膜生物反應器降解對氨基苯磺酸的性能及微生物群落特征

閆凱麗, 鄭君健, 王志偉, 吳志超

同濟大學環(huán)境科學與工程學院, 上海 200092

膜生物反應器降解對氨基苯磺酸的性能及微生物群落特征

閆凱麗, 鄭君健, 王志偉*, 吳志超

同濟大學環(huán)境科學與工程學院, 上海 200092

為研究MBR(膜生物反應器)降解SA(對氨基苯磺酸)的性能，構建一套連續(xù)流MBR，針對ρ(SA)為25 mg/L的模擬廢水進行處理，并通過高通量測序對MBR運行過程中微生物群落特征變化進行生物學層面的分析. 結果表明：經過31 d的啟動馴化后，SA基本可以完全降解，CODCr、NH4+-N、TN和TP的去除率分別為87.63%±5.95%、91.94%±8.80%、32.38%±11.6%和85.69%±13.82%. 對馴化及穩(wěn)定運行階段的污泥進行微生物菌群分析結果表明，在“門”水平上主要的微生物菌群為擬桿菌門、變形菌門和綠彎菌門，其中擬桿菌門是處理含SA廢水的優(yōu)勢菌群. 在“科”水平上，噬幾丁質菌科、腐螺旋菌科、紅環(huán)菌科、叢毛單胞菌科和拜葉林克氏菌科為主要的微生物菌群，隨著反應器的長期馴化和運行，噬幾丁質菌科逐漸成為反應器中優(yōu)勢菌群. 研究顯示，MBR對SA、CODCr、NH4+-N和TP都有很好的去除效果，擬桿菌門和噬幾丁質菌科分別為處理SA的優(yōu)勢“門”和“科”.

對氨基苯磺酸； 膜生物反應器； 微生物群落

磺化芳香族胺類化合物作為化工中間體，被大量用于染料、植物保護劑、清潔劑和磺胺類藥物等的生產和使用[1]. SA(sulfanilic acid，對氨基苯磺酸)是一種典型的磺化芳香族胺類化合物，其結構含有氨基(—NH2)和磺酸基(—SO3H)兩性官能團，具有高極性和高水溶性的特點，化學結構穩(wěn)定，屬難生物降解的化學物質[2- 3]，含SA的廢水會對生態(tài)環(huán)境造成嚴重的影響[4]，危害人類健康[5]. 因此，SA污染的廢水在其排放到環(huán)境中之前需要進行一定的處理.

國內外關于SA生物處理的研究主要是利用從受污染的污泥或土壤中篩選分離出來的純菌或特定種類混合菌對SA降解. 如Feigel等[6- 7]首次報道了Hydrogenophagapalleronii(strain 1)和Agrobacteriumradiobacter(strain 2)混合菌群可相互協同，共同代謝SA；Gan等[8]發(fā)現從紡織廢水處理廠分離出的Hydrogenophagasp. PBC和Ralstoniasp. PBA可以耐受c(SA)為100 mmol/L的污水，并在好氧條件下以其作為碳源、氮源和硫源生長. 利用純菌或特定種類的混合菌種處理SA，對理解SA在微生物作用下的降解機理有重要的作用，而在實際廢水處理中仍然具有一定的局限性. 活性污泥作為混合微生物體廣泛應用于廢水處理，具有實際應用前景，如CHEN等[9]馴化出能高效降解SA的活性污泥，并探究了SA降解和氧氣的消耗之間的動力學關系.

MBR(膜生物反應器)是膜分離技術與活性污泥技術相結合的污水處理新工藝，以膜處理單元(超濾膜或微濾膜)取代二沉池，實現了HRT(水力停留時間)與SRT(污泥泥齡)的徹底分離，較傳統污水處理工藝，系統可以在較長的SRT下運行，對于生長緩慢的難降解有機物分解菌的生長非常有利，有利于在系統中形成優(yōu)勢菌種；同時，生物反應器中的活性污泥濃度增加，也有利于提高難降解有機物的降解效率[10]. 但是有關利用MBR處理含SA廢水方面的研究在國內外相對較少. 因此，該研究擬構建一套連續(xù)流MBR，馴化能高效降解SA的活性污泥，探究MBR的運行特征和污染物的去除效果，同時，通過高通量測序對微生物群落特征變化進行了生物學層面的分析.

