美國(guó)紅楓十月輝煌組培快繁體系的建立研究

常蘋　胡春宏　王婷婷

摘要 以美國(guó)紅楓十月輝煌帶腋芽莖段為外植體，以不同植物激素類型及濃度配比對(duì)其腋芽啟動(dòng)、叢芽增殖和生根等階段進(jìn)行試驗(yàn)研究。結(jié)果表明，腋芽在誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+TDZ 0.008 mg/L+BA 0.1 mg/L上的誘導(dǎo)率達(dá)80%以上。叢芽增殖的最優(yōu)培養(yǎng)基為MS+TDZ 0.005 mg/L+BA 0.05 mg/L+GA3 1.5 mg/L+瓊脂粉6.5 g/L+蔗糖30 g/L，增殖倍率達(dá)3.58。生根培養(yǎng)基1/2MS+IBA 0.8 mg/L+NAA 0.5 mg/L+瓊脂粉6.5 g/L+蔗糖20 g/L，獲得90%以上的生根率，根數(shù)2～5條。

關(guān)鍵詞 美國(guó)紅楓；十月輝煌；腋芽啟動(dòng)；增殖；生根

中圖分類號(hào) S687 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2017）15-0128-03

Abstract The stem segments with axillary buds of Acer rubrum ′ctober Glory′ were taken as explants to culture by different hormone types and concentration ratios，doing a series of experiments about buds induction and proliferation，rooting and so on.The best induction medium was MS+TDZ 0.008 mg/L+BA 0.1 mg/L+agar 6.5 mg/L+sugar 30 g/L，the induction rate was above 80%，the optimum multiplication medium was MS+TDZ 0.005 mg/L+BA 0.05 mg/L+GA3 1.5 mg/L+agar 6.5 mg/L+sugar 30 g/L，the proliferation multiple was 3.58.The best rooting medium was 1/2MS+IBA 0.8 mg/L+NAA 0.5 mg/L+agar 6.5 mg/L+sugar 20 g/L，rooting rate reached 90%，root number was 2～5.

Key words Acer rubrum；Acer rubrum ′October Glory′；axillary buds induction；proliferation；rooting

十月輝煌（Acer rubrum ′October Glory′），屬槭樹科槭屬的落葉喬木，原產(chǎn)于美國(guó)東海岸，是一種美國(guó)紅楓系列改良的園藝品種[1-2]，長(zhǎng)勢(shì)較快，對(duì)土壤和氣候的適應(yīng)性寬泛，抗性較好，樹型挺直向上，葉型美觀，春夏季節(jié)擁有靚麗的綠色，秋季紅艷動(dòng)人且持續(xù)時(shí)間久，成為近年來比較流行的彩色樹種，廣泛適用于園林行道樹和景觀造景中。而較高的觀賞利用價(jià)值導(dǎo)致目前苗木市場(chǎng)需求量日益趨增，常規(guī)繁殖已達(dá)不到產(chǎn)量和質(zhì)量的需求[3-4]，而通過十月輝煌組織培養(yǎng)體系的快速建立，克服了有性繁殖性狀的不穩(wěn)定、其他常規(guī)繁殖周期長(zhǎng)的不足，有效地?cái)U(kuò)充了美國(guó)紅楓的產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；l(fā)展道路，為今后美國(guó)紅楓組織培養(yǎng)技術(shù)研究提供了更好的參考與保證[5]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及前期準(zhǔn)備

1.1.1 外植體的選擇。2016年5月，等大田四年生大樹開始抽出新枝，選擇在晴天上午剪取3～4節(jié)帶腋芽莖段的枝條，即從頂芽開始往下取帶腋芽的節(jié)點(diǎn)。

1.1.2 培養(yǎng)基的配制。以MS為基本培養(yǎng)基，加入蔗糖30 g/L（生根培養(yǎng)蔗糖20 g/L）、6.5 g/L瓊脂、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等配制成固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基溶液均以1 mol/L KOH和HCl溶液將其pH值調(diào)至5.80，各激素、活性炭（AC）及操作工具、器皿均需高溫高壓滅菌20 min。

1.1.3 培養(yǎng)條件。每個(gè)階段的培養(yǎng)溫度為25～27 ℃，培養(yǎng)周期為4～5周，光照培養(yǎng)16 h，黑暗培養(yǎng)8 h，光照條件為2 000～2 500 lx。

