1.5.2 腸道微生物菌群檢測(cè)

16周齡末，將鵝放血、屠宰后，迅速打開(kāi)腹腔，立即結(jié)扎腸道各部分的分界，取盲腸于滅菌的離心管中，-40 ℃冷凍保存。無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，室溫解凍后擠出盲腸內(nèi)容物1.0 mL于滅菌三角瓶，加入滅菌稀釋液49.0 mL，配制成1∶50稀釋液，振蕩3～5 min，用微量移液槍準(zhǔn)確吸取該稀釋液5 mL至事先滅菌的稀釋液試管中，用漩渦振蕩器振蕩1～2 min，制成10-1稀釋液，用微量移液槍準(zhǔn)確吸取該稀釋液1 mL至盛有9 mL事先滅菌的稀釋液試管中，用旋渦振蕩器振蕩1～2 min，制成10-2稀釋液，依次進(jìn)行梯度稀釋。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)多維和微量元素為每千克飼糧提供 The multivitamin and trace elements provided the following per kg of the diet：VA 1 500 mg，VD3200 IU，VE 12.5 mg，VK31.5 mg，VB12.2 mg，VB25.0 mg，煙酸 nicotinic acid 65 mg，泛酸 pantothenate 15 mg，VB62 mg，生物素 biotin 0.2 mg，葉酸 folic acid 0.5 mg，膽堿 choline 1 000 mg，F(xiàn)e 85 mg，Mn 80 mg，Zn 80 mg，I 0.42 mg，Se 0.3 mg，Co 2.5 mg。

2)銅為實(shí)測(cè)值，其他營(yíng)養(yǎng)水平為計(jì)算值。Cu was a measured value, while other nutrient levels were calculated values.

分別將盲腸內(nèi)容物的稀釋液接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基平皿上：亞硫酸鉍瓊脂(BS)培養(yǎng)基(用于雙歧桿菌培養(yǎng))、乳酸細(xì)菌(MRS)培養(yǎng)基(用于乳酸桿菌培養(yǎng))、營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基(用于大腸桿菌培養(yǎng))，每種指標(biāo)檢測(cè)5個(gè)稀釋梯度，每個(gè)梯度設(shè)2個(gè)重復(fù)，大腸桿菌37 ℃有氧培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，乳酸桿菌和雙歧桿菌35 ℃厭氧培養(yǎng)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，枯草芽孢桿菌37 ℃厭氧培養(yǎng)45 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.5.3 血清酶活性指標(biāo)測(cè)定

血清中ALT、AST、LDH和堿性磷酸酶(AKP)活性測(cè)定采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 17.0軟件中單因素方差分析(one-way ANOVA)程序中的LSD法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P<0.05和P<0.01分別為差異顯著和極顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1低銅飼糧添加枯草芽孢桿菌對(duì)五龍鵝空腸絨毛形態(tài)的影響

由表2可以看出，Ⅱ～Ⅵ組(枯草芽孢桿菌添加組)空腸絨毛高度極顯著高于Ⅰ組(P<0.01)，空腸隱窩深度顯著低于Ⅰ組(P<0.05)，空腸絨腺比極顯著高于Ⅰ組(P<0.01)；Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ組空腸腸壁厚度顯著高于Ⅰ組(P<0.05)。Ⅱ～Ⅵ組(枯草芽孢桿菌添加組)之間空腸絨毛高度、腸壁厚度和絨腺比無(wú)顯著差異(P>0.05)；Ⅱ組空腸隱窩深度顯著低于Ⅴ和Ⅵ組(P<0.05)。Ⅱ組(不添加銅，僅添加枯草芽孢桿菌)空腸絨毛高度和絨腺比極顯著高于Ⅰ組(P<0.01)，空腸隱窩深度極顯著低于Ⅰ組(P<0.01)。Ⅵ與Ⅰ組(銅添加水平一致)之間比較，Ⅵ組空腸絨毛高度、腸壁厚度和絨腺比顯著或極顯著高于Ⅰ組(P<0.05或P<0.01)。

以上結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌對(duì)五龍鵝腸道發(fā)育具有明顯促進(jìn)作用，而銅對(duì)鵝腸道發(fā)育影響較小。

表2 低銅飼糧添加枯草芽孢桿菌對(duì)五龍鵝空腸絨毛形態(tài)的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同小寫字母或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)，相鄰小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相間小寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

In the same column, values with the same small or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with adjacent small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with alternate small letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as below.