1 材料與方法

1.1試驗裝置

采用平板式MBR處理含SA的模擬廢水. 污水進入反應器后，通過進水箱溢流和單向閥保持液位穩(wěn)定. 反應器有效容積為3.3 L，池內放置2片超濾膜組件(單片尺寸為23 cm×10 cm，單片有效尺寸為21 cm×8 cm)，2片檔板(單片尺寸為23 cm×10 cm)分立于膜組件兩側，膜組件與擋板間距為1 cm. 曝氣管安置于超濾膜底部，試驗過程中曝氣強度利用氣體流量計控制為72 m3/(m2·h)(按照膜區(qū)投影面積計). MBR出水采用蠕動泵(蘭格，中國保定)間歇抽吸，抽停比為10 min∶2 min出水通量維持在20 L/(m2·h). TMP(跨膜壓差)由壓力表記錄，當TMP>30.0 kPa時，采用0.5%的次氯酸鈉浸泡2 h，進行膜清洗，用清洗后的膜繼續(xù)進行試驗. 該研究采用的自制超濾膜[11]基本性質如表1所示，其中臨界通量為(25±1) ℃下通過增加通量梯度法[12]測定.

1.2進水水質

表1 超濾膜基本性質一覽

進水為模擬廢水，進水組成：ρ(CH3COONa)為473 mg/L，ρ(NH4Cl)為153 mg/L，ρ(K2HPO4·3H2O)為52 mg/L，ρ(CaCl2)為11.5 mg/L，ρ(MgCl2·6H2O)為20.3 mg/L，ρ(NaHCO3)為120 mg/L，ρ(NaCl)為800 mg/L，ρ(FeCl2·4H2O)為7.16 mg/L，ρ(SA)為25 mg/L，φ(微量元素)為10 μL/L.

接種污泥取自上海某污水處理廠二沉池回流污泥. 該試驗持續(xù)80 d，HRT為2 h，通過定期排泥控制SRT為40 d.

1.3分析方法

試驗涉及的分析項目ρ(CODCr)、ρ(TN)、ρ(NH4+-N)、ρ(NO3--N)、ρ(TP)和污泥ρ(MLSS)、ρ(MLVSS) 均采用國標方法[13]測定. SMP(溶解性微生物產物)和EPS(胞外聚合物)采用超聲法[14]提??；其中的ρ(多糖)采用蒽酮法測定；ρ(蛋白質)和ρ(腐殖酸)采用改進Lowry法[15]測定；SOUR(好氧呼吸速率)通過溶解氧電極法[16]測定；ρ(SA)通過液相色譜法[6]測定.

當MBR開始運行(第1天)以及運行7、14、24、40、55和68 d時，取反應器的活性污泥進行微生物群落分析，具體分析方法如下：

活性污泥樣品首先利用E.Z.N.A.?泥土樣本DNA提取試劑盒(Omega Bio-Tek 公司，美國) 抽提DNA，完成DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA. PCR擴增中，使用的引物為338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCA)和806R (GGACT ACHVGGGTWTCTAAT). 基于第二代高通量測序平臺Illumina Miseq，采用二次PCR建庫測序. 采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，據SILVA123庫中的參考序列對OTU在各個水平統計每個樣品的群落組成.

2 結果與討論

2.1反應器的運行特征

MBR運行過程中，ρ(MLSS)為(13.46±1.65)g/L，ρ(MLVSS)為(11.24±1.44)g/L. 利用微生物的SOUR表征馴化過程中微生物的活性變化，由圖1可見，污泥活性在試驗初期較低，隨著試驗的進行逐漸升高，然后略有降低并趨于穩(wěn)定，說明反應器內的微生物逐漸適應SA的存在，活性不斷上升到一定水平后，可能由于微生物競爭的關系活性有一定程度的下降，然后保持穩(wěn)定. 由于污泥較高的濃度和活性，試驗過程中，反應器內ρ(DO)較低，為(0.48±0.37)mg/L. 恒流過濾下，可以通過TMP表征膜污染，TMP變化如圖2所示. 整個試驗過程(80 d)中，反應器內的超濾膜運行了近3個周期，平均運行周期約為30 d. 污泥SMP中的ρ(蛋白質)、ρ(腐植酸)和ρ(多糖)分別為(13.77±6.98)(10.23±8.06)(18.12±10.33)mg/L，EPS中w(蛋白質)、w(腐植酸)和w(多糖)(均以每g VSS計)分別為(55.08±11.00)(7.35±6.99)(13.23±5.03) mg/g(n=13)，濃度波動較小，膜污染情況相對穩(wěn)定，說明該條件下MBR可以實現長期穩(wěn)定運行.

