甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶培養(yǎng)基的雙響應面優(yōu)化

曹 紅,翁佩芳*,周小敏,高志中,吳祖芳,張 鑫

(1.寧波大學 海洋學院，應用海洋生物技術教育部重點實驗室，浙江 寧波 315211；2.浙江興業(yè)集團有限公司，浙江 舟山 316100)

甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶培養(yǎng)基的雙響應面優(yōu)化

曹 紅1,翁佩芳1*,周小敏2,高志中2,吳祖芳1,張 鑫1

(1.寧波大學 海洋學院，應用海洋生物技術教育部重點實驗室，浙江 寧波 315211；2.浙江興業(yè)集團有限公司，浙江 舟山 316100)

對甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(BacillusmethylotrophicusKC790303.1)產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基組成進行優(yōu)化，以達到菌株生長良好、蛋白酶活力提高的目的。在單因素試驗的基礎上通過雙響應面優(yōu)化確定發(fā)酵培養(yǎng)基各成分的配比。結果表明，發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及其濃度(m/V)為：葡萄糖2.95%、大豆蛋白胨1.30%和CaCl20.20%，此時菌體生長狀態(tài)良好，所產(chǎn)蛋白酶活力最終達到312.98 U/mL，較之前提高了21.5%。在搖瓶發(fā)酵條件下的培養(yǎng)基優(yōu)化研究為工業(yè)發(fā)酵放大提供理論基礎。

甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌；培養(yǎng)基；蛋白酶；雙響應面；優(yōu)化

蛋白酶是催化蛋白質(zhì)肽鍵水解的一類酶，被廣泛應用于食品加工行業(yè)中[1]。海洋源蛋白酶因其特殊結構和功能，在極端環(huán)境下仍保留較高活性和穩(wěn)定性，因此被廣泛應用到魚醬油發(fā)酵、肉類加工等領域[2-3]。因此，在食品加工行業(yè)中，經(jīng)常通過添加海洋蛋白酶改善食品的風味及營養(yǎng)價值。海洋微生物具有資源廣泛、生長周期短、耐高壓、耐高鹽等優(yōu)點，關于產(chǎn)蛋白酶海洋微生物的研究一直成為國內(nèi)外的研究熱點[4-5]。但目前市場開發(fā)的蛋白酶制劑成本較高，成為其廣泛應用的限制因素[6]。因此，高效益產(chǎn)蛋白酶海洋源微生物的開發(fā)日益?zhèn)涫荜P注。

產(chǎn)蛋白酶微生物的發(fā)酵過程中受多種因素的影響，其中培養(yǎng)基組成是最關鍵的因素之一。為提高微生物發(fā)酵產(chǎn)酶效果，研究者通常優(yōu)化微生物發(fā)酵的培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件。目前較多采用的是中心組合設計響應面優(yōu)化分析(Response Surface Methodology，RSM)，較常用的有Box-Behnken設計(Box-Behnken Design，BBD)和中心組合設計(Central Composite Design，CCD)[7-8]。雙響應面是指將包含兩個響應值的優(yōu)化方法，實際上響應值也可以多個，國內(nèi)對于雙響應面的研究較少，而國外較多學者將此方法運用到菌株的發(fā)酵優(yōu)化取得了滿意的效果[9-10]。孫曉鳴等對產(chǎn)中性蛋白酶芽孢桿菌的培養(yǎng)基進行響應面優(yōu)化，確定了培養(yǎng)基的最佳組成使其蛋白酶活力提高了42%[11]。Oskouie等對Bacillusclausii的培養(yǎng)基響應面優(yōu)化使最終產(chǎn)堿性蛋白酶活力提高了近1.5倍[12]。

甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)是一種能夠利用C—C鍵低碳化合物的微生物，廣泛存在于土壤、水、空氣以及動物腸道等處[13-14]，具有廣泛的商業(yè)價值，可以用來生產(chǎn)蛋白酶、多糖等，還可以作為抑菌劑，抵抗外界有害因子[15-17]。本文采用單因素和雙響應面優(yōu)化相結合的方法，對前期篩選出到的一株海洋來源產(chǎn)蛋白酶菌株—甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(KC790303.1)的培養(yǎng)基組成進行優(yōu)化，旨在使菌株生長狀態(tài)良好的前提下，能夠持續(xù)穩(wěn)定地產(chǎn)生具有較高酶活力的蛋白酶，為工業(yè)化應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 菌株及培養(yǎng)基

