豬種、牛種、羊種、綿羊種布魯菌多重PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

何亞鵬，許信剛，付明哲，張 琪

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

豬種、牛種、羊種、綿羊種布魯菌多重PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

何亞鵬，許信剛，付明哲，張 琪

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

為建立在臨床樣本能夠同時(shí)檢測(cè)豬種、牛種、羊種、綿羊種布魯菌的多重PCR方法，根據(jù)NCBI已收錄的布魯菌全基因，設(shè)計(jì)并合成4對(duì)特異性引物，通過(guò)優(yōu)化多重PCR的反應(yīng)條件，建立能夠同時(shí)檢測(cè)4種布魯菌的多重PCR診斷方法。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，可以從4種布魯菌以及 4 種細(xì)菌混合物中擴(kuò)增出大小分別為276、494、733和976 bp的特異性條帶，對(duì)照組的檢測(cè)結(jié)果為陰性；敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)4種病原菌基因組DNA的檢出量為豬種32.2 pg、牛種21.3 pg、羊種27.5 pg、綿羊種43.2 pg；人工模擬感染樣本檢測(cè)結(jié)果表明，能從混合感染的病料中特異地檢測(cè)出 4 種病原菌。應(yīng)用該方法對(duì) 200 份臨床奶山羊乳樣進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果檢出4份陽(yáng)性。建立的多重PCR方法具有特異性強(qiáng)、敏感度高、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，可以有效地檢測(cè) 4 種布魯菌的感染。

豬種布魯菌；牛種布魯菌；羊種布魯菌；綿羊種布魯菌；多重PCR

布魯菌病是由布魯菌(Brucella)引起的人畜共患傳染病，嚴(yán)重危害經(jīng)濟(jì)發(fā)展和公共健康，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為B類重要傳染病，中國(guó)將其列為二類傳染病[1]?，F(xiàn)已確定的布魯菌有 7 個(gè)種(牛種、羊種、綿羊附睪種、豬種、犬種、沙林鼠種、海洋種)和20 個(gè)生物型[2]。布魯菌對(duì)牛、羊和豬的危害巨大，感染牛的有牛種、羊種和豬種布魯菌；感染山羊的有羊種、牛種布魯菌；感染綿羊的有綿羊種、牛種菌和羊種布魯菌；感染豬的有豬種、牛種和羊種布魯菌[3]。

布魯菌病臨床癥狀極為相似，在臨床上很難確定是那種病原感染所致，另外，臨床上還有混合感染的病例。目前，布病的診斷主要采用病原學(xué)和血清學(xué)方法，但這些傳統(tǒng)方法存在著檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、操作步驟繁瑣、假陽(yáng)性和假陰性較高等問(wèn)題，并對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的健康安全構(gòu)成一定的威脅[4]。目前PCR方法對(duì)布魯菌的試驗(yàn)鑒定多以種鑒定為主[5]，因此有必要建立能同時(shí)、快速、精確檢測(cè)鑒別 4 種布魯菌感染的多重PCR檢測(cè)方法。多重PCR技術(shù)是在同一PCR體系中加入多對(duì)引物對(duì)多種目的基因進(jìn)行同時(shí)擴(kuò)增的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，它具有快速、靈敏、特異等優(yōu)點(diǎn)。 IS711基因?yàn)椴剪斁霓D(zhuǎn)座基因，一般布魯菌的基因組里都有多個(gè) IS711插入序列，不同種布魯菌的 IS711插入序列數(shù)量也不同。 IS711基因序列本身在種間的差別很小，但不同種布魯菌的 IS711基因插入位置有種間特異性，可用于鑒別診斷[6]。本研究根據(jù)布魯氏菌不同種型 IS711序列拷貝數(shù)的差異設(shè)計(jì)引物檢測(cè)特異性目的基因，建立能同時(shí)檢測(cè)布魯菌 4 種種型的多重PCR方法，該方法具有較好的特異性、敏感性及重復(fù)性，比傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)方法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，可以應(yīng)用于獸醫(yī)臨床診斷以及食品安全的快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株 標(biāo)準(zhǔn)豬種布魯菌S2(CVCC 70502)、牛種布魯菌A19(CVCC 70202)、羊種布魯菌M5 疫苗株為新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品；綿羊種布魯菌由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室分離，經(jīng)測(cè)序鑒定后保存；金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、沙門(mén)菌、大腸埃希菌、多殺性巴氏桿菌由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑TaqDNA聚合酶、dNTPs、DL 2000 DNA marker等均購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 6 周齡雌性BALB/c小鼠購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。

1.1.4 樣品來(lái)源 200 份乳樣采自陜西省某奶山羊養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 方 法

