土壤中多環(huán)芳烴微生物降解能力模擬

程曉暄, 劉 昱, 張枝煥*, 蔡 婷, 王 珂, 丁 玥

1.中國石油大學(xué)(北京)地球科學(xué)學(xué)院， 北京 102249 2.油氣資源與探測國家重點實驗室， 北京 102249

土壤中多環(huán)芳烴微生物降解能力模擬

程曉暄1,2, 劉 昱1,2, 張枝煥1,2*, 蔡 婷1,2, 王 珂1,2, 丁 玥1,2

1.中國石油大學(xué)(北京)地球科學(xué)學(xué)院， 北京 102249 2.油氣資源與探測國家重點實驗室， 北京 102249

為了揭示微生物菌種(組合)對土壤中PAHs(多環(huán)芳烴)降解率的影響以及不同類型PAHs抗微生物降解能力的差異，分析了北京市6個不同環(huán)境功能區(qū)土壤中微生物種類及其分布特征，從中篩選出部分微生物菌種對典型PAHs和原油進行降解模擬試驗，對比分析微生物對不同PAHs降解能力的差異. 結(jié)果表明：①不同菌種組合對PAHs的降解能力存在明顯差異，與假單胞菌屬、無色桿菌、短穩(wěn)桿菌混合菌相比，假單胞菌屬、無色桿菌、短穩(wěn)桿菌和微桿菌混合菌對PAHs的降解率高0.6%～4.5%；②在相同降解條件下，不同PAHs的降解率存在明顯差異，在單體培養(yǎng)基中，LMW PAHs(低環(huán)數(shù)PAHs)的降解率在25.3%以上，而HMW PAHs(高環(huán)數(shù)PAHs)的降解率都小于20.1%；③在單體培養(yǎng)基與混合培養(yǎng)基中PAHs的降解能力也存在一定差別，單體培養(yǎng)基中PAHs的降解率較混合培養(yǎng)基中高4.2%～26.6%；④無論在單體培養(yǎng)基中，還是混合培養(yǎng)基中這些化合物的降解率均存在隨著降解時間的增加而增大的現(xiàn)象；⑤在原油培養(yǎng)基中不同PAHs的降解率更為復(fù)雜，并且出現(xiàn)了中低分子量PAHs降解率隨降解時間增加反而降低的假象，這可能是由于隨著時間增加，微生物對PAHs的降解能力加強，原油中含烷基的PAHs基團降解或HMW PAHs被微生物降解產(chǎn)生LMW PAHs中間產(chǎn)物造成. 研究顯示，假單胞菌屬、無色桿菌、短穩(wěn)桿菌和微桿菌對HMW PAHs 和LMW PAHs 均有明顯的降解效果，但不同PAHs的降解率存在明顯的差異，即使是同一單體化合物，在單體培養(yǎng)基、混合培養(yǎng)基和原油培養(yǎng)基三種不同的降解條件下，其降解率也具有不同程度的差別.