菌株：甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(BacillusmethylotrophicusKC790303.1)，本實驗室保存。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，121 ℃下滅菌15 min。

斜面保藏培養(yǎng)(g/L)：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g ，121℃下滅菌15 min。

1.1.2 主要試劑

葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、糊精、酵母浸膏、NH4Cl、NaNO3、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏、ZnSO4、CaCl2、MnCl2、KH2PO4、CuSO4、MgCl2、酪蛋白、L-酪氨酸，以上試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

QYC-2102C恒溫振蕩培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)； LV-3300分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；5804R高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；5814R小型高速離心機(德國Eppendorf公司)。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 菌株活化

挑取斜面保藏的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌，接種到50 mL基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中，放置于恒溫搖床中，30 ℃、150 r/min下活化24 h，此時的發(fā)酵液即為種子發(fā)酵液。

1.3.2 粗酶液的制備

將上述活化的種子發(fā)酵液以4%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min發(fā)酵48 h。發(fā)酵結束后的菌懸液離心(6 000 r/min，4 ℃)15 min，收集上清液即為粗酶液，每組三個平行，測定蛋白酶活力。

1.4 蛋白酶活力的測定

采用福林酚法(GB/T 23527—2009)測定蛋白酶活力。

1.5 菌株生長量測定

隨著微生物生長的進行，微生物利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，菌體不斷增加，培養(yǎng)基的狀態(tài)由澄清變?yōu)闇啙?，培養(yǎng)基的濁度與微生物的生長量呈線性正比關系，因此采用比濁法在600 nm下進行OD值的測定，反映微生物生長量[18-19]。

將發(fā)酵液在4℃，6 000 r/min條件下離心15 min，收集下層菌體，加入等體積的蒸餾水震蕩均勻，采用相同的方法處理未接種的培養(yǎng)基為空白對照，采用分光光度法測定600 nm時OD值。若菌體濃度太高可以將菌體稀釋，并保持菌體的稀釋倍數(shù)一致，一般OD值控制在0～2.5范圍內(nèi)[10,20]。

1.6 培養(yǎng)基組成的單因素優(yōu)化

1.6.1 最佳碳源的確定及其濃度對菌株發(fā)酵的影響

選擇葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、糊精和酵母浸膏六種不同類型的碳源，以1%(m/V，下同)添加量添加到基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中，不改變培養(yǎng)基其他成分，以基礎發(fā)酵培養(yǎng)基為空白對照，發(fā)酵結束后，測定菌株生長量和粗酶液酶活力，單因素選擇最佳碳源。

選擇最佳碳源濃度為0.50%、1.00%、1.50%、2.00%、2.50%、3.00%、3.50%、4.00%，同樣的條件下發(fā)酵培養(yǎng)，每組三個平行，測定菌株生長量和粗酶液酶活力，選出最佳碳源濃度。

1.6.2 最佳氮源的確定及其濃度對菌株發(fā)酵的影響

選擇NH4Cl、NaNO3、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨和牛肉膏六種不同類型的氮源，無機氮源和有機氮源分別以2%、1%(m/V)添加量添加到基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中，不改變培養(yǎng)基其他成分，以基礎發(fā)酵培養(yǎng)基為空白對照，發(fā)酵結束后，測定菌株生長量和粗酶液酶活力，單因素選擇最佳碳源。

選擇最佳氮源濃度為0.50%、1.00%、1.50%、2.00%、2.50%、3.00%、3.50%、4.00%，同樣的條件下發(fā)酵培養(yǎng)，每組三個平行，測定菌株生長量和粗酶液酶活力，選出最佳氮源濃度。

1.6.3 最佳無機鹽及其濃度對菌株發(fā)酵影響

分別以ZnSO4、CaCl2、MnCl2、 MgCl2、CuSO4和KH2PO4為發(fā)酵培養(yǎng)基的唯一無機鹽，添加量為0.01%，不改變培養(yǎng)基其他組分和發(fā)酵條件，以基礎發(fā)酵培養(yǎng)基為空白對照，發(fā)酵結束后，測定菌株生長量和粗酶液酶活力，單因素選擇最佳無機鹽。