由圖1可以看出，Ⅰ組空腸絨毛生長(zhǎng)不整齊且較短，隱窩較深；Ⅱ～Ⅵ組(枯草芽孢桿菌添加組)腸絨毛較長(zhǎng)且長(zhǎng)勢(shì)均勻整齊，隱窩較淺。各組腸壁厚度差異不明顯。

以上結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌能夠影響五龍鵝空腸發(fā)育，從而增強(qiáng)消化吸收功能。Ⅵ組與Ⅰ組(銅添加水平一致)之間比較，Ⅵ組空腸絨毛高度和腸壁厚度明顯高于Ⅰ組。

圖1 16周齡五龍鵝空腸絨毛組織切片

2.2低銅飼糧添加枯草芽孢桿菌對(duì)五龍鵝盲腸微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響

由表3可以看出，Ⅱ～Ⅵ組(枯草芽孢桿菌添加組)盲腸大腸桿菌數(shù)量均極顯著低于Ⅰ組(P<0.01)，盲腸雙歧桿菌數(shù)量顯著高于Ⅰ組(P<0.05)，盲腸乳酸桿菌數(shù)量極顯著高于Ⅰ組(P<0.01)。Ⅱ～Ⅵ組(枯草芽孢桿菌添加組)盲腸大腸桿菌數(shù)量隨銅添加水平增加呈先升高后降低趨勢(shì)，盲腸雙歧桿菌數(shù)量隨銅添加水平的增加呈升高趨勢(shì)。Ⅱ組(不添加銅，僅添加枯草芽孢桿菌)盲腸大腸桿菌數(shù)量極顯著低于Ⅰ組(P<0.01)，盲腸雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量顯著或極顯著高于Ⅰ組(P<0.05或P<0.01)。Ⅵ與Ⅰ組(銅添加水平一致)之間比較，Ⅵ組盲腸大腸桿菌數(shù)量極顯著低于Ⅰ組(P<0.01)，盲腸雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量顯著或極顯著高于Ⅰ組(P<0.05或P<0.01)。

以上結(jié)果表明，飼糧中添加枯草芽孢桿菌能夠優(yōu)化鵝盲腸內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)，抑制有害菌的增殖，促進(jìn)益生菌的生長(zhǎng)繁殖；而銅對(duì)盲腸菌群結(jié)構(gòu)影響相對(duì)較小。

表3 低銅飼糧添加枯草芽孢桿菌對(duì)五龍鵝盲腸微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.3低銅飼糧添加枯草芽孢桿菌對(duì)五龍鵝血清酶活性影響

由表4可以看出，Ⅳ組血清ALT活性顯著低于Ⅰ組(P<0.05)，Ⅴ組血清AST和LDH活性顯著低于Ⅰ組(P<0.05)。Ⅱ～Ⅵ組(枯草芽孢桿菌添加組)血清AST和ALT活性均隨著飼糧中銅水平的提高呈先降低后升高趨勢(shì)；Ⅱ組(不添加銅，僅添加枯草芽孢桿菌)與Ⅰ組比較，血清ALT、AST、LDH活性增加，但差異不顯著(P>0.05)。Ⅵ與Ⅰ組(銅添加水平一致)之間比較，血清ALT、AST、LDH活性均降低，但差異不顯著(P>0.05)。

以上結(jié)果表明，血清ALT、AST、LDH活性遵循適度原則，銅添加水平過(guò)多過(guò)低都會(huì)使其酶活性失衡，不利于肝臟與腎臟的健康，導(dǎo)致肝臟、腎臟損傷的出現(xiàn)，致使ALT、AST、LDH大量進(jìn)入血液。飼糧中添加枯草芽孢桿菌有助于緩解高銅或低銅對(duì)鵝機(jī)體造成的應(yīng)激。

Ⅳ組血清AKP活性顯著高于Ⅰ組(P<0.05)；Ⅱ～Ⅵ組(枯草芽孢桿菌添加組)血清AKP活性隨著飼糧中銅添加水平的提高呈先升高后降低的趨勢(shì)，Ⅳ組達(dá)到最大值。與Ⅰ組比較，Ⅱ組(不添加銅，僅添加枯草芽孢桿菌)血清AKP活性降低，但差異不顯著(P>0.05)。Ⅵ組與Ⅰ組(銅添加水平一致)之間比較，血清AKP活性增加，但差異不顯著(P>0.05)。