1.2.1 模板的制備 將布魯菌及試驗(yàn)用各菌株分別接種于各自適宜的液體培養(yǎng)基，放入搖床，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h。取1 mL細(xì)菌培養(yǎng)液，12 000 r/min離心1 min，棄上清后按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，提取的各細(xì)菌DNA保存于-20 ℃冰箱，備用。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中已發(fā)布的豬種(B.suis)、牛種(B.abortus)、羊種(B.melitensis)、綿羊種(B.ovis)布魯菌的 IS711基因序列，并參照國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)[7-10]，利用Primer 5.0分析軟件，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增布魯菌種特異性基因的4對(duì)特異性引物。引物序列及其位置、擴(kuò)增產(chǎn)物的大小見(jiàn)表1，引物由Invitrogen上海貿(mào)易有限公司合成。

表1 PCR引物信息Table 1 Information of primer for PCR

1.2.3 單項(xiàng)PCR檢測(cè)方法的建立 為確定單項(xiàng)PCR擴(kuò)增的最佳條件及檢測(cè)單基因PCR擴(kuò)增的特異性，分別以 4 個(gè)細(xì)菌的DNA為模板，用相應(yīng)的引物進(jìn)行單項(xiàng)PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：模板DNA 2 μL，上、下游引物各0.5 μL(20 pmol/μL)，2 μL dNTP(2.5 mmol/L)，2 μL MgCl2(25 mmol/ L)，Taq酶0.2 μL(5 U/μL)，10×PCR buffer 2.5 μL，其余用滅菌ddH2O補(bǔ)足。PCR反應(yīng)程序：95 ℃變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，30 個(gè)循環(huán)；最后 72 ℃延伸10 min。為摸索不同退火溫度的影響，將退火溫度設(shè)定為51、53、55、57 ℃ 4個(gè)梯度進(jìn)行PCR反應(yīng)，以確定單項(xiàng)PCR最佳退火溫度。

1.2.4 多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 影響多重PCR反應(yīng)的主要因素是退火溫度和引物濃度，因此對(duì)這2 個(gè)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。將豬種、牛種、羊種、綿羊種布魯菌的DNA均稀釋為100 μg/mL，等量混勻作為模板。根據(jù)引物初始退火溫度，按照2 ℃梯度設(shè)定51、53、55、57、59 ℃的多重PCR退火溫度試驗(yàn)；按照0.2 μmol/L濃度梯度設(shè)定各引物對(duì)濃度組合(0.2、0.2、0.2、0.2 μmol/L；0.4、0.4、0.4、0.4 μmol/L；0.6、0.6、0.6、0.6 μmol/L；0.8、0.8、0.8、0.8 μmol/L；1.0、1.0、1.0、1.0 μmol/L)的引物優(yōu)化試驗(yàn)，篩選多重PCR擴(kuò)增的最佳反應(yīng)體系和程序。

1.2.5 多重PCR特異性試驗(yàn) 分別以豬種、牛種、羊種、綿羊種布魯菌及4種細(xì)菌隨機(jī)組合混合物的基因組作為模板，以金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、多殺性巴氏桿菌、沙門(mén)菌、無(wú)乳鏈球菌等細(xì)菌DNA和雙蒸水作為陰性對(duì)照，使用4對(duì)引物的混合物，采用優(yōu)化的多重PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)試多重PCR反應(yīng)的特異性。

1.2.6 多重PCR靈敏性試驗(yàn) 分別提取4種細(xì)菌DNA，經(jīng)核酸蛋白定量?jī)x測(cè)得豬種、牛種、羊種、綿羊種布魯菌DNA的質(zhì)量濃度分別為322.42、213.34、275.14、432.13 ng/μL，多重PCR從初始質(zhì)量濃度開(kāi)始，按101～106梯度進(jìn)行倍比稀釋，采用優(yōu)化的多重PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增，以檢測(cè)其敏感性。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 用建立的多重PCR方法，分別對(duì)豬種、牛種、羊種、綿羊種布魯菌及4者混合的陽(yáng)性樣品、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、多殺性巴氏桿菌、沙門(mén)菌、無(wú)乳鏈球菌等細(xì)菌對(duì)照樣品各2份重復(fù)檢測(cè)3次，以驗(yàn)證多重PCR方法的穩(wěn)定性。

