應(yīng)用CRISPR/Cas9慢病毒系統(tǒng)建立Nestin基因敲除的小鼠腎足細(xì)胞系

王璐萍 陶穎莉 黃平?

應(yīng)用CRISPR/Cas9慢病毒系統(tǒng)建立Nestin基因敲除的小鼠腎足細(xì)胞系

王璐萍 陶穎莉 黃平?

目的 基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定敲除Nestin基因的條件永生性小鼠腎足細(xì)胞株（mouse podocyte，MP）。方法 利用Cas9過(guò)表達(dá)慢病毒構(gòu)建條件性永生小鼠足細(xì)胞Cas9過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系（CAS9/MP）。設(shè)計(jì)Nestin基因的3個(gè)位點(diǎn)（KO1、KO2、KO3），并構(gòu)建3對(duì)靶向Nestin基因的sgRNA寡核苷酸序列，將其連接進(jìn)GV371質(zhì)粒中，測(cè)序驗(yàn)證后，包裝慢病毒顆粒，感染構(gòu)建好的CAS9/ MP，嘌呤霉素篩選（Puromycin）陽(yáng)性克隆細(xì)胞，Cruiser TM酶切檢測(cè)CAS9-sgRNA對(duì)目的基因的剪切活性。結(jié)果 成功構(gòu)建了CAS9/MP及GV371-Nes-sgRNA重組載體，CruiserTM酶法驗(yàn)證表明，CAS9-sgRNA2具有剪切活性。結(jié)論 建立能穩(wěn)定敲除Nestin基因的CRISPR/Cas9 慢病毒系統(tǒng)，成功獲得Nestin敲除的MP穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。為進(jìn)一步研究Nestin在足細(xì)胞中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

CRISPR/Cas9 Nestin基因敲除 小鼠腎足細(xì)胞

足細(xì)胞附著于腎小球基底膜（GBM）的外側(cè)，是一種具有復(fù)雜細(xì)胞骨架系統(tǒng)的高度分化的上皮細(xì)胞，是腎小球?yàn)V過(guò)屏障的有效組成部分［1］。足細(xì)胞損傷參與多種腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展［2-4］。巢蛋白（Nestin）作為第Ⅵ類中間絲細(xì)胞骨架蛋白，主要表達(dá)于足細(xì)胞胞漿及初級(jí)足突，對(duì)維持足細(xì)胞的形態(tài)和功能具有重要作用［5］。抑制Nestin可明顯減少足細(xì)胞足突數(shù)量［6］。研究表明，細(xì)胞骨架蛋白的改變參與了足細(xì)胞的損傷過(guò)程［7-8］。2015年7月至2016年1月作者應(yīng)用CASCRISPR/Cas9慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定沉默Nestin基因的條件永生性小鼠腎足細(xì)胞株，為深入研究Nestin基因在糖尿病腎臟病足細(xì)胞中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 （1）細(xì)胞株和慢病毒載體：條件性永生小鼠足細(xì)胞（mouse podocyte）購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心（3111C0001CCC000230），CAS9蛋白慢病毒質(zhì)粒（LV-Cas9-Puro）、GV371載體（LV-sgRNA-EGFR）、293T細(xì)胞、DH5a細(xì)胞購(gòu)自上海吉盛醫(yī)學(xué)科技有限公司。（2）實(shí)驗(yàn)試劑：1640培養(yǎng)基及胎牛血清、胰酶購(gòu)于四季青公司。Polybrene助感染試劑、Enhanced Infection Solution感染增強(qiáng)劑、慢病毒包裝試劑盒。DNA Marker 、逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa）。T4 DNA連接酶、Bbs I購(gòu)自New England Biolabs（NEB）公司，質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自Qiagen 公司，Lipofectamine? 2000 試劑購(gòu)自Invitrogen公司。本實(shí)驗(yàn)Nestin靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)、寡核苷酸序列、所有引物由上海吉?jiǎng)P基因設(shè)計(jì)合成。