土壤； 多環(huán)芳烴； 混合菌群； 微生物降解； 模擬試驗

PAHs(多環(huán)芳烴)是土壤中主要有機污染物之一. Wild等[1]認為，在英國，環(huán)境中90%的PAHs主要存在于土壤中. 有機污染物進入土壤后會經(jīng)歷復(fù)雜的地球化學(xué)變化，但大部分會殘留在土壤中或向土壤更深部遷移，導(dǎo)致土壤、地下水污染，尤其是一些難降解的有機污染物可能在土壤中長期積累，表現(xiàn)出明顯的生態(tài)效應(yīng)和環(huán)境效應(yīng)，這將會危及土壤生態(tài)系統(tǒng)的正常結(jié)構(gòu)、功能與平衡[2]. 土壤中PAHs有較高的穩(wěn)定性，而PAHs的穩(wěn)定性又受到苯環(huán)排列方式的影響，非線性排列比線性排列更穩(wěn)定[3]. 除此之外，土壤中PAHs的降解速度還取決于PAHs的結(jié)構(gòu)、物化特性以及土壤組成與結(jié)構(gòu)，分子結(jié)構(gòu)中苯環(huán)數(shù)目越多越不易降解[4- 5]，高分子量的PAHs主要是通過共代謝作用去除的[6]. 有研究表明，在含有14種PAHs處于飽和狀態(tài)的土壤中，揮發(fā)作用對土壤PAHs的影響可忽略不計，而且非生物作用只對4環(huán)及4環(huán)以下的PAHs有影響[7- 8]，所以，土壤中PAHs去除的主要機制是生物降解. 據(jù)文獻報道，目前在土壤中發(fā)現(xiàn)了70多屬、200余種能夠降解烴類的微生物[9]，其中在環(huán)境中發(fā)揮著主要貢獻的是細菌[10]. 即使是同種菌屬，對不同的PAHs降解率也不同，對于同種PAHs，用不同的菌降解，其降解率也不同[11]，這可能是受環(huán)境因素對微生物代謝的影響，如底物以及底物濃度不同[12]、其他PAHs或降解產(chǎn)物的毒性作用[13- 14]、底物之間的競爭、PAHs濃度低以至于不能誘導(dǎo)產(chǎn)生裂解酶等[15].

目前對于生物降解PAHs的研究主要集中在單體PAHs的生物降解方面，然而受污染土壤中PAHs的組合和比例的多樣性使得不同PAHs之間的相互影響以及生物降解PAHs的差異性研究至關(guān)緊要[16]，并且PAHs抗生物降解的差異性很有可能會導(dǎo)致土壤中PAHs源解析參數(shù)的變化，這對于提高土壤中PAHs降解率和選擇有效的PAHs源解析參數(shù)都具有重要意義. 因此，該試驗主要在已有研究基礎(chǔ)上，通過微生物降解模擬試驗，對比分析不同菌種組合對PAHs的降解率，以及不同PAHs單體之間抗微生物降解能力的差異，以期為進一步探討微生物降解對土壤中PAHs分子標志物源解析參數(shù)有效性的影響、合理開展土壤中PAHs污染源研究提供參考，同時為PAHs污染土壤的微生物修復(fù)提供參考.

1 材料與方法

1.1樣品采集

微生物降解污染物往往需要一定的適應(yīng)時間[17]. WANG等[18]研究表明，未被污染的土壤中微生物降解PAHs的能力遠不如受PAHs污染的土壤強. 所以，該試驗根據(jù)北京地區(qū)土壤污染狀況及土壤中w(PAHs)的高低[19- 20]，在w(PAHs)較高的地區(qū)選取5個采樣點，用梅花采樣法采集5～10 cm的表層土樣，各子樣質(zhì)量為300 g左右，將20 g左右放在錫箔紙里用來篩菌. 采樣點位置及土壤基本特征如表1所示.

1.2菌種的篩選

1.2.1培養(yǎng)基的選擇及制備

無機鹽培養(yǎng)基：1 L蒸餾水中加入NaNO31.5 g，CaCl2(無水)0.002 g，NaCl 5 g，(NH4)2SO41.5 g，K2HPO41 g，F(xiàn)eSO40.01 g，KCl 0.5 g，MgSO40.5 g. 原油培養(yǎng)基：無機鹽培養(yǎng)基中加入0.5 g原油. 降解培養(yǎng)基的制備：無機鹽培養(yǎng)基中加入待降解的PAHs.

1.2.2菌種的馴化

菌種的馴化過程采用定時碳源濃度逐步提高的方法：①分別稱取6個不同采樣點的土壤樣品5 g，放入盛有45 mL無菌水并帶有玻璃珠的錐形瓶中，振蕩20 min，使土樣與水充分混合，②取出10%的土壤混合液放入盛有0.5 g原油的馴化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1周后再取出10%的培養(yǎng)液加入盛有1 g原油的馴化培養(yǎng)基中，如此循環(huán)，馴化培養(yǎng)3周. 馴化培養(yǎng)基濃度設(shè)計見表2. 搖床轉(zhuǎn)速為170 r/min，培養(yǎng)溫度為28 ℃，最后一周取出馴化培養(yǎng)液用于菌種的篩選.

