溫肺降濁方對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

吳 林 唐 農(nóng) 麻小梅 陳 煒 鄭福奎 趙海濤 白碩宇 曾冬娟 楊惠丹 鄧 燕

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001)

溫肺降濁方對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

吳 林 唐 農(nóng) 麻小梅 陳 煒1鄭福奎1趙海濤 白碩宇 曾冬娟 楊惠丹 鄧 燕

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001)

目的研究溫肺降濁方對(duì)血管性癡呆(VD)大鼠學(xué)習(xí)記憶及Caspase-3蛋白表達(dá)的影響。方法雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎法制做VD模型大鼠，將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組，低、中、高劑量溫肺降濁方組及石杉?jí)A甲組，另設(shè)假手術(shù)組。灌胃給予相應(yīng)藥物治療，連續(xù)給藥30 d后，用Morris水迷宮檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶能力，HE染色觀察大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的改變，Western印跡檢測(cè)海馬組織Caspase-3的表達(dá)。結(jié)果Morris水迷宮檢測(cè)結(jié)果，溫肺降濁方各組平均逃避潛伏期明顯低于模型組(P<0.01)，找到平臺(tái)的次數(shù)較模型組明顯增多(P<0.01)。HE染色結(jié)果表明，溫肺降濁方各組能夠不同程度地改善海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)異常。Western印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，溫肺降濁方各組大鼠海馬組織Caspase-3的表達(dá)明顯低于模型組(P<0.01)。結(jié)論溫肺降濁方可通過抑制Caspase-3的表達(dá)，改善VD大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)異常，從而改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

溫肺降濁方；血管性癡呆；學(xué)習(xí)記憶；Caspase-3

目前血管性癡呆(VD)的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，在發(fā)達(dá)國(guó)家中VD占全部癡呆患者的25%～50%，成為導(dǎo)致癡呆的第二大原因〔1〕。Caspase-3作為Caspase家族中的一員，是凋亡的關(guān)鍵酶，在細(xì)胞凋亡過程中處于核心位置，它最終使細(xì)胞凋亡能夠精確、完整的實(shí)施，而海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的大量凋亡丟失，可引起學(xué)習(xí)記憶障礙，導(dǎo)致VD。本實(shí)驗(yàn)擬觀察溫肺降濁方對(duì)VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)、Caspase-3蛋白表達(dá)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物、設(shè)備及試劑 3月齡，健康雄性SPF級(jí)SD大鼠120只，體重(200±50)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(許可證號(hào)：SCXK桂2009-0002)。由成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)的WMT-100型Morris水迷宮設(shè)備全套，德國(guó)萊卡生產(chǎn)的RM2015型全自動(dòng)石蠟切片機(jī)，日本奧林巴斯公司生產(chǎn)的CX-31型電子顯微鏡，美國(guó)Media Cybernetics公司生產(chǎn)的多功能圖像分析管理系統(tǒng)，美國(guó)Thermo公司生產(chǎn)的CA91786型 UVP凝膠成像系統(tǒng)，蘇木素(北京中杉金橋公司生產(chǎn)，批號(hào)：ZLI-9608)，伊紅(北京中杉金橋公司生產(chǎn)，批號(hào)：ZLI-9612)，Caspase-3抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司生產(chǎn)，批號(hào)：9665S)。溫肺降濁方，由制附子20 g，黨參15 g，炙甘草10 g，干姜10 g，酒大黃10 g，田七10 g共6味中藥組成，由我院藥劑科統(tǒng)一采購(gòu)，同比轉(zhuǎn)為中藥免煎顆粒劑(由江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)：1406033)的用量，灌胃時(shí)給予溫肺降濁方免煎顆粒劑。石杉?jí)A甲片(浙江震元制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：H20033718)。頭孢羥氨芐甲氧芐啶膠囊(哈藥集團(tuán)三精制藥諾捷有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)：H20056737)，用于造模術(shù)后預(yù)防感染。

1.2VD模型制備 隨機(jī)從合格的大鼠抽出16只作為假手術(shù)組，其余104只大鼠進(jìn)行VD模型大鼠的制備。參照Ni等〔2〕的雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎(2-VO)法將大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈用4-0無(wú)菌蠶絲線永久性結(jié)扎制作VD動(dòng)物模型。假手術(shù)組腹腔注射麻醉后行分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈手術(shù)操作，但不結(jié)扎，其余操作及術(shù)后處理與模型組相同，以減少手術(shù)造成的誤差。