選擇最佳無機鹽濃度為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%，同樣的條件下發(fā)酵培養(yǎng)，每組三個平行，測定菌株生長量和粗酶液酶活力，選出最佳無機鹽濃度。

1.7 培養(yǎng)基組成的雙響應面優(yōu)化

1.7.1 響應面優(yōu)化試驗設計

在單因素試驗基礎上，依據(jù)Box-Behnken響應曲面法(BBD)進行分析。以最優(yōu)碳源、氮源、無機鹽為自變量，菌株生長量和粗酶液酶活力為響應值。實驗結果利用統(tǒng)計軟件Design-Expert 8.0.5進行數(shù)據(jù)分析。所有實驗值都是三次實驗的平均值，數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示[21-22]。

1.7.2 驗證試驗

對于擬合模型是否顯著，需追加試驗進行驗證，即按照理論中的最佳配方進行試驗，并分析實際值與預測值間的相關性，最終確定優(yōu)化的結果。

1.8 搖瓶發(fā)酵曲線的測定

種子液以4%的添加量接種在優(yōu)化后的液體培養(yǎng)基中，空白培養(yǎng)基對照，重復實驗3次，以2 h為一個間隔，取發(fā)酵液5 mL迅速測定菌株生長量和產(chǎn)蛋白酶能力[23]。

2 結果與分析

2.1 單因素優(yōu)化培養(yǎng)基組成

2.1.1 最佳碳源的確定及其濃度對發(fā)酵的影響

碳源是微生物正常生長不可缺少的主要營養(yǎng)成分之一，在微生物生長代謝過程中不僅為細胞提供基本的物質(zhì)基礎，參與細胞結構的組成，又是提供微生物生命活動中所需能源的原料[24]。選擇6種不同的碳源，探究碳源種類對菌株發(fā)酵結果的影響，實驗結果如圖1所示。由圖1可知該菌株的最佳碳源為葡萄糖，菌株生長量和酶活力均達到最高，其次為蔗糖和酵母浸膏，糊精最低，因此選擇葡萄糖為最佳碳源。曹龍奎等對枯草芽孢桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶培養(yǎng)基的優(yōu)化中也發(fā)現(xiàn)其最佳碳源為葡萄糖[20]，與報道結果一致。這是因為葡萄糖作為碳源時可被菌體直接利用，而其它碳源需要被分解為單糖時才能利用。

圖1 碳源種類對菌株發(fā)酵影響

通過添加不同濃度的葡萄糖，不改變其他條件，測定菌株生長量和蛋白酶酶活力，結果如圖2所示。從圖2中可以看出菌株生長量和粗酶液酶活力隨葡萄糖濃度的變化有顯著變化，葡萄糖濃度過低或過高，菌體生長緩慢，其產(chǎn)蛋白酶活力也較低。當葡萄糖添加量為2.50%時菌體生長量達到最高，當葡萄糖添加量為3.00%時產(chǎn)蛋白酶活力最高，且菌體生長趨于穩(wěn)定。綜合考慮均菌株生長量和其粗酶液酶活力這兩個指標，最終確定葡萄糖的最佳添加量為3.00%。研究表明，葡萄糖作為最簡單的單糖，適宜濃度的葡萄糖很容易被菌體快速吸收利用，但當葡萄糖濃度過高時會抑制蛋白酶產(chǎn)生[25-26]。

圖2 葡萄糖濃度對菌株發(fā)酵的影響

2.1.2 氮源種類及濃度對菌株發(fā)酵影響

氮源也是微生物正常生長過程中十分重要的營養(yǎng)來源，可以用來合成菌體生長代謝過程中的代謝中間產(chǎn)物，例如核苷酸、氨基酸等。固定其他培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件，加入有機氮源或無機氮源，測定菌體生長量和產(chǎn)蛋白酶活力，結果如圖3所示。由圖3可知該菌株的最佳氮源為大豆蛋白胨，菌株生長量和酶活力均達到最高，其他的氮源的效果較差，因此選擇大豆蛋白胨為最佳氮源。這與曹龍奎等研究枯草芽孢桿菌生長培養(yǎng)基的優(yōu)化中發(fā)現(xiàn)的當大豆蛋白胨為氮源時，其產(chǎn)堿性蛋白酶活力最高結果一致[20]。研究報道指出，有機氮營養(yǎng)豐富，更適合于芽孢桿菌的產(chǎn)酶，因無機氮源被快速代謝利用，抑制蛋白酶的合成[27]。