1.1.4 外植體的消毒。將外植體的葉子和頂芽去掉，按比例（次氯酸鈉∶水）1∶4配制消毒溶液備用，所有操作均在無菌超凈臺(tái)上進(jìn)行。用75%酒精棉擦拭外植體，分切成單節(jié)帶芽莖段，用無菌水沖洗2遍，置于消毒溶液中不斷搖晃20～30 min，無菌水沖洗3遍，平放于無菌板（長(zhǎng)20 cm，寬10 cm）上，用刀片將莖段上下原有的舊傷口切去，腋芽上部保留0.5～1.0 cm，腋芽下部保留1.0～1.5 cm，輕微傾斜地插入萌芽培養(yǎng)基中，保持腋芽與培養(yǎng)基表面的距離在0.5 cm左右。

1.2 培養(yǎng)過程

1.2.1 腋芽的啟動(dòng)培養(yǎng)。選小號(hào)玻璃方瓶，每水平做60瓶，每瓶接種1個(gè)外植體，至萌芽培養(yǎng)基中，先暗培養(yǎng)3 d，隨后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)2～4周，4周后統(tǒng)計(jì)萌芽率。萌芽率（%）=莖段萌芽數(shù)/（接種莖段數(shù)-莖段污染數(shù)）×100。

1.2.2 叢芽的增殖培養(yǎng)。待無菌苗長(zhǎng)至2 cm左右，將外植體從莖中部分切開，轉(zhuǎn)接入增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，選大號(hào)玻璃圓瓶，每水平做6瓶，每瓶接種16個(gè)外植體，4周后統(tǒng)計(jì)增殖率。增殖倍數(shù)=叢芽數(shù)/接種芽數(shù)。

1.2.3 生根培養(yǎng)。將增殖后的叢芽分切，接種到MS壯苗培養(yǎng)基上進(jìn)行30 d的壯苗，等植株長(zhǎng)到3～4 cm，切去基部組織，留2～3 cm接種于生根培養(yǎng)基培養(yǎng)。每水平接6瓶，每瓶接種16個(gè)外植體。20 d后統(tǒng)計(jì)生根率、根長(zhǎng)。生根率（%）=生根頂芽數(shù)/接種莖段數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 激素類型與配比濃度對(duì)啟動(dòng)培養(yǎng)的影響

將十月輝煌的帶腋芽莖段接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基7～10 d后，莖段基部開始膨大并產(chǎn)生致密的綠色愈傷組織，腋芽開始萌動(dòng)抽嫩芽，3～4周后抽莖長(zhǎng)大。試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。endprint

由表2可以看出，TDZ、AC均對(duì)十月輝煌腋芽萌芽率的影響極其顯著（P<0.05），TDZ×AC間交互作用并沒有產(chǎn)生一定的顯著性差異（P>0.05），由表3得出，AC1均值最大，為78.887%，AC1和AC2之間存在顯著性差異（P<0.05）；同理，TDZ3均值最大，其3個(gè)水平之間均存在著顯著性差異，因此十月輝煌腋芽的最佳啟動(dòng)培養(yǎng)基為AC1+TDZ3，即MS+AC 0.0 mg/L+TDZ 0.01 mg/L+BA 0.1 mg/L。從萌芽狀態(tài)來看，較高濃度的TDZ水平，使外植體產(chǎn)生了玻璃化，且從表1可以看出，TDZ 0.01 mg/L水平和TDZ 0.008 mg/L水平之間的差異不明顯，因而選擇最佳的啟動(dòng)培養(yǎng)基為MS+TDZ 0.008 mg/L+BA0.1 mg/L。

2.2 激素類型與配比濃度對(duì)叢芽增殖的影響

外植體在增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d，基部開始膨大產(chǎn)生愈傷組織，4周后產(chǎn)生叢芽，不同處理對(duì)芽的增殖影響差異很大，試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

從表4可以看出，TDZ、BA、GA3各因素對(duì)叢芽增殖均有一定的影響，根據(jù)K值大小，KA3>KA2>KA1，KB3>KB2>KB1，KC1>KC2>KC3，得出A、B、C 3個(gè)因素的最優(yōu)水平組合為A3B3C1，即最佳增殖培養(yǎng)基組合為MS+TDZ 0.01 mg/L+BA 0.1 mg/L+GA3 1.5 mg/L，增殖率為3.82。根據(jù)極差R值大小可知，RA>RB>RC，所以3個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的主次順序?yàn)锳>B>C，即 TDZ濃度水平對(duì)叢芽增殖的影響最大，BA次之，GA3對(duì)其影響最小。TDZ在0.01 mg/L 水平，增殖率雖然達(dá)3.53以上，但叢芽基部產(chǎn)生較多松軟的愈傷組織，叢芽玻璃化程度較為嚴(yán)重，長(zhǎng)勢(shì)畸形，不利于后期繼代，而BA在0.1 mg/L水平，同樣會(huì)加重叢芽的玻璃化程度，GA3為3.0 mg/L水平，叢芽的葉型不夠正常，多數(shù)產(chǎn)生狹長(zhǎng)的畸形狀態(tài)，不利于工廠化生產(chǎn)對(duì)瓶苗質(zhì)量的要求。因此，選取較佳的增殖培養(yǎng)基組合為MS+TDZ 0.005 mg/L+BA 0.05 mg/L+GA3 1.5 mg/L，增殖率為3.58。