1.3Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 定位航行實(shí)驗(yàn)：設(shè)計(jì)大鼠進(jìn)駐平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期時(shí)間)為60s，然后將各組大鼠按第1、2、3、4象限的順序，將大鼠面向池壁(大鼠頭部向上，以防溺水)依次放入水中，記錄其60 s內(nèi)成功進(jìn)駐平臺(tái)(大鼠找到平臺(tái)并滯留其上5 s為成功)所需時(shí)間(即逃避潛伏期)。如果大鼠在60 s內(nèi)找不到平臺(tái)，系統(tǒng)則自動(dòng)停止記錄，此時(shí)實(shí)驗(yàn)者則引導(dǎo)其到平臺(tái)的位置，讓它在平臺(tái)上停留10 s再取出來(lái)，且記錄大鼠逃避潛伏期時(shí)間為60 s。每只大鼠每天訓(xùn)練4次(上、下午各2次)，連續(xù)5 d。取第5天中4個(gè)象限逃避潛伏期時(shí)間的均數(shù)作為學(xué)習(xí)成績(jī)的檢測(cè)指標(biāo)?？臻g搜索實(shí)驗(yàn)：在完成定位航行實(shí)驗(yàn)后撤走平臺(tái)，即水迷宮實(shí)驗(yàn)第6天開始進(jìn)行空間搜索實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)間設(shè)置為60 s，將大鼠依次從4個(gè)象限放入水中，記錄所有大鼠經(jīng)過原先平臺(tái)位置的次數(shù)，測(cè)試大鼠對(duì)原平臺(tái)的記憶，取4個(gè)象限跨越平臺(tái)次數(shù)的均數(shù)作為記憶成績(jī)的檢測(cè)指標(biāo)。

1.4造模成功的判定標(biāo)準(zhǔn) 參照趙憲林等〔3〕的VD模型大鼠篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，即以假手術(shù)組大鼠逃避潛伏期時(shí)間的均值為參考值，計(jì)算模型組大鼠各鼠的平均逃避潛伏期與參考值之差占該鼠的平均逃避潛伏期時(shí)間的比例，該值>20%定為合格的VD大鼠。本次實(shí)驗(yàn)中104只大鼠經(jīng)2-VO法造模后有82只大鼠存活，此82只大鼠經(jīng)過篩選后，結(jié)果有75只大鼠為合格的VD模型大鼠。

1.5實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表，將合格的75只VD模型大鼠隨機(jī)分到5個(gè)組，即模型組15只，低劑量溫肺降濁方組15只，中劑量溫肺降濁方組15只，高劑量溫肺降濁方組15只，石杉?jí)A甲組15只。

1.6灌胃給藥 于造模后第15天開始灌胃給藥，大鼠灌胃藥物劑量的換算方法，均按人與大鼠體表面積系數(shù)比確定。給藥劑量以臨床人用藥等效劑量作為中劑量，低、中、高劑量溫肺降濁方組給藥劑量分別為3.75、7.50、15.0 g·kg-1·d-1，石杉?jí)A甲組給藥劑量為0.15 mg·kg-1·d-1。灌胃濃度每天按1 ml/100 g大鼠體重進(jìn)行。其中假手術(shù)組及模型組均予相應(yīng)體積的雙蒸水灌胃。所有大鼠灌胃給藥均為1次/d，共30 d。30 d后行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化情況。

1.7HE染色 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)完畢后，每組隨機(jī)取7只大鼠進(jìn)行心臟灌注取腦，先后用0.9%生理鹽水和4%多聚甲醛進(jìn)行灌注后，取全腦組織，分別裝入有4%多聚甲醛的標(biāo)本瓶中固定，保存在4℃冰箱中，固定不少于24 h。①經(jīng)固定后的腦組織，切去嗅球及小腦，常規(guī)石蠟包埋，冠狀面連續(xù)切片，厚度約4 μm；②切片常規(guī)用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級(jí)乙醇至水洗；③蘇木素染色；④1%鹽酸酒精分化，1%氨水反藍(lán)；⑤自來(lái)水浸泡；⑥置伊紅液；⑦常規(guī)脫水，透明，封片；⑧在光學(xué)顯微鏡下，觀察每組大鼠海馬切片CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。