圖3 氮源種類對菌株發(fā)酵的影響

不改變其他條件的前提下，向培養(yǎng)基中添加不同濃度的大豆蛋白胨，再次測定菌株生長量和其產(chǎn)蛋白酶能力，結果如圖4所示。當大豆蛋白添加量為1.50%時，蛋白酶活力達到最高，菌體生長量也較高。氮源是產(chǎn)蛋白酶菌株的關鍵限制因素，適宜的氮源濃度對蛋白酶的產(chǎn)生很重要，氮源濃度過低，菌體生長緩慢，不能滿足蛋白酶合成的需求；氮源濃度過高，雖然利于菌體生長，但營養(yǎng)過于豐富，使菌體生長旺盛，需要消耗較多的能源維持生存環(huán)境，不利于蛋白酶代謝產(chǎn)物的合成，因此1.50%為大豆蛋白胨的最佳添加量。

圖4 大豆蛋白胨濃度對菌株發(fā)酵影響

2.1.3 無機鹽種類及濃度對菌株發(fā)酵影響

圖5 無機鹽種類對菌株發(fā)酵影響

不改變其他條件的情況下，添加不同濃度的CaCl2，再次測定菌株生長量及其產(chǎn)蛋白酶能力，結果如圖6所示。由圖6看出CaCl2的添加量為0.20%時，菌體生長良好，產(chǎn)蛋白酶能力最高。因此確定CaCl2的最佳濃度為0.20%。

圖6 CaCl2濃度對菌株發(fā)酵的影響

上述實驗數(shù)據(jù)表明單因素優(yōu)化后該菌株的培養(yǎng)基組成為(m/V)：葡萄糖3.00%，大豆蛋白胨1.50%和CaCl20.20%。

2.2 培養(yǎng)基組成雙響應面模型的建立及其顯著性檢驗

在單因素優(yōu)化實驗的基礎上，采用Box-Behnken(BBD)原理，通過軟件設計了3因素3水平的實驗。葡萄糖(X1)、大豆蛋白胨(X2)、CaCl2(X3)三者的濃度為實驗自變量，以菌株生長量(Y1)和酶活力(Y2)為實驗響應值，共確定了17組實驗。自變量因素編碼及水平見表1，雙響應面設計方案及實驗數(shù)據(jù)結果分析見表2。通過本實驗不僅可以使菌株達到最佳生長狀態(tài)，而且菌株所產(chǎn)蛋白酶有較高的酶活力。

表1 中心組合設計自變量因素與水平

表2 雙響應面試驗設計方案與結果

2.2.1 菌株長量的模型建立及其顯著性檢驗

利用軟件Design-Expert8.0.5對表2中的實驗數(shù)據(jù)進行擬合多元回歸分析，得到菌株生長量的帶交互項和平方項的二次多元回歸預測方程，如下所示：

Y1=1.94+0.16X1-18.18X2-0.01X3+0.14X1X2-8.33X1X3-0.011X2X3+0.098X12+0.099X22+ 0.072X32

該模型的方差分析如表3所示，由表中可以看出該模型具有非常高的F回歸值(281.70)和非常低的P值(P<0.000 1)，表明該模型是高度顯著的；而較低的F失擬值(5.35)，失擬項P=0.0695>0.05，說明失擬不顯著；RAdj2=0.927 2，說明該模型能夠較好的模擬實驗；R2=0.933 7，說明實驗值與預測值之間有著良好的相關性。該模型實驗誤差小，擬合程度良好，所以可用于對菌株生長量進行分析和預測。此外，該模型中X1、X1X2、X12、X22、X32影響極顯著。