圖1 MBR中活性污泥的SOURFig.1 The SOUR of activated sludge in MBR

圖2 MBR運行過程中TMPFig.2 The TMP evolution in MBR

2.2污染物去除效果

由圖3可見，進水ρ(SA)為(26.23±0.73)mg/L，運行10 d左右出水ρ(SA)開始逐漸降低，31 d后SA基本可以被完全降解并保持穩(wěn)定，這可能是由于隨著運行時間的延長，反應器內微生物種類發(fā)生了變化，適應SA特性的菌種逐漸增加，SA的去除效率也隨之提高. 與傳統活性污泥法[9]相比，MBR的馴化時間更短，在降解SA方面有獨特的優(yōu)勢. 進水ρ(CODCr) 為(375.39±14.82)mg/L時，去除率可達到87.63%±5.95%. 該反應器對NH4+-N有良好去除效果，進水ρ(NH4+-N)為(38.34±2.24)mg/L時，91.94%±8.80%的NH4+-N轉化為NO2--N與NO3--N. MBR在較低ρ(DO)的情況下還可以達到較高的NH4+-N去除率，主要歸因于MBR通過膜分離實現污水處理的固液分離，減少了長世代周期的硝化細菌的流失；同時該研究中采用了較長的SRT, 也保證了硝化細菌的生存環(huán)境[17]. 同時，由于MBR中保持較低的ρ(DO)，MBR中可以實現同步硝化反硝化，而部分聚磷菌能以硝酸鹽作為電子受體在進行反硝化的同時完成過量吸磷，因此該MBR系統中存在磷元素的去除，在進水ρ(TN)和ρ(TP)分別為(37.16±2.97)(3.87±0.61)mg/L時，其去除率達到32.38%±11.6%、85.69%±13.82%.

2.3微生物多樣性及相似度分析

為研究反應器在馴化及穩(wěn)定運行階段微生物菌群的變化情況，在運行的各個階段取出生物反應區(qū)污泥進行微生物分析. 取樣時間分別為1 d(試驗開始時)、7 d(SA開始降解時)、14 d(約20%SA降解時)、24 d(約40%SA降解時)、40 d(SA完全降解時)、55 d(穩(wěn)定階段)和68 d(穩(wěn)定階段)，樣品編號分別為D1、D7、D14、D24、D40、D55、D68. 圖4為各個階段的細菌群落在97%相似性下的稀釋性曲線，曲線趨于平坦，說明測序數量趨于飽和，表明現有的測序數據量對于獲得新物種已經足夠. 從圖4中可以看出，當測序數量大于 28 524 時，基本沒有新的物種再出現，表明測序數量已經足夠. 同時由表2可見，7個樣品的細菌基因庫Goods coverage值(樣品文庫的覆蓋率)均大于99.5%，說明MBR中絕大部分微生物已被檢測出來，測序結果可以代表樣品中的真實情況.

表2中的Chao指數通常被用來估算當測序序列趨向無窮時可獲得的OTU數量，Chao指數越大，表明樣品中所含物種種類越多，樣品的豐富度越高. Shannon-Wiener多樣性指數常用來估算樣品中微生物多樣性指數，Shannon-Wiener多樣性指數越大，說明群落多樣性越高. 在馴化的初始階段(1～7 d)，微生物的Chao指數基本穩(wěn)定，而Shannon-Wiener多樣性指數卻有所下降. 這可能是因為含SA的廢水剛進入后，一些微生物種群由于不適應含SA的而消亡，多樣性下降；而部分微生物種群內卻逐漸衍生更多種類的微生物，豐富度可以基本保持穩(wěn)定. 之后，Shannon-Wiener多樣性指數呈一個先略上升后略有下降并基本穩(wěn)定的過程，說明隨著污泥馴化時間的推移，微生物種群多樣性結構趨于穩(wěn)定，優(yōu)勢菌種基本確定. 總體上來看，Shannon-Wiener多樣性指數的變幅較小，微生物種群多樣性變化不大. 從Chao指數的角度來看，8～40 d細菌的豐富度呈上升趨勢，這可能是因為含SA的廢水，使反應器內部衍生出了一些新的微生物種類，而后隨著馴化時間的延長(40 d之后)，微生物逐漸適應了含SA的廢水，菌群豐富度基本穩(wěn)定并略有下降，而相應的SA去除率逐漸升至97%左右并保持穩(wěn)定.