1.8Western印跡實(shí)驗(yàn) 用10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉大鼠后，迅速將大鼠斷頭，在冰臺(tái)上快速分離出雙側(cè)海馬組織，立即置于2 ml EP管中，放入-80℃冰箱保存。①用蛋白裂解液提取蛋白，12 000 r/min離心10 min后取上清分裝放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫每捡R斯亮藍(lán)試劑盒經(jīng)紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度；②制備SDS-PAGE凝膠；③樣品的變性及電泳，95℃變性10 min，電泳儀設(shè)置成穩(wěn)壓狀態(tài)，將電壓調(diào)至50 V使樣品通過濃縮膠與分離膠。目的條帶跑到分離膠2/3左右位置，停止電泳；④凝膠轉(zhuǎn)膜及洗膜，恒流250 mA轉(zhuǎn)膜，在含有5%的脫脂奶粉的封閉液中封閉2 h。將封閉后的膜直接放入稀釋后的一抗工作液(Caspase-3及抗β-actin的抗體)中，4℃反應(yīng)過夜。用1×PBST洗膜3次。將二抗(山羊抗兔)用1×PBST稀釋3 000倍；將洗滌后的一抗反應(yīng)膜放入二抗工作液中作用90 min。再用1×PBST洗膜3次；⑤曝光及洗片，按1∶1(v/v)混合ECL試劑盒中AB液，放入暗盒中，根據(jù)條帶的亮度選擇適當(dāng)?shù)钠毓鈺r(shí)間，經(jīng)顯影定影液顯色，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的灰度值。用所測(cè)蛋白Caspase-3的灰度值分別與內(nèi)參照β-actin的灰度值比較，所得的比值表示所測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在定位航行的第5天，模型組平均逃避潛伏期比假手術(shù)組明顯延長(zhǎng)(P<0.01)。石杉?jí)A甲組和低、中、高劑量溫肺降濁方組的平均逃避潛伏期較模型組明顯縮短(P<0.01)。低、中、高劑量溫肺降濁方組間平均逃避潛伏期有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。低、中、高劑量溫肺降濁方組與石杉?jí)A甲組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。見表1。

2.2空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果 模型組較假手術(shù)組大鼠成功找到平臺(tái)的次數(shù)明顯減少(P<0.01)。而石杉?jí)A甲組和低、中、高劑量溫肺降濁方組的平均跨越平臺(tái)次數(shù)均較模型組明顯增多(P<0.01)。高、中劑量溫肺降濁方組與低劑量溫肺降濁方組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。各藥物組以高劑量溫肺降濁方組找到平臺(tái)的次數(shù)為多。見表1。

表1 各組大鼠第5天逃避潛伏期、跨越平臺(tái)次數(shù)比較(±s)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01;與模型組比較：2)P<0.01;與石杉?jí)A甲組比較：3)P<0.01;與高劑量溫肺降濁方組比較：4)P<0.01

2.3HE染色結(jié)果 經(jīng)HE染色后，細(xì)胞質(zhì)呈淡紅色，核呈藍(lán)褐色。假手術(shù)組海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞形態(tài)完整、正常。模型組海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列不整，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞核固縮、深染。低劑量溫肺降濁方組海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列尚可，見部分細(xì)胞核固縮、深染。中劑量溫肺降濁方組海馬CA1區(qū)排列較整齊，細(xì)胞核固縮、深染現(xiàn)象較模型組、低劑量溫肺降濁方組少。高劑量溫肺降濁方組與石杉?jí)A甲組海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列整齊，密度增加，細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)元形態(tài)異常較模型組明顯減輕，以高劑量溫肺降濁方組作用最為顯著。見圖1。