2.2.2 菌株產(chǎn)蛋白酶活力的模型建立及其顯著性檢驗

對表2中的數(shù)據(jù)擬合二次多元回歸方程，葡萄糖、大豆蛋白胨、CaCl2濃度與菌株產(chǎn)蛋白酶活力的預測方程如下所示：

Y2=295.30+24.95X1-70.55X2-15.28X3+8.61X1X2-9.77X1X3+0.24X2X3-69.26X12-35.35X22- 52.71X32

從表3中可以看出該模型的F回歸值(4989.76)和P值(P<0.000 1)表明該模型極顯著；較小的F失擬值(3.11)，失擬項P=0.150 8>0.05，說明失擬不顯著；RAdj2=0.978 2，說明該模型能非常好的模擬實驗，能夠解釋97.82%響應值變化；R2=0.992 8，說明實驗值與預測值之間有著良好的相關性。該模型實驗誤差小，擬合程度良好，所以該模型可用于對菌株產(chǎn)蛋白酶活力進行分析和預測。此外模型中X1、X2、X3、X1X2、X1X3、X12、X22和X32影響極顯著。

2.3 菌株培養(yǎng)基組成的雙響應曲面分析及其優(yōu)化

利用軟件Design-Expert 8.0.5繪制葡萄糖濃度、大豆蛋白胨濃度、CaCl2濃度這三個因素之間的響應面分析圖和相應的等高曲線圖。在響應面分析圖中，響應曲面坡度越大，其影響也越大，響應值也越大，在等高曲線圖中，橢圓程度越高表示兩因素間的交互作用越顯著，相反，越接近于圓形表示兩因素間的交互作用越不顯著[31]。

2.3.1 菌株生長量的響應曲面分析及其優(yōu)化

由表3的數(shù)據(jù)和圖7可以看出，葡萄糖濃度和大豆蛋白胨濃度的P< 0.000 1、等高線圖為橢圓，說明兩者的交互作用顯著。葡萄糖濃度和CaCl2濃度以及大豆蛋白胨濃度和CaCl2濃度的P﹥0.05，等高線圖接近圓形，它們交互作用不顯著。此外，通過響應曲面的等高曲線預測圖可以得到菌株生長良好的培養(yǎng)基成分為：葡萄糖濃度2.94%、大豆蛋白胨濃度1.32%和CaCl2濃度0.20%，考慮到實際操作方便，最終將菌株生長的最佳培養(yǎng)基組成設定為葡萄糖、大豆蛋白胨和CaCl2的濃度分別為2.95%、1.30%和0.20%。在細菌生長過程中，碳源、氮源是培養(yǎng)基成分的關鍵因素，而無機鹽是調(diào)節(jié)細菌生長代謝的重要組成成分，因此培養(yǎng)基的組成是細菌生長的基礎。

2.3.2 菌株產(chǎn)蛋白酶活力的響應曲面分析及其優(yōu)化

由表3的數(shù)據(jù)和圖8可以看出，葡萄糖濃度和大豆蛋白胨濃度，葡萄糖濃度和CaCl2濃度的P< 0.000 1，它們的等高曲線圖為橢圓，說明它們之間的交互作用顯著。大豆蛋白胨濃度和CaCl2濃度的P﹥0.05，等高線圖接近圓形，兩者之間的交互作用不顯著。此外，通過響應曲面的等高曲線預測圖可以

表3 回歸模型的方差分析

注：**表示差異極顯著(P<0.01)。

圖7 各因素交互作用對菌株生長量的響應曲面圖和等高曲線圖

圖8 各因素交互作用對菌株產(chǎn)蛋白酶活力的響應曲面圖和等高曲線圖

得到菌株產(chǎn)蛋白酶能力的最佳(312.98 U/mL)的培養(yǎng)基組成為：葡萄糖濃度2.94%、大豆蛋白胨濃度1.32%和CaCl2濃度0.20%，考慮到實際操作方便，最終將菌株產(chǎn)蛋白酶活力最佳培養(yǎng)基組成設定為葡萄糖、大豆蛋白胨和CaCl2的濃度分別為2.95%、1.30%和0.20%。