以上結(jié)果表明，飼糧中添加枯草芽孢桿菌和銅均有增強(qiáng)鵝機(jī)體營(yíng)養(yǎng)代謝的作用。

綜上結(jié)果分析表明，鵝機(jī)體血清ALT、AST、LDH、AKP活性均遵循適度平衡原則，銅添加水平過(guò)多或過(guò)低都會(huì)使其酶活性指標(biāo)失衡，在添加250 mg/kg枯草芽孢桿菌和8 mg/kg銅的條件下，機(jī)體處于最佳健康平衡狀態(tài)。

3 討 論

3.1低銅飼糧添加枯草芽孢桿菌對(duì)五龍鵝腸道絨毛形態(tài)的影響

絨毛高度和隱窩深度分別是反映小腸消化吸收功能和細(xì)胞發(fā)育成熟率的主要指標(biāo)，當(dāng)絨毛高度增加時(shí)，與腸道中食糜的接觸面積也會(huì)相應(yīng)的增加，進(jìn)而增強(qiáng)小腸的消化吸收功能；機(jī)體消化道發(fā)育成熟時(shí)，隱窩上皮細(xì)胞作用就會(huì)減弱，隱窩深度變淺[12-13]。絨毛高度/隱窩深度值升高，表明小腸消化吸收功能增強(qiáng)，腸黏膜結(jié)構(gòu)改善。有研究表明，飼糧添加500 mg/kg枯草芽抱桿菌能顯著提高42日齡肉仔雞十二指腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度值，降低隱窩深度[14]。

表4 低銅飼糧添加枯草芽孢桿菌對(duì)五龍鵝血清酶活性的影響

動(dòng)物腸道發(fā)育在其機(jī)體生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，腸道結(jié)構(gòu)的完整性是其功能正常發(fā)揮的前提。動(dòng)物機(jī)體主要依靠腸管上的環(huán)形皺襞、腸絨毛及絨毛上的柱形上皮細(xì)胞來(lái)吸收和消化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[15]。李衛(wèi)芬等[16]研究表明，在肉雞飼糧中添加枯草芽孢桿菌有益于保護(hù)和增加腸絨毛高度，顯著提高絨毛高度/隱窩深度值，進(jìn)而提高腸道對(duì)養(yǎng)分的吸收利用效率。王洪陽(yáng)[17]研究表明，飼糧中添加銅對(duì)于獺兔腸道的發(fā)育無(wú)顯著影響。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加枯草芽孢桿菌可以極顯著提高空腸絨毛高度，顯著降低隱窩深度，極顯著提高絨腺比，對(duì)腸壁厚度也有一定的影響；而銅對(duì)空腸絨毛形態(tài)發(fā)育無(wú)顯著影響，這與上述研究結(jié)果基本相符，表明飼糧中添加枯草芽孢桿菌能夠促進(jìn)鵝腸道發(fā)育，優(yōu)化鵝盲腸菌群結(jié)構(gòu)，而銅對(duì)鵝腸道發(fā)育的影響相對(duì)較小，其機(jī)理還有待于繼續(xù)研究。

3.2低銅飼糧添加枯草芽孢桿菌對(duì)五龍鵝盲腸微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響

動(dòng)物消化系統(tǒng)對(duì)養(yǎng)分的消化吸收，部分依賴于腸道中寄生的微生物菌群，鵝能夠通過(guò)盲腸微生物發(fā)酵利用飼糧中的部分粗纖維。且腸道內(nèi)固有的微生物區(qū)系對(duì)動(dòng)物的抗病能力也有很大影響[18-19]。易中華等[20]研究表明，飼糧中添加枯草芽孢桿菌有助于增加肉雞盲腸內(nèi)乳酸菌等有益菌的數(shù)量，降低大腸桿菌等有害菌的數(shù)量。蘭青[21]在研究枯草芽孢桿菌對(duì)仔豬腸道菌群的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌可改善仔豬腸道內(nèi)菌群的比例，提高乳酸桿菌的數(shù)量，并抑制大腸桿菌在腸道內(nèi)的迅速繁殖。己有研究表明，肉仔雞飼糧中添加枯草芽抱桿菌能提高肉仔雞平均日增重，降低料重比，促進(jìn)肉仔雞生長(zhǎng)發(fā)育；枯草芽抱桿菌能減少肉仔雞腸道內(nèi)大腸桿菌的數(shù)量，提高雙歧桿菌的數(shù)量，保持腸道微生物區(qū)系平衡，維持機(jī)體健康[22]。