1.2.3菌種的篩選及鑒定方法

用涂布平板法和平板劃線法分離和純化優(yōu)勢菌[21]. 通過革蘭氏染色確定細菌的陰陽性，對其分別進行DNA分離、提取，提取的DNA送至上海生物工程股份有限公司進行檢測，鑒定菌種. 通過表3中第7組、第8組、第9組試驗結(jié)果來篩選高效降解混合菌，再用所確定的高效混合菌進行降解試驗.

表1 采樣點地理位置及周圍環(huán)境特征

表2 馴化培養(yǎng)基中原油質(zhì)量分布

表3 微生物降解模擬試驗設(shè)計

1.3微生物降解試驗方案

該試驗主要通過微生物降解PAHs來測定降解前后ρ(PAHs)是否發(fā)生變化，從而判斷在不同模擬試驗條件下微生物是否能夠有效降解PAHs. 降解試驗方案見表3，每一組降解試驗都設(shè)置了對照，主要是為了去除非微生物降解的誤差，如吸附、光解、揮發(fā)等[22- 23].

1.4樣品分析及質(zhì)量保證

1.4.1樣品前處理

1.4.1.1培養(yǎng)基中降解產(chǎn)物的液-液萃取

1.4.1.2降解后原油中可溶有機質(zhì)的分離

降解原油萃取后，稱取0.02～0.05 g到50 mL具塞錐形瓶中，加入5 mL石油醚稀釋，經(jīng)3次超聲波萃取后，靜置12 h，沉淀瀝青質(zhì). 將短頸漏斗用鑷子塞上脫脂棉過濾瀝青質(zhì)，用恒重瓶承接濾液，以石油醚3次沖洗漏斗及脫脂棉，待瀝青“A”沖洗干凈后，用二氯甲烷沖洗脫脂棉多次至無色，同時更換稱量瓶，以承接瀝青質(zhì). 瀝青“A”為飽和烴、芳烴和非烴組分的混合液，待層析柱分離. 分離前先用正己烷沉淀瀝青質(zhì)，再分別采用石油醚、V(二氯甲烷)∶V(石油醚)=2∶1的混合溶劑及甲醇依次通過硅膠/氧化鋁層析柱洗脫飽和烴、芳烴和非烴. 芳烴淋出液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至1 mL，加入10 mL二氯甲烷，再次濃縮至1～2 mL以轉(zhuǎn)換溶劑，用二氯甲烷定量轉(zhuǎn)移至5 mL 樣品瓶中，在高純氮氣流中吹蒸定容至200 μL后待測.

1.4.2降解試驗產(chǎn)物分析

用GC-MS(氣相色譜-質(zhì)譜)對PAHs進行定量定性分析，用含菌種的培養(yǎng)基中的降解率減去對照樣品的降解率得到微生物降解率.

GC-MS分析采用Agilent 6890/5975氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀. 化合物檢測條件：①色譜條件，HP- 5 MS彈性石英毛細柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)作為色譜柱，99.999%氦氣作為載氣，流速調(diào)至1 mL/min，進樣口溫度為300 ℃，采用不分流進樣；升溫程序，初溫設(shè)為80 ℃，保持1 min后，以3 ℃/min的速度升至310 ℃，保持16 min，至樣品完全流出色譜柱. ②質(zhì)譜條件，EI電流源70 eV，倍增器電壓2 400 V，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，氣相與質(zhì)譜的傳輸線溫度為280 ℃，采用全掃描和選擇離子同時采集數(shù)據(jù)方式.

1.4.3定量方法與回收率控制

采用內(nèi)外標結(jié)合法對土壤中PAHs進行定量. 把16種PAHs標準物質(zhì)和四種回收率指示劑配制成五種不同的質(zhì)量濃度，再分別加入定量內(nèi)標進行GC-MS 分析. GC-MS分析得到的部分標準物質(zhì)在五個不同質(zhì)量濃度下的回歸曲線呈線性關(guān)系，各標準物質(zhì)的回歸系數(shù)(R)的分布范圍為 0.912 1～0.999 7，平均值為 0.987 1，表明以此標準所求的數(shù)據(jù)可信度較高.