2.3.3 培養(yǎng)基組成雙響應面模型驗證試驗

通過比較可以發(fā)現(xiàn)可以利用同樣的預測條件下，菌株不僅生長良好，而且所產(chǎn)蛋白酶活力最高。因此最佳培養(yǎng)基發(fā)酵組成為：葡萄糖2.95%、大豆蛋白胨1.30%和CaCl20.20%，該模型OD值和酶活的最大響應值分別為1.95和312.98 U/mL。為了驗證模型的準確性，在優(yōu)化的培養(yǎng)基組成下進行10組驗證實驗(均選擇在實驗的范圍之內(nèi)，5組實驗按照得到的最優(yōu)條件進行。另外5組隨機選擇)。在10組驗證實驗中，實驗值是預測值的98.73%，兩者的良好擬合性證實了模型的有效性，可見該模型能良好的預測實際發(fā)酵情況。在最優(yōu)發(fā)酵條件下蛋白酶活力比未優(yōu)化的蛋白酶活力(257.67 U/mL)提高了21.5%。

2.4 菌株搖瓶發(fā)酵曲線的測定

采用雙響應面優(yōu)化培養(yǎng)基配方，在搖瓶發(fā)酵條件下，得到該菌株的發(fā)酵過程曲線，如圖9。在整個發(fā)酵過程中，在0～22 h菌體處于對數(shù)生長期，此時的酶活力相對較低，發(fā)酵22～36 h菌體達到穩(wěn)定期，此時酶活力繼續(xù)不斷升高，直到32 h時菌體所產(chǎn)酶活力基本穩(wěn)定。

圖9 菌株搖瓶發(fā)酵曲線

搖瓶發(fā)酵曲線可為放大發(fā)酵提供數(shù)據(jù)基礎，從搖瓶發(fā)酵曲線，可以看出該菌株的產(chǎn)蛋白酶周期較短，在工業(yè)發(fā)酵中，通過進一步優(yōu)化發(fā)酵條件酶活力可進一步提高。

3 結 論

本研究采用甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)為發(fā)酵菌株，通過單因素和雙響應面實驗優(yōu)化其發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源和無機鹽，確定了菌株發(fā)酵的培養(yǎng)基組成。當葡萄糖、大豆蛋白胨和CaCl2的濃度(m/V)分別為2.95%、1.30%和0.20%時，發(fā)酵菌株生長狀態(tài)良好，產(chǎn)蛋白酶活力高達312.98 U/mL，較為優(yōu)化前提高了21.5%。驗證試驗與預測值接近，證明了優(yōu)化結果的可靠性。在此基礎上搖瓶發(fā)酵曲線的測定為工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)提供了必要的理論基礎。

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Dual Response Surface Optimization of Protease Producing Mediumby Fermentation ofBacillusmethylotrophicus

Cao Hong1, Weng Peifang1*, Zhou Xiaomin2, Gao Zhizhong2, Wu Zufang1, Zhang Xin1

(1.Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology, School of Marine Sciences, Ningbo University,Ningbo 315211, China; 2.Xingye Group Co., Ltd., Zhoushan 316100, China)

In order to achieve a better strain with high protease activity, medium compositions for producing protease through the fermentation ofBacillusmethylotrophicuswere optimized by dual response surface design based on single factor experiments. The results showed that the composition and concentration (m/V)of fermentation medium were glucose 2.95%, soy peptone 1.30% and CaCl20.20%. Under the conditon, the bacteria grew better and the protease activity increased to 312.98 U/mL eventually, increasing by 21.5%. The optimizing culture medium of shaking flask fermentation provides a theoretical basis for larger industrial fermentation.

Bacillusmethylotrophicus; medium; protease; dual response surface; optimization

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.04.003

2016-11-18

國家級星火計劃(2015GA700089)；“水產(chǎn)”浙江省重中之重學科開放基金(XKZSC1535)。

曹紅(1989—), 女, 研究生, 主要研究方向: 主要從事水產(chǎn)品加工與高值化利用研究。E-mail:caohongnbu@163.com

*通訊作者： 翁佩芳(1963—), 女, 教授, 主要研究方向: 主要從事水產(chǎn)品加工與高值化利用研究。E-mail:weng-pf@163.com

TQ925+.2

A

1006-9690(2017)04-0009-08