2.3 激素類型與配比濃度對(duì)生根的影響

頂芽接入生根培養(yǎng)基2周之后，莖段基部開始冒出乳白色根頭，主根2～5個(gè)，根長(zhǎng)為3～6 cm，試驗(yàn)結(jié)果具體如表5所示。

從表6可以看出，IBA和MS對(duì)生根的影響有顯著性差異，其中IBA最顯著，NAA對(duì)生根的影響并不顯著。根據(jù)F值大小，F(xiàn)（IBA）>F（MS），得出影響十月輝煌生根率的主次順序?yàn)镮BA>MS，通過分析單因素統(tǒng)計(jì)表，得出MS（1）、IBA（2）和NAA（2）均值最大，且各因素水平間的顯著性差異都不明顯。從表4根系的狀態(tài)和數(shù)量、長(zhǎng)勢(shì)綜合分析，得出影響十月輝煌最佳的生根配方為MS1+IBA1+NAA2，即1/2MS+IBA 0.8 mg/L+NAA 0.5 mg/L。

3 結(jié)論與討論

3.1 激素類型及濃度配比對(duì)十月輝煌腋芽啟動(dòng)的影響

植物激素的多效性，為植物的體外培養(yǎng)與發(fā)展提供了有利條件，從本試驗(yàn)中得出，培養(yǎng)基中的激素及其濃度搭配對(duì)十月輝煌腋芽的萌發(fā)、叢芽的增殖和外植體的生根具有重要作用。

一般情況下，體外培養(yǎng)中植物的很多組織和器官，靠自身潛在的內(nèi)源細(xì)胞分裂素，并不能更好地支撐生長(zhǎng)發(fā)育，而通過添加外源細(xì)胞分裂素，更有利于芽的啟動(dòng)、分化與增殖。在腋芽啟動(dòng)培養(yǎng)中，僅添加了外源細(xì)胞分裂素TDZ和BA，均對(duì)十月輝煌的腋芽啟動(dòng)產(chǎn)生了很大的作用，在未添加活性炭的情況下，萌芽率隨著TDZ的濃度水平的增加而升高，當(dāng)TDZ 0.01 mg/L水平時(shí)，最高達(dá)到88.33%，隨之瓶苗的玻璃化程度逐漸加重，影響了后期的增殖，而TDZ 0.008 mg/L水平，瓶苗的玻璃化程度有所降低，MS+TDZ 0.008 mg/L+BA 0.1 mg/L，達(dá)到83.33%的萌芽率。在添加活性炭的情況下，同樣萌芽率隨著TDZ的濃度水平的增加而升高，升高趨勢(shì)趨于平緩，在TDZ處于0.01 mg/L水平時(shí)，萌芽率最高僅達(dá)到66.67%，但玻璃化程度明顯減輕，說明活性炭的加入，對(duì)腋芽的啟動(dòng)起著一定的抑制作用，或許吸附特性較強(qiáng)的活性炭吸附了一部分外源激素[6]，減弱了外源激素的活性，從而也降低了玻璃化程度。通過瓶苗的長(zhǎng)勢(shì)狀態(tài)及萌芽率，最終擇取十月輝煌腋芽的最佳啟動(dòng)培養(yǎng)基為MS+TDZ 0.008 mg/L+BA 0.1 mg/L，因?yàn)檩^高的TDZ 0.01 mg/L濃度水平，瓶苗嚴(yán)重的玻璃化，限制了后期繼代。

3.2 激素類型及濃度配比對(duì)十月輝煌叢芽增殖的影響

經(jīng)大量科學(xué)試驗(yàn)驗(yàn)證，細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素之間的不同濃度比例，更能有效地誘導(dǎo)細(xì)胞分裂或調(diào)控植物在組織培養(yǎng)過程的形態(tài)發(fā)生，較高的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素比值，一般能促進(jìn)芽的分化與增殖。