根據(jù)GC-MS測得四種回收率指示劑的峰面積及氘代三聯(lián)苯的峰面積和質(zhì)量，代入回歸方程，計算得到回收率指示劑的質(zhì)量. 所得質(zhì)量與樣品預(yù)處理之前的質(zhì)量之比即為回收率. 該試驗對每個樣品中均加入回收率指示劑來反映每組樣品不同的回收率. 每個樣品除以對應(yīng)的回收率，便可得到較為準確的質(zhì)量.

2 結(jié)果與討論

2.1高效降解菌的確定

根據(jù)測序菌株在GeneBank中比對結(jié)果，選取每個采樣點不同菌屬(見表4)，共有15個菌種，包括假單胞菌屬、無色桿菌和微桿菌三種，其中假單胞菌屬在昌平采樣點的樣品中被篩選出，無色桿菌在房山、宣武區(qū)樣品中均被篩選出，微桿菌在宣武區(qū)、順義區(qū)、電鍍廠的樣品中也均被篩選出，這些菌的篩選具有隨機性，說明其在土壤中具有普遍性. 短穩(wěn)桿菌通過中國科技自然共享網(wǎng)購自新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，菌種的分離基物為泥土.

由表5可知，較短穩(wěn)桿菌、無色桿菌及假單胞菌混合菌對16種PAHs的降解效果優(yōu)于假單胞菌單菌屬，故選用這三種菌混合菌用于降解試驗. 但微桿菌單菌屬降解萘、菲、蒽和芘混合液的降解率高于微桿菌、纖維化纖維菌、螯球菌屬和鞘脂菌屬混合菌. 可見，不同的菌屬混合在一起對降解效果可能有促進作用，也可能有抑制作用. 所以，對短穩(wěn)桿菌、無色桿菌、假單胞菌和微桿菌四種菌混合后的降解情況需要進一步確定.

表4 采樣點所篩選菌種名稱

表5 高效菌的降解情況

2.216種PAHs在不同條件下的降解率

2.2.1單體培養(yǎng)基中部分中低分子量PAHs微生物降解作用下隨時間的變化特征

圖1 單體培養(yǎng)基中PAHs降解率隨降解時間的變化特征Fig.1 Degradation characteristics of PAHs in single medium with time

圖2 混合培養(yǎng)基中PAHs降解率隨降解時間的變化特征Fig.2 Degradation characteristics of PAHs in combined medium with time

2.2.2混合培養(yǎng)基中部分中低分子量PAHs在微生物降解作用下隨時間的變化特征

采用四種混合菌對含16種PAHs為碳源和能源的培養(yǎng)基進行降解試驗，結(jié)果如圖2所示. 由圖2可見，菲、熒蒽、芘的降解率隨時間的增加逐漸增大，降解時間為28 d時，這三種化合物的微生物降解率分別為20%、15%和13%，而蒽的降解率先降低后升高，降解時間為28 d時生物降解率為9%，這可能是由于熒蒽和芘或其他更高環(huán)數(shù)的PAHs降解的中間產(chǎn)物通過一系列的反應(yīng)生成了蒽，使得在降解時間為1～5 d時培養(yǎng)液中蒽的濃度有所升高. 并且，HMW PAHs具有較高的生物毒性，對微生物活性有抑制作用，使得微生物對蒽的降解能力降低了，而低分子量的蒽溶解度高更易誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生PAHs降解酶，也可作為碳源和能源促進HMW PAHs的降解，所以在此降解時間內(nèi)熒蒽和芘的降解率反而比蒽更高[31].