1.2.8 人工模擬試驗(yàn) 將4種細(xì)菌進(jìn)行不同種類的排列與組合，按照下列設(shè)計(jì)對(duì)16只小鼠進(jìn)行腹腔感染細(xì)菌：豬種(0.2 mL)；牛種(0.2 mL)；羊種(0.2 mL)；綿羊種(0.2 mL)；豬種+牛種(每種菌0.1 mL)；豬種+羊種(每種菌0.1 mL)；豬種+綿羊種(每種菌0.1 mL)；牛種+羊種(每種菌0.1 mL)；牛種+綿羊種(每種菌0.1 mL)；羊種+綿羊種(每種菌0.1 mL)；豬種+牛種+羊種(每種菌0.07 mL)；豬種+羊種+綿羊種(每種菌0.07 mL)；牛種+羊種+綿羊種(每種菌0.07 mL)；豬種+牛種+綿羊種(每種菌0.07 mL)；豬種+牛種+羊種+綿羊種(每種菌0.05 mL)；生理鹽水(0.2 mL對(duì)照組)。24 h后將小鼠斷頸處死，無(wú)菌采取肝、脾、淋巴結(jié)等病料，混合樣品約100 mg，加液氮充分研磨后轉(zhuǎn)入組織勻漿器中，加入10 mmoL/L PBS(pH 7.2)充分勻漿。按照細(xì)菌DNA提取試劑盒方法提取細(xì)菌DNA，利用已建立的多重PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.9 臨床樣品檢測(cè) 利用已建立的多重PCR方法檢測(cè)陜西省某奶山羊養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的200份待檢乳樣。乳樣5 mL 10 000 r/min離心10 min，棄掉上清后按照細(xì)菌DNA提取試劑盒方法提取細(xì)菌DNA，利用已建立的多重PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單項(xiàng)PCR擴(kuò)增

單基因PCR擴(kuò)增后，可分別觀察到 276 bp(豬種)、494 bp(牛種)、733 bp(羊種)和 976 bp(綿羊種)的條帶(圖1)，大小與預(yù)期相符，表明設(shè)計(jì)的引物特異。采用不同的退火溫度進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果表明，退火溫度為51、53、55、57 ℃時(shí)結(jié)果差異不大(圖1)。

a.豬種布魯菌B.suis；b. 牛種布魯菌B.abortus；c.羊種布魯菌B.melitensis；d.綿羊種布魯菌B.ovis；M.DL 2000 DNA marker；1～4.退火溫度分別為51、53、55、57 ℃ Annealing temperature were 51 ℃，53 ℃，55 ℃，57 ℃, respectively

圖1 單項(xiàng)PCR擴(kuò)增及退火溫度的優(yōu)化

Fig.1 Single PCR amplification and optimization of annealing temperature

2.2 多重PCR退火溫度優(yōu)化

采用不同的退火溫度(51、53、55、57、59 ℃)進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，結(jié)果表明，四重PCR反應(yīng)在 53、55、57 ℃時(shí)都有較好的擴(kuò)增結(jié)果(圖2)，以降低非特異性擴(kuò)增的可能性及得到理想的擴(kuò)增效果為原則，最終選擇55 ℃作為多重PCR反應(yīng)的退火溫度。

M.DL 2000 DNA marker；1～5.退火溫度分別為51、53、55、57、59 ℃ Annealing temperatures were 51 ℃，53 ℃，55 ℃，57 ℃ and 59 ℃, respectively

圖2 多重PCR退火溫度的優(yōu)化

Fig.2 Optimal annealing temperature in multiplex PCR

2.3 引物比例優(yōu)化

取不同濃度的引物組合進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，以摸索引物的最佳濃度及各引物間的最佳比例。結(jié)果表明，4種引物對(duì)的濃度均為0.6 μmol/L時(shí)多重PCR的擴(kuò)增效果最理想(圖3)。

M.DL 2000 DNA marker；1～5.豬種、牛種、羊種、綿羊種布魯菌引物的濃度分別為：0.2、0.2、0.2、0.2 μmol/L；0.4、0.4、0.4、0.4 μmol/L；0.6、0.6、0.6、0.6 μmol/L；0.8、0.8、0.8、0.8 μmol/L；1.0、1.0、1.0、1.0 μmol/L Primers concentration(μmol/L)forB.suis,B.abortus,B.melitensisandB.oviswere 0.2, 0.2, 0.2, 0.2 μmol/L；0.4, 0.4, 0.4, 0.4 μmol/L; 0.6, 0.6, 0.6, 0.6 μmol/L; 0.8, 0.8, 0.8 0.8 μmol/L; 1.0, 1.0, 1.0, 1.0 μmol/L,respectively