1.2 方法 （1）CAS9過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建：在細(xì)胞轉(zhuǎn)染前一天，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠腎足細(xì)胞胰酶消化，完全培養(yǎng)基制成（3～5）×104個(gè)/ml細(xì)胞懸液接種于6孔板中，接種體積2ml/孔，感染時(shí)細(xì)胞密度20%/孔，分為CON組和OE組，感染條件為Eni.S，MOI為15。感染當(dāng)天OE組加入Lenti-CAS9慢病毒顆粒15μl進(jìn)行目的細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)。感染3d后進(jìn)行Puromycine篩選，Puromycin維持濃度2.00μg/ml。qPCR法檢測(cè)兩組LV-Cas9-Puro表達(dá)豐度，內(nèi)參基因GAPDH：上游引物序列TGGTGAAGGTCGGTGTGAAC，下游引物序列GCTCCTGGAAGATGGTGATGG，擴(kuò)增片段為231bp；目的基因LV-Cas9-Puro：上游引物序列GCTGAAAACCTATGCCCACC，下游引物序列GATTGTCTTGCCGGACTGCT，擴(kuò)增片段為133bp。（2）

表1 靶向Nestin 基因的sgRNA寡核苷酸鏈合成序列

表2 慢病毒感染293T細(xì)胞48h培養(yǎng)液病毒顆粒滴度

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建CAS9小鼠腎足細(xì)胞穩(wěn)定株 當(dāng)CON組和OE組細(xì)胞密度為80%時(shí)，Trizol法提取兩組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后qPCR法檢測(cè)結(jié)果顯示，OE組LV-Cas9-Puro表達(dá)豐度是CON組的9731.012 倍（P＜0.05）（見圖1），成功構(gòu)建CAS9小鼠腎足細(xì)胞穩(wěn)定株。

圖1 CON組和OE組LV-CAS9的表達(dá)豐度（P＜0．05）

圖2 靶向Nestin基因的Nes-sg RNA的載體測(cè)序結(jié)果

2.2 重組質(zhì)粒載體的檢測(cè) 重組質(zhì)粒載體LV-NessgRNA1 、LV-Nes-sgRNA2和LV-Nes-sgRNA3的測(cè)序重組質(zhì)粒基因測(cè)序結(jié)果顯示，在酶切位點(diǎn)之間插入的片段位置、方向及序列與sgRNA一致，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功（見圖2）。合成sgRNA寡核苷酸鏈并構(gòu)建載體：根據(jù)sgRNA設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)3對(duì)靶向Nestin基因的sgRNA，在正義鏈模板的5′端添加CACC；反義鏈模板的5′端添加AAAC同時(shí)C'端添加C。合成后的寡核苷酸單鏈先通過(guò)退火形成雙鏈，連接至Bbs I 酶切線性化的GV371質(zhì)粒中（GV371-sgRNA1、GV371-sgRNA2、和GV371-sgRNA3），轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌菌株DH5a，用去內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，并測(cè)序驗(yàn)證。見表1。（3）Lv-Nes-sgRNA慢病毒顆粒的包裝：將重組病毒質(zhì)粒LV-Nes-sgRNA1、LV-NessgRNA2和LV-Nes-sgRNA3及包裝質(zhì)粒混合物L(fēng)enti-Easy Packaging Mix分別進(jìn)行高純度無(wú)內(nèi)毒素抽提，按Invitrogen公司Lipofectamine 2000使用說(shuō)明進(jìn)行共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)48h后，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，濃縮純化后用熒光法測(cè)定病毒滴度。見表2。（4）細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染：用包裝好的Lv-NessgRNA慢病毒顆粒去感染CAS9小鼠腎足細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株。CAS9/MP用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基于5%CO2，37℃恒溫培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24h，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞以（3～5）×104/ml接種到12孔板培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染16h后換液，轉(zhuǎn)染72h后進(jìn)行Puromycine篩選，Puromycin維持濃度1.00μg/ml。將其分為：NC組（陰性對(duì)照組）、PC組（陽(yáng)性對(duì)照組）、KO1組（LV-Nes-sgRNA1組）、KO2組（LV-Nes-sgRNA2組）和KO3組（LV-Nes-sgRNA3組）（5）CruiserTM檢測(cè)CAS9-sgRNA的剪切活性：設(shè)計(jì)包含sgRNA目標(biāo)序列的Nestin基因片段的PCR擴(kuò)增引物（上游引物：TCAGAGGGGTCTGAGTCTGCT，下游引物：AGGCTGAGATGATGAGAGTCAC）。CAS9過(guò)表達(dá)小鼠腎足細(xì)胞感染慢病毒后，收集細(xì)胞，抽提細(xì)胞混合克隆基因組。PCR擴(kuò)增退火（上、下游引物：各1μl，2×Taq Plus Master Mix：25μl，Genomic DNA：2μl，ddH2O 22μl），獲得雜交DNA產(chǎn)物，自然冷卻至＜40℃，加入CruiserTM酶切15～20min，酶切PCR反應(yīng)體系（PCR產(chǎn)物：2～3μl，Detecase Buffer：2μl，Detecase：1μl，Add ddH2O to 10μl），45℃反應(yīng)20min后立即向上述10μl體系內(nèi)加入2μl Stop Buffer，隨后將全部樣品進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2.3 Nestin靶向序列的篩選 將陰性對(duì)照病毒、LVNes-sgRNA1、LV-Nes-sgRNA2和LV-Nes-sgRNA3分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至CAS9小鼠腎足細(xì)胞穩(wěn)定株，72h后，轉(zhuǎn)染了LV-Nes-sgRNA的CAS9/MP細(xì)胞多數(shù)表達(dá)綠色熒光，表明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CAS9/MP細(xì)胞成功（見圖3）。7d后提取基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示PCR檢測(cè)到目的大小條帶且KO2靶點(diǎn)檢測(cè)出活性（見圖4）。