2.2.3原油培養(yǎng)基中部分中低分子量PAHs在微生物降解作用下隨時間的變化特征

圖3 原油培養(yǎng)基中PAHs的降解率隨降解時間的變化特征Fig.3 Degradation characteristics of PAHs in oil medium with time

2.2.4其余PAHs在微生物降解作用下隨時間的變化特征

2.2.4.1混合培養(yǎng)基

采用四種混合菌對以16種PAHs底物為碳源的培養(yǎng)基進行降解試驗. 通過28 d降解試驗結(jié)果表明，2環(huán)的萘和3環(huán)的苊烯、苊的自然降解率(加入混合菌后的降解率)和對照降解率都接近100%(見圖4)，所以由自然降解率扣除對照之后的微生物降解率幾乎都為零. 這可能主要是由于萃取過程中這些PAHs的揮發(fā)造成的(LMW PAHs揮發(fā)性較大)[33]，因此檢測結(jié)果不能很好地反映真實情況. 苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、苯并[a]芘、二苯并[a,h]蒽、茚并[1,2,3-cd]芘、苯并[g,h,i]苝等高環(huán)數(shù)化合物，在混合培養(yǎng)基中的最大降解率分別為7.41%、6.92%、8.16%、9.72%、4.04%、5.67%.

圖4 混合培養(yǎng)基中PAHs的自然降解率和對照降解率對比Fig.4 Comparation of PAHs′ degradation rate between natural group and blank group in combined medium

2.2.4.2原油培養(yǎng)基

圖5 原油培養(yǎng)基中PAHs的自然降解率和對照降解率對比Fig.5 Comparation of d PAHs′ egradation rate between natural group and blank group in oil medium

圖6 原油培養(yǎng)基中PAHs的降解率隨降解時間的變化特征Fig.6 Degradation characteristics of PAHs in oil medium with time

采用四種混合菌對以原油為底物和碳源的培養(yǎng)基進行降解試驗. 結(jié)果表明，原油中檢測到的萘、苊烯、苊、芴、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、苯并[a]芘的最大微生物降解率分別是20.6%、13.0%、31.7%、23.2%、23.2%、22.9%、23.8%(見圖5). 原油培養(yǎng)基中PAHs的降解率隨降解時間的變化特征如圖6所示，苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、苯并[a]芘等高環(huán)的PAHs的降解率呈現(xiàn)出隨降解時間的增加上升的趨勢，但低環(huán)的PAHs，如萘、苊烯、苊、芴的微生物降解率隨降解時間的增加降解率都呈現(xiàn)上下波動的變化趨勢，在降解時間為1～3 d時，PAHs的降解率都隨降解時間的增加而不斷上升，這說明在降解初期，降解菌能有效利用這幾種PAHs，而降解3 d后低環(huán)的PAHs降解率呈現(xiàn)上下波動的變化趨勢，其原因除了對照試驗對低環(huán)數(shù)的PAHs的影響較大之外，也進一步說明了在降解過程中高環(huán)數(shù)的PAHs可能會降解生成了低環(huán)數(shù)的PAHs，而在降解7 d之后，苯并[k]熒蒽的降解率出現(xiàn)了降低的趨勢，這可能是原油中其他高環(huán)數(shù)的芳烴化合物及PAHs的烷基取代物降解生成苯并[k]熒蒽導(dǎo)致的.

3 結(jié)論

a) 土壤稀釋液培養(yǎng)的混合菌屬經(jīng)多次劃線分離后菌種鑒定，得到15種不同細菌，不同的微生物菌群對PAHs的降解能力存在明顯差別，其中假單胞菌屬、無色桿菌、短穩(wěn)桿菌和微桿菌4種菌屬對土壤中不同組成的PAHs均有較高的降解率.

c) 在原油培養(yǎng)基與PAHs培養(yǎng)基中PAHs化合物的降解能力存在比較明顯的差別. 在原油培養(yǎng)基中，不同PAHs的降解特征比較復(fù)雜，且存在隨降解時間增長，中低分子量PAHs降解率降低的現(xiàn)象. 這可能是由于在降解過程中，微生物對高環(huán)數(shù)PAHs的降解能力增強，以及原油中的烷基PAHs的降解或高環(huán)數(shù)PAHs被微生物降解所產(chǎn)生的復(fù)雜的降解中間產(chǎn)物所致.