圖3 MBR中進出水ρ(SA)、ρ(CODCr)、ρ(NH4+-N)、ρ(TN)及ρ(TP)Fig.3 The ρ(SA), ρ(CODCr), ρ(NH4+-N), ρ(TN) and ρ(TP) of effluent and influent in MBR

圖4 樣品細菌群落的稀釋性曲線Fig.4 Rarefaction curve of sludge samples

表2 各個階段細菌的Alpha多樣性參數(相似度為97%)

為分析各個階段細菌群落的相似程度，對各個階段的污泥樣品進行了主成分分析(PCA)和多樣本相似度樹狀圖分析，結果如圖5所示. OTU數據被提取出兩個主成分，對于細菌，兩主成分分別解釋PCA結果的77.57%和17.37%. 從圖5可以看出，細菌樣品可以分為兩個大組：第一組包括D1、D7、D14和D24樣品；第二組包括D40、D55和D68樣品. 這兩組不論是從PC1和PC2來看，均有較大差異性. 由此認為試驗的馴化期和穩(wěn)定期，細菌群落發(fā)生了顯著變化. 第一組中的4個樣品在PC1上也有較大差異，說明當進水中開始加入SA時，細菌群落內部發(fā)生相關菌群的富集與淘汰，逐漸適應含SA的廢水，結合圖3也可以看出隨著微生物的富集和淘汰，出水ρ(SA) 逐漸降低. 第二組內3個樣品表現出了較高的相似性，說明隨著污泥馴化結束，細菌群落構成趨于穩(wěn)定，圖3中顯示試驗后期出水ρ(SA)為0.18～1.78 mg/L，MBR運行效果穩(wěn)定. 從圖5(b)中的相似度樹狀圖也可以看出，樣品分成了兩個明顯的大組.

圖5 各階段微生物群落的主成分分析及相似度樹狀圖Fig.5 The principal component analysis and similarity tree of sludge samples at different stages

2.4與SA降解相關的優(yōu)勢菌群分析

為了進一步分析與SA降解相關的優(yōu)勢菌種，分別對比7個樣品在“門”和“科”層面上的微生物種群結構. 分析結果如圖6所示，其中相對豐度為相應種群OTU數與各樣品總OTU數的比值，在每個樣品中相對豐度小于1%的細菌群落被劃分為others. 7個樣品中共檢測擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、綠菌門(Chlorobia)、Parcubacteria、疣微菌門(Verrucomicrobia)、浮霉菌門(Planctomycetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、放線菌門(Actinobacteria)和Gracilibacteria 12個門. 其中，優(yōu)勢門(相對豐度>10%)為擬桿菌門、變形菌門和綠菌門，三種門總豐度保持為87.92%～93.69%. 雖然眾多研究[8- 10,18- 19]表明，能以SA為唯一碳源和能源生長的菌種大部分為變形菌門，但是在該研究中，擬桿菌門相對豐度隨著馴化過程逐漸增大(由12%升至54%左右)，而變形菌門則逐漸減少(由63%降至27%左右)，研究[20]表明，擬桿菌門類微生物更適宜在厭氧發(fā)酵的環(huán)境中存活，因此，可能是因為該研究中低ρ(DO)環(huán)境更適合擬桿菌的生長，并且存在能降解SA或其轉化物的菌種. 綠菌門相對豐度的變幅不如前兩個明顯，由13%降至6%左右. 此外，Parcubacteria、疣微菌門和浮霉菌門的相對豐度有1%～2%的增加，而綠彎菌門、酸桿菌門、厚壁菌門、硝化螺旋菌門和放線菌門的豐度有1%以內的下降.