2.4Western印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果 模型組(0.80±0.03)較假手術(shù)組Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加(0.14±0.02，P<0.01)。石杉?jí)A甲組(0.36±0.02)、低、中、高劑量溫肺降濁方組(0.58±0.01、0.46±0.01、0.22±0.03)與模型組比較Caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)。低、中、高劑量溫肺降濁方組三者組間Caspase-3蛋白表達(dá)比較有差異(P<0.01)；高劑量溫肺降濁方組與假手術(shù)組、石杉?jí)A甲組比較有差異(P<0.01)；各藥物組中，以高劑量溫肺降濁方組抑制Caspase-3蛋白表達(dá)的作用最為顯著。見圖2。

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)病理改變(HE，×200)

1：假手術(shù)組；2：模型組；3：低劑量溫肺降濁方組；4：中劑量溫肺降濁方組；5：高劑量溫肺降濁方組；6：石杉?jí)A甲組圖2 各組大鼠海馬組織Caspase-3蛋白的變化

3 討 論

VD發(fā)生與肺臟虛損及功能失調(diào)關(guān)系密切，若肺、腎陽(yáng)不足、肺氣虛損，無(wú)以溫養(yǎng)腦竅，升機(jī)不利則無(wú)以充養(yǎng)腦髓，則會(huì)導(dǎo)致濁毒、痰濕、瘀血等病理產(chǎn)物堆積致病，最終產(chǎn)生呆、傻、愚、笨的癡呆表現(xiàn)。

腦血管病是引發(fā)VD的主要原因，VD形成的重要因素之一即為由頸部血管逐漸狹窄引起的長(zhǎng)期慢性腦供血不足。研究表明，當(dāng)行2-VO法后，前腦組織不會(huì)造成血供的完全阻斷，而是處于缺血的狀態(tài)〔4〕。該法實(shí)質(zhì)上較好地模擬了人類因動(dòng)脈粥樣硬化及動(dòng)脈管腔狹窄等因素導(dǎo)致慢性腦血管疾病因素

引起的VD。趙憲林等〔3〕認(rèn)為該模型既可以判定藥物的效果和治療的手段，還可用于研究癡呆腦組織的形態(tài)、病理以及生理變化的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪浅晒Φ?，而在?jīng)溫肺降濁方能夠不同程度地改善VD模型大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)異常。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)?zāi)茌^真實(shí)地反映動(dòng)物學(xué)習(xí)與記憶的能力〔5〕。Morris水迷宮近年來(lái)在神經(jīng)生物學(xué)、神經(jīng)藥理學(xué)、神經(jīng)病學(xué)等領(lǐng)域上有著十分廣泛的應(yīng)用，它是國(guó)際上測(cè)定動(dòng)物空間學(xué)習(xí)及記憶能力方法的常用技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)Morris水迷宮結(jié)果顯示，模型組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯受到損害，而溫肺降濁方對(duì)VD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有改善作用，且存在一定的量效關(guān)系。

研究表明，活化后的Caspase-3還可直接誘導(dǎo)線粒體自由基的產(chǎn)生，加速線粒體的功能障礙和細(xì)胞色素C釋放，使凋亡信號(hào)不斷放大，涉及范圍不斷的擴(kuò)增，最終引起細(xì)胞凋亡〔6〕。Caspase-3處于凋亡惡性級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，是細(xì)胞凋亡的必經(jīng)之路，它的激活是細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆轉(zhuǎn)階段的重要標(biāo)志。我國(guó)科學(xué)家利用先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)證實(shí)了Caspase-3基因和凋亡的關(guān)系，Caspase-3基因被敲除后，細(xì)胞則完全喪失凋亡的能力，然而敲除其他的Caspase基因，細(xì)胞的凋亡功能并沒有完全喪失〔7〕。由此可知，Caspase-3蛋白表達(dá)與否和細(xì)胞凋亡的發(fā)生關(guān)系密切。因此，尋找切斷凋亡發(fā)生的路徑，調(diào)節(jié)相關(guān)凋亡因子的表達(dá)，阻止凋亡的發(fā)生，改善VD的學(xué)習(xí)、記憶能力，是治療VD的關(guān)鍵所在。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明溫肺降濁方可減少Caspase-3蛋白的表達(dá)，抑制神經(jīng)元凋亡。

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〔2016-05-07修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

廣西中醫(yī)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)課題(No.KJT13077)

唐 農(nóng)(1962-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事腦血管病研究。

吳 林(1970-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事腦血管病研究。

R743

A

1005-9202(2017)16-3922-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.006

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院