d) 28 d的降解試驗結(jié)果表明，在混合培養(yǎng)基中，苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、苯并[a]芘、二苯并[a,h]蒽、茚并[1,2,3-cd]芘、苯并[g,h,i]苝等HMW-PAHs的最大降解率分別是7.41%、6.92%、8.16%、9.72%、4.04%、5.67%，其降解規(guī)律不明顯. 在原油培養(yǎng)基中，苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、苯并[a]芘的降解率呈現(xiàn)出隨降解時間的增加不斷上升的趨勢.

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Laboratory Simulation of Microbial Degradation Ability for Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Soil

CHENG Xiaoxuan1,2, LIU Yu1,2, ZHANG Zhihuan1,2*, CAI Ting1,2, WANG Ke1,2, DING Yue1,2

1.College of Geosciences, China University of Petroleum (Beijing), Beijing 102249, China 2.State Key Laboratory of Petroleum Resource and Prospecting, Beijing 102249, China

In order to reveal and understand microbial degradation efficiency for polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in soil, microbial species and distribution characteristics were evaluated for six different environmental functional soils in Beijing. Several microbial strains were screened to simulate PAHs and crude oil degradation experiments and discuss the difference in microbial degredation ability for PAHs. The results showed that there were obvious differences in the ability of microbial degradation between different combinations of microbial strains. Bacteria consortium ofPseudomonassp.,Achromobactersp.,Empedobactersp. andMicrobacteriumshowed a higher efficiency in degradation for PAHs than bacteria consortium ofPseudomonassp.,Achromobactersp. andEmpedobactersp.. Under the same degradation conditions, the degradation efficiency for different PAHs monomer compounds were obviously different; in the single medium, the degradation rate for low-molecular weight (LMW) PAHs was bigger than 25.3%, but the degradation rate for high-molecular weight (HMW) PAHs was less than 20.1%. Degradation ability differences between single medium and mixed medium were also observed; the degradation rate of PAHs in the single medium was 4.2%- 26.6% higher than that in the mixed medium. It is a common phenomenon that the degradation rate increases with degradation time in the single and mixed medium. Significant differences in degradation ability between crude oil medium and PAHs medium could be obtained for PAHs monomer compounds in the oil medium, indicating the degradation efficiency is much more complicated, including because of the longer degradation time and the lower degradation ratio of middle and low molecular weight PAHs. The degradation ability of HMW PAHs increased with the degradation time, and the LMW PAHs formed as an intermediate produced by the PAHs with alkyl groups or HMW PAHs. The results revealed that LMW PAHs and HMW PAHs can be effectively degraded byPeudomonassp.,Achromobactersp.,Empedobactersp. andMicrobacteriumwith different degradation efficiency. Even for the same PAHs monomer compound in the single medium, mixed medium or the crude oil medium, the degradation efficiency differs.

soil; polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs); bacteria consortium; microbial degradation; simulated experiment

2017-01-17

：2017-05-27

國家自然科學(xué)基金面上項目(41373126)

程曉暄(1992-)，女，安徽安慶人，jychengxiaoxuan@163.com.

*責(zé)任作者，張枝煥(1962-)，男，福建屏南人，教授，博士，博導(dǎo)，主要從事環(huán)境地球化學(xué)與油藏地球化學(xué)研究，zhangzh3996@vip.163.com

X5

：1001- 6929(2017)09- 1373- 09

ADOI：10.13198/j.issn.1001- 6929.2017.02.82

程曉暄,劉昱,張枝煥,等.土壤中多環(huán)芳烴微生物降解能力模擬[J].環(huán)境科學(xué)研究,2017,30(9):1373- 1381.

CHENG Xiaoxuan,LIU Yu,ZHANG Zhihuan,etal.Laboratory simulation of microbial degradation ability for polycyclic aromatic hydrocarbons in soil[J].Research of Environmental Sciences,2017,30(9):1373- 1381.