圖3 多重PCR引物濃度的優(yōu)化

Fig.3 Optimal primer concentration used in multiplex PCR

2.4 多重PCR反應(yīng)特異性擴(kuò)增

采用優(yōu)化的擴(kuò)增條件進(jìn)行多重PCR反應(yīng)。結(jié)果表明，豬種、牛種、羊種、綿羊種布魯菌及 4 種細(xì)菌的混合樣品均可擴(kuò)增出特異的目的片段，而其他細(xì)菌和水均無(wú)擴(kuò)增條帶，結(jié)果與預(yù)期相符，說(shuō)明方法特異性良好(圖4)。

2.5 多重PCR反應(yīng)靈敏性試驗(yàn)

采用優(yōu)化的多重PCR擴(kuò)增條件擴(kuò)增倍比稀釋的 4 種細(xì)菌DNA，分別測(cè)出多重PCR對(duì)豬種、牛種、羊種、綿羊種布魯菌的最低檢出量分別為 32.2、21.3、27.5、43.2 pg(圖5)。

M.DL 2000 DNA marker；1.豬種布魯菌B.suis；2.豬種+牛種布魯菌B.suisandB.abortus；3.豬種+牛種+羊種布魯菌 suis,B.abortusandB.melitensis；4. 豬種+牛種+羊種+綿羊種布魯菌B.suis,B.abortus,B.melitensisandB.ovis；5.金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus；6.大腸埃希菌Escherichiacoli;7.多殺性巴氏桿菌Pasteurellamultocida；8. 沙門(mén)菌Salmonella；9.無(wú)乳鏈鏈球菌Streptococcusagalactiae；10.雙蒸水 ddH2O

圖4 多重PCR特異性試驗(yàn)

Fig.4 Specificity test of multiplex PCR

M.DL 2000 DNA marker；1～6. 101～106倍比稀釋的4種細(xì)菌DNA混合物的PCR擴(kuò)增結(jié)果 PCR result for different dilutions of template from 101to106

圖5 多重PCR靈敏性測(cè)定

Fig.5 Sensitivity of multiplex PCR assay

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

用建立的多重PCR方法在不同時(shí)間進(jìn)行 3 次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果獲得相同的檢測(cè)結(jié)果，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 人工模擬試驗(yàn)

無(wú)菌采取1～16號(hào)小鼠病料并提取DNA，按照優(yōu)化的多重PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖 6。每份病料均擴(kuò)增出所感染細(xì)菌相應(yīng)的特異條帶，而生理鹽水對(duì)照無(wú)擴(kuò)增條帶，證明建立的多重PCR方法可以應(yīng)用于臨床病料的檢測(cè)。

M.DL 2000 DNA marker；1～16.1～16號(hào)小鼠樣品 Samples of 1-16 mice

圖6 人工模擬試驗(yàn)多重PCR檢測(cè)

Fig.6 Multiple PCR detection results of artificial simulation test

2.8 臨床樣本檢測(cè)

對(duì)200份奶樣進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果檢出 4 份陽(yáng)性，均為羊種布魯菌，檢出率約為 2%。部分樣品的檢測(cè)電泳結(jié)果見(jiàn)圖7。4 份陽(yáng)性樣品經(jīng)回收后測(cè)序均為羊種布魯菌的特異性序列。

M.DL 2000 DNA marker；1～9. 9個(gè)臨床樣品 Nine clinical samples；；10.陰性對(duì)照 Negative control

圖7 部分臨床樣品的多重PCR檢測(cè)

Fig.7 Multiple PCR detection results of some clinic samples

3 討 論

布魯菌可感染豬、牛、羊、綿羊、鼠、犬和人類，對(duì)養(yǎng)殖行業(yè)以及人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[11]。布魯菌病在全世界許多國(guó)家都有分布，不論它在哪個(gè)國(guó)家暴發(fā)都會(huì)給該國(guó)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，甚至造成人員的死亡，因此它在公共衛(wèi)生上有很重要的意義。由于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法有很多的缺點(diǎn)和局限性，不能在全世界范圍內(nèi)消滅布氏桿菌病。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展和各項(xiàng)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，為細(xì)菌分類鑒定提供一些有效的新方法，可以在基因水平上對(duì)布氏桿菌病進(jìn)行檢測(cè)，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和速度。