圖6 各階段污泥樣品門水平和科水平的細菌變化情況Fig.6 The distribution on phylum and family of sludge samples

將個7樣品中的微生物繼續(xù)細分至細菌科可以更好地了解微生物在MBR中的功能. 相對豐度大于1%的細菌科共鑒定出27個，其中主要細菌科(相對豐度>10%)為噬幾丁質菌科(Chitinophagaceae)、腐螺旋菌科(Saprospiraceae)、紅環(huán)菌科(Rhodocyclaceae)、叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)和拜葉林克氏菌科(Beijerinckiaceae)5個，其相對豐度之和為55.13%～67.90%. 其中，噬幾丁質菌科隨著馴化時間的延長相對豐度逐漸升高(由0.73%升至27.06%)，成為最主要的微生物菌種，研究表明噬幾丁質菌科普遍存在于工業(yè)廢水處理系統中[21]，在焦化廢水(主要成分為苯酚)處理中是一種優(yōu)勢菌群[22]，噬幾丁質菌科的某些菌種可能能降解某些苯系物，而這些苯系物可能是SA降解的中間產物. 腐螺旋菌科在整個馴化過程中的相對豐度變化不大，其可分泌胞外聚合物，代謝葡萄糖、半乳糖、醋酸鹽等[23]. 紅環(huán)菌科的細菌，包括Thauera、Azoarcus和其他屬的細菌經常在廢水處理反硝化反應器群落中被發(fā)現[24]，在試驗過程中相對豐度由22%降至7%左右，降幅較大. 拜葉林克氏菌科相對豐度也由10%降至3%左右. 而具有降解芳香族化合物能力的叢毛單胞菌科細菌[25- 26]的相對豐度雖然由12%降至3%左右，但是叢毛單胞菌科中的氫噬胞菌屬(Hydrogenophaga)卻由0.2%升至2%，有研究[6- 8]表明，氫噬胞菌屬中的某些菌種可以將SA降解為4-磺酸基-兒茶酚，是SA降解的一種常見的細菌，在SA的轉化降解過程中發(fā)揮重要的作用. 此外，噬胞菌科和黃桿菌科相對豐度分別有大約6%和4%的上升，而疣微菌綱、硝化螺旋菌等則有約1%的下降.

3 結論

a) 曝氣強度為72 m3(m2·h)，運行通量為20 L(m2·h) 時，超濾膜的清洗周期大約為30 d.

b) 在HRT為2 h的條件下，出水ρ(SA)在第31天降至0.5 mgL以下并保持穩(wěn)定，馴化過程結束. 運行過程中對NH4+-N、CODCr、TN和TP的去除率分別為91.94%±8.80%、87.63%±5.95%、32.38%±11.6%和85.69%±13.82%.

c) 通過對馴化階段以及穩(wěn)定運行階段時生物反應區(qū)污泥進行微生物菌群分析發(fā)現，擬桿菌門為處理含SA廢水的優(yōu)勢菌門，而噬幾丁質菌科是主要的優(yōu)勢菌科.

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Sulfanilic Acid Biodegradation and Resulting Microbial Communities Using Membrane Bioreactor

YAN Kaili, ZHENG Junjian, WANG Zhiwei*, WU Zhichao

School of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China

A continuous-flow membrane bioreactor (MBR) was operated for the treatment of simulated wastewater containing 25 mg/L sulfanilic acid (SA) to study SA biodegradation. After 31 d acclimation period, SA was degraded completely, and the removal efficiencies of CODCr, NH4+-N, TN and TP were 87.63%±5.95%, 91.94%±8.80%, 32.38%±11.6%, and 85.69%±13.82%, respectively. At the same time, the microbial communities in the sludge of different phases were investigated. At the phylum level, Bacteroidetes, Proteobacteria and Chlorobia were found to be the main taxa in the reactor, and Bacteroidetes were the dominant phylum responsible for the SA degradation. At the family level, it was found that the microbial communities were dominated by Chitinophagaceae, Saprospiraceae, Rhodocyclaceae, Comamonadaceae and Beijerinckiaceae, and Chitinophagaceae became more dominant during long-term operation. The results showed that the good removal efficiency of SA, CODCr, NH4+-N and TP was achieved, and Bacteroidetes and Chitinophagaceae were the dominant phyla and families for the SA degradation, respectively.

sulfanilic acid; membrane bioreactor; microbial communities

2017-01-16

：2017-05-25

國家自然科學基金項目(51422811)

閆凱麗(1992-)，女，河南林州人，kailiyan@163.com.

*責任作者，王志偉(1980-)，男，河南商丘人，教授，博士，博導，主要從事污水處理與資源化研究，zwwang@#edu.cn

X788

：1001- 6929(2017)09- 1433- 07

ADOI：10.13198/j.issn.1001- 6929.2017.02.76

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