本次叢芽增殖試驗(yàn)，采用與生長(zhǎng)素效應(yīng)相似的GA3，與細(xì)胞分裂素TDZ和BA聯(lián)合使用，達(dá)到了更好的增殖效果，說明細(xì)胞分裂素TDZ與BA，能有效刺激細(xì)胞的分裂而獲得較多的叢芽。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，叢芽增殖率隨著TDZ濃度的升高而升高，玻璃化程度逐漸加重，TDZ在最高0.01 mg/L水平，增殖率雖然達(dá)3.53以上，但叢芽基部產(chǎn)生較多松軟的愈傷組織，叢芽玻璃化程度較為嚴(yán)重，長(zhǎng)勢(shì)畸形，不利于后期繼代，而S.R.Wann等發(fā)現(xiàn)美國(guó)紅楓最佳的增殖濃度為TDZ 0.01 mg/L[7]，徐 榕等[8]在自由人槭的增殖培養(yǎng)階段發(fā)現(xiàn)TDZ濃度 > 0.05 mg/L，玻璃化現(xiàn)象越嚴(yán)重。BA在0.1 mg/L水平，同樣會(huì)加重叢芽的玻璃化程度，其與TDZ 0.01 mg/L水平結(jié)合，雖然達(dá)到最高3.82的增殖率，但玻璃化瓶苗嚴(yán)重影響了繼代。GA3的加入，卻降低了瓶苗的玻璃化水平，但隨著濃度水平的增高，叢芽的葉型不夠正常，GA3 達(dá)3.0 mg/L水平時(shí)，叢芽的葉型多數(shù)產(chǎn)生狹長(zhǎng)的畸形狀態(tài)，不利于工廠化生產(chǎn)對(duì)瓶苗質(zhì)量的要求，或許高濃度的GA3產(chǎn)生了毒害作用[9]。因此，根據(jù)增殖率、叢芽的生長(zhǎng)狀態(tài)，選取較佳的增殖培養(yǎng)基組為MS+TDZ 0.005 mg/L+BA 0.05 mg/L+GA3 1.5 mg/L，增殖率為3.58。endprint

3.3 激素類型及濃度配比對(duì)十月輝煌生根的影響

對(duì)于體外培養(yǎng)物的生根培養(yǎng)，低鹽水平更有利于根系的誘導(dǎo)發(fā)生，本試驗(yàn)分別采用MS和1/2MS作為基本培養(yǎng)基來誘導(dǎo)根系，發(fā)現(xiàn)基本培養(yǎng)基中無機(jī)鹽含量的多少，對(duì)生根率的影響關(guān)系并不大，而生長(zhǎng)素類型和濃度起著比較重要的作用，在生根培養(yǎng)基過程中，生根率隨著IBA濃度的增加而增加，當(dāng)IBA達(dá)0.8 mg/L時(shí)，生根率均在85.4%以上，根系較為細(xì)長(zhǎng)，而NAA的加入對(duì)根系質(zhì)量的提高起著關(guān)鍵作用，利于根系的粗壯。竇 玥等[10]在紫葉挪威槭根系的誘導(dǎo)研究中發(fā)現(xiàn)，IBA與NAA結(jié)合使用能夠促進(jìn)生根。當(dāng)IBA達(dá)0.8 mg/L、NAA達(dá)0.5 mg/L時(shí)，生根率達(dá)最高，為95.8%，根據(jù)生根率及根的狀態(tài)獲得最佳的生根培養(yǎng)基為 MS+IBA 0.3 mg/L+NAA 0.5 mg/L。

4 參考文獻(xiàn)

[1] 鐘家驥.彩葉植物巴西紅莧和美國(guó)紅楓的組織培養(yǎng)[D].成都：四川大學(xué)，2007.

[2] 于傳.美國(guó)紅楓（Acer rubrum）的組織培養(yǎng)技術(shù)體系研究[D].重慶：西南大學(xué)，2013.

[3] 李瑩，羅曉芳，蔣湘寧.美國(guó)紅楓外植體選擇及啟動(dòng)培養(yǎng)研究[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（8）：6-9.

[4] 宗樹斌，周春玲，牛立軍，等.美國(guó)紅楓的組織培養(yǎng)研究[J].山東林業(yè)科技，2006（1）：1-3.

[5] 曹受金，劉輝華，田英翠.美國(guó)紅楓組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)的研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，49（11）：2643-2645.

[6] 王港，楊秀平，李周岐.活性炭對(duì)組織培養(yǎng)中幾種植物激素的吸附作用[J].林業(yè)科技開發(fā).2006，20（6）：26-27.

[7] PALIK B J，PREGITZER K S.The age and height structure of red maple（Acerrubrum） populations in.[J].Revue Canadienne De Recherche For-estière，1992，22（10）：1449-1462.

[8] 徐榕，苑兆和，招雪晴，等.生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)自由人械‘冷俊組培過程中增殖及生根的效應(yīng)[J].山東林業(yè)科技，2009，39（5）：17-20.

[9] 喬治 E F，阿爾 M A，克勒克 G J D E，等.植物組培快繁[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2013.

[10] 竇玥，郭海軍，邸圓媛，等.紫葉挪威槭的組織培養(yǎng)及其生根的研究[J].大連民族學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，12（3）：206-208.endprint