IS711是布魯菌基因組中特有的插入序列，該序列在不同種布魯菌基因組中非常保守，但卻存在拷貝數(shù)差異[6]。本研究參照Genbank提供的豬種、牛種、羊種、綿羊種布魯菌的 IS711基因序列和相關(guān)文獻(xiàn)[6-7,12]，選取 4 對(duì)特異性引物，擴(kuò)增片段大小分別為 276 bp(豬種)、494 bp(牛種)、733 bp(羊種)和 976 bp(綿羊種)。本研究首先經(jīng)過(guò)摸索反應(yīng)條件建立單項(xiàng)PCR反應(yīng)，然后通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定多重PCR反應(yīng)的循環(huán)體系及反應(yīng)條件，重點(diǎn)對(duì)影響多重PCR反應(yīng)的主要因素如退火溫度和引物濃度進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整和優(yōu)化，最終確定多重PCR的最佳退火溫度為 55 ℃，最佳引物濃度為 0.6 μmol/L。本研究建立的多重PCR反應(yīng)對(duì)豬種、牛種、羊種、綿羊種布魯菌DNA的最低檢出量分別為32.2、21.3、27.5、43.2 pg，具有較高的靈敏性，這樣的敏感性遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，并且已經(jīng)可以滿足臨床檢測(cè)和監(jiān)測(cè)的需要。

本試驗(yàn)中目的片段均間隔 200 bp以上，擴(kuò)增結(jié)果顯示，目的條帶在瓊脂糖凝膠電泳后易于區(qū)分且無(wú)非特異性擴(kuò)增出現(xiàn)。用本試驗(yàn)建立的PCR方法對(duì)臨床模擬樣品和臨床奶樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果模擬試驗(yàn)顯示完全能夠檢測(cè)到四重、三重、兩重、單一細(xì)菌的感染，臨床奶樣也檢出布魯菌的污染。本研究建立的多重PCR檢測(cè)方法可以為快速檢測(cè)豬種、牛種、羊種、綿羊種布魯菌提供敏感和特異的技術(shù)手段，以期達(dá)到對(duì)導(dǎo)致動(dòng)物疫病以及動(dòng)物奶產(chǎn)品污染的布魯菌的快速檢測(cè)。

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(責(zé)任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

Foundation and Initial Application of Multiplex PCR Method for DetectingB.suis,B.abortus,B.melitensisandB.ovisInfection

HE Yapeng, XU Xingang, FU Mingzhe and ZHANG Qi

(College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China)

In order to develop multiplex PCR assay for clinical detection ofB.suis,B.abortus,B.melitensisandB.ovisinfection, four pairs of primers were designed and synthesized based on highly conserved regions ofB.suis,B.abortus,B.melitensisandB.ovisgenome sequence in Genbank. The multiplex PCR reaction condition was optimized and multiplex PCR method for detectingB.suis,B.abortus,B.melitensisandB.ovisinfection was established. The specificity test showed that fragments of 276 bp, 494 bp, 733 bp and 976 bp were amplified from genomic DNA ofB.suis,B.abortus,B.melitensisandB.ovis，respectively. No amplification was achieved from control groups of other bacteria. The sensitivity test showed that the multiplex PCR could detect genome DNA of 21.3 pg forB.abortus, 27.5 pg forB.melitensis, 43.2 pg forB.ovisand 32.2 pg forB.suis. The artificial simulation test showed that the multiplex PCR could detect four kinds of pathogens from co-infection disease material. The initial application test showed 200 clinical goat’s milk samples were subjected to PCR. Among 4 clinical samples wereB.melitensis-positive. The result indicated the multiplex PCR method had advantages of specificity, sensitivity, repetition, and it could effectively detect the infection ofB.suis,B.abortus,B.melitensisandB.ovisin clinical samples.

B.suis;B.abortus;B.melitensis;B.ovis; Multiplex PCR

2016-05-03 Returned 2016-05-23

Scientific and Technological Projects of Shaanxi Province (No.2016NY-092); Project of Major Industrial Innovation Chain of Shaanxi Province(No.2016KTZDNY02-06);Project for Technology Achievement Extension of Demonstration Station(Base)of Northwest A&F University(No.TGZX2015-32).

HE Yapeng, male, master student.Research area:molecular etiology and immunology. E-mail:879533817@qq.com

ZHANG Qi, female, Ph.D, lecturer.Research area:molecular etiology.E-mail:273010466@qq.com

日期：2017-08-18

2016-05-03

2016-05-23

陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)(2016NY-092)；陜西省重點(diǎn)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新鏈(2016KTZDNY02-06)；西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)示范站(基地)科技成果推廣(TGZX2015-32)。

何亞鵬，男，碩士研究生，從事分子病原學(xué)與免疫學(xué)研究。E-mail：879533817@qq.com

張 琪，女，博士，講師，主要從事分子病原學(xué)研究。E-mail：273010466@qq.com 付明哲，男，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事羊病研究。E-mail：286567031@qq.com

S855.1

A

1004-1389(2017)08-1135-06

FU Mingzhe, male, senior veterinarian.Research area:sheep diseases.E-mail:286567031@qq.com

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170818.0938.012.html