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，飼糧中添加枯草芽孢桿菌可以顯著提高五龍鵝盲腸內(nèi)乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量，顯著降低大腸桿菌的數(shù)量，說(shuō)明飼糧中添加枯草芽孢桿菌能夠影響鵝盲腸內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)，顯著抑制有害菌的增殖，促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng)繁殖；銅對(duì)盲腸微生物菌群結(jié)構(gòu)影響相對(duì)較小，與枯草芽孢桿菌有協(xié)同效應(yīng)。

3.3低銅飼糧添加枯草芽孢桿菌對(duì)五龍鵝血清酶活性的影響

ALT、AST是動(dòng)物體內(nèi)重要的氨基酸轉(zhuǎn)氨酶，廣泛存在于動(dòng)物機(jī)體所有細(xì)胞內(nèi)，其中尤以肝細(xì)胞中最多。LDH是一種糖酵解酶，腎臟內(nèi)含量最高。在機(jī)體生長(zhǎng)代謝中都發(fā)揮著極其重要的作用，同時(shí)也是檢測(cè)動(dòng)物機(jī)體肝臟、腎臟功能的重要指標(biāo)。當(dāng)動(dòng)物出現(xiàn)肝臟損傷或腎臟病變時(shí)發(fā)生肝、腎細(xì)胞破裂，ALT、AST、LDH隨之進(jìn)入血液，使血液內(nèi)其活性大幅度升高[11]。曹華斌等[23]研究報(bào)道，飼糧中高水平銅會(huì)增加肉雞肝臟銅沉積，肝功能受到抑制，并導(dǎo)致肝臟出現(xiàn)不同程度的病理學(xué)損傷。梁明振等[24]報(bào)道，飼糧中添加高銅會(huì)損害肝臟、心臟、腎臟中細(xì)胞線粒體嵴的正常結(jié)構(gòu)。高銅在帶來(lái)促進(jìn)生長(zhǎng)性能的同時(shí)，弊端也逐漸被人們重視。

枯草芽孢桿菌產(chǎn)生多種消化酶，包括淀粉酶、植酸酶、纖維素酶及蛋白酶等[25]。一方面，外源酶的添加能夠補(bǔ)充畜禽發(fā)育早期機(jī)體內(nèi)源酶的不足，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收[26]；另一方面，在飼糧中加入外源酶可促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體內(nèi)源酶的分泌[27]。

AKP是一種非特異性磷酸單酯酶，可以催化幾乎所有的磷酸單酯的水解反應(yīng)，生成無(wú)機(jī)磷酸和相應(yīng)的醇，能夠加快機(jī)體的代謝。黃志堅(jiān)等[28]研究表明，仔豬血清AKP的變化趨勢(shì)是其活性隨銅的增加而適當(dāng)降低。徐晨晨等[1]研究報(bào)道，飼糧中添加15～30 mg/kg的銅可以提高鵝血清中AKP的活性。李衛(wèi)芬等[29]研究報(bào)道，飼糧中添加枯草芽孢桿菌可以改善肝功能，顯著提高血清中AKP的活性。

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，血清ALT、AST、LDH、AKP活性遵循適度平衡原則，銅過(guò)多過(guò)少都會(huì)使其酶活性失衡。在飼糧中添加250 mg/kg枯草芽孢桿菌和8 mg/kg銅的情況下，血清ALT、AST、LDH、AKP活性處于最佳生理健康狀態(tài)，有利于維持機(jī)體健康，具有增強(qiáng)鵝機(jī)體營(yíng)養(yǎng)代謝的作用。

4 結(jié) 論

① 枯草芽孢桿菌能夠促進(jìn)鵝腸道發(fā)育和有益菌增殖，抑制有害菌增殖；銅對(duì)鵝腸道發(fā)育及盲腸微生物菌群結(jié)構(gòu)影響較小。

② 枯草芽孢桿菌與銅均能夠降低血清ALT、AST、LDH活性，提高血清AKP活性。

③ 枯草芽孢桿菌與銅對(duì)鵝腸道發(fā)育、微生物菌群結(jié)構(gòu)及血清ALT、AST、LDH、AKP活性的影響具有協(xié)同促進(jìn)作用。