圖3 LV-Nes-sgRNA感染CAS9/MP細(xì)胞

圖4 CruiserTM 篩選活性sgRNA

3 討論

基因組編輯技術(shù)為了解特定基因的功能提供基礎(chǔ)，傳統(tǒng)基因敲除以ZFN及TALEN技術(shù)的應(yīng)用較為廣泛，但其操作時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)要求高，篩選工作量大，易出錯(cuò)成為其發(fā)展的瓶頸［9］。規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)系統(tǒng)（CRISPR/Cas system）存在于大約50%的細(xì)菌和90%的古細(xì)菌基因組中［10-11］，是抵御外來(lái)噬菌體、質(zhì)粒或其他移動(dòng)元件侵染的獲得性免疫系統(tǒng)［12-14］。CRISPR/CAS系統(tǒng)依賴于CAS和crRNA形成的蛋白核酸復(fù)合物對(duì)DNA序列上PAM（protospacer adjacent motif）區(qū)域的識(shí)別，利用這一特性對(duì)基因組特定位點(diǎn)進(jìn)行基因組編輯［15］。CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有簡(jiǎn)單靈活、特異性高、細(xì)胞毒性低等特點(diǎn)，可以對(duì)特定基因組位點(diǎn)進(jìn)行切割置換［16］。目前已有研究基于CRISPR/Cas9技術(shù)成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)動(dòng)物、細(xì)胞、植物單基因、雙基因及多基因的敲除［17］。本研究構(gòu)建Nestin基因敲除的MP穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，是深入研究Nestin基因功能及其在糖尿病腎臟病中的作用機(jī)制的基礎(chǔ)。

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Objective To establish mouse podocytes Nestin gene knockout cell lines stably based on CRISPR/Cas9 system. Methods Using Cas9 overexpression of lentivirus to build Cas9 overexpression of conditional permanent resident mouse podocytes cell lines.Three gene loci of Nestin（KO1、KO2、KO3）and three pairs of sgRNAs targeting Nestin were designed and inserted in GV371 vector to construct GV371-Nes-sgRNA expression vector for knockout.After sequenced and packed lentivirus particles，then used them to transfect the built CAS9 overexpress MPC.Then puromycin was used to screen positive cells.The enzyme of Cruiser TM to verify CAS9- sgRNA' shear of targeting gene activity. Results Cas9/MP and recombinant plasmid of GV371-Nes-sgRNA was constructed successfully.Cruiser TM verified that the knockout activity of CAS9-sgRNA2 was the maximum. Conclusion The stable MP cell lines of Nestin-knockout are successfully generated by CRISPR/Cas9 system，which provides the foundation for further studying the functions of Nestin gene.

CRISPR/Cas9 Nestin gene knockout Mouse podocyte

浙江省自然科學(xué)基金（LY13H290016）

310053 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院

310006 浙江省中醫(yī)院

*通信作者