④ 鵝血清酶活性存有適度平衡機(jī)制，飼糧添加250 mg/kg枯草芽孢桿菌和8 mg/kg銅時(shí)，機(jī)體處于理想健康狀態(tài)。

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*Corresponding author, professor, E-mail: wangbw@qau.edu.cn

(責(zé)任編輯 武海龍)

Effects of Diet with Low Copper Level and Adding Bacillus subtilis on Intestinal Development, Microbial Community Structure and Serum Enzyme Activity of Wulong Geese Aged from 5 to 16 Weeks

ZHANG Ming’ai YANG Wenjiao ZHANG Ze’nan WANG Baowei*SHI Xueping YUE Bin GE Wenhua ZHENG Huiwen

(Nutrition and Feed Laboratory of China Agriculture Research System Qingdao, Institute of High Quality Waterfowl, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China)

This experiment aimed to investigate the effects of diet with low copper level and addingBacillussubtilison intestinal development, microbial community structure and serum enzyme activity ofWulonggeese aged from 5 to 16 weeks. A total of 360 twenty-nine-day-oldWulonggeese were randomly divided into six groups with 6 replicates in each group and 10 geese in each replicate (half male and half female). Group Ⅰ was the most suitable copper adding group (the copper added level was 16 mg/kg and withoutBacillussubtilis), and groups Ⅱ to Ⅵ wereBacillussubtilisadding groups, theBacillussubtilisadded level was all 250 mg/kg, and the copper added levels were 0, 4, 8, 12 and 16 mg/kg, respectively. The trial period was 12 weeks. The results showed as follows :1) the villus height and ratio of villus height to crypt depth (V/C) in jejunum of groups Ⅱ to Ⅵ were significantly higher than those of group Ⅰ (P<0.01), and the crypt depth in jejunum was significantly lower than that of group Ⅰ (P<0.05 orP<0.01); the intestinal wall thickness in jejunum of group Ⅲ, Ⅴ and Ⅵ was significantly higher than that of group Ⅰ (P<0.05). There were no significant differences on villus height, intestinal wall thickness and V/C in jejunum among groups Ⅱ to Ⅵ (P>0.05); the crypt depth in jejunum of group Ⅱ was significantly lower than that of groups Ⅴ and Ⅵ (P<0.05). 2) The number ofEscherichiacoliin cecum of groups Ⅱ to Ⅵ was significantly lower than that of group Ⅰ (P<0.01), and the number ofBifidobacteriumandLactobacillusin cecum was significantly higher than that of group Ⅰ (P<0.05 orP<0.01). There were no significant differences on the number ofEscherichiacoli,BifidobacteriumandLactobacillusin cecum among groups Ⅱ to Ⅵ (P>0.05). 3) The serum alanine aminotransferase (ALT) activity of group Ⅳ was significantly lower than that of group Ⅰ (P<0.05), the activities of aspartate aminotransferase (AST) and lactate dehydrogenase (LDH) in serum of group Ⅴ were significantly lower than those of group Ⅰ (P<0.05); the activities of ALT, AST and LDH in serum of group Ⅱ had no significant difference compared with those in group Ⅰ (P>0.05). The serum alkaline phosphatase (AKP) activity of group Ⅳ was significantly higher than that of group Ⅰ (P<0.05), the serum AKP activity of group Ⅱ was significantly lower than that of group Ⅰ (P<0.05). In conclusion, diet with low copper level and addingBacillussubtiliscan promote the intestinal development, and optimize the microbial community structure ofWulonggeese; copper had less influence on intestinal development and microbial community structure of geese. The suitable adding level ofBacillussubtilisand copper can maintain the health of the body, and mutual has synergistic effect.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2017,29(9)：3175-3183]

copper；Bacillussubtilis；geese； intestinal development; microbial community structure; enzyme activity

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.09.020

2017-03-01

國(guó)家水禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)基金(CARS-43-11)；山東省良種工程項(xiàng)目(12-1-3--17-nsh)

張名愛(ài)(1979—)，女，山東龍口人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)榧仪轄I(yíng)養(yǎng)與保健。E-mail: 13705320869@126.com

*通信作者：王寶維，教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail: wangbw@qau.edu.cn

S835

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：1006-267X(2017)09-3175-09