固相萃取-超高效液相色譜-高分辨質譜法快速測定食用油中4種酚類環(huán)境雌激素殘留

潘勝東, 何 仟, 陳曉紅, 王 立, 邱巧麗, 金米聰*

(1. 寧波市疾病預防控制中心, 浙江省微量有毒化學物健康風險評估技術研究重點實驗室, 寧波市毒物研究與控制重點實驗室, 浙江 寧波 315010; 2. 中國疾病預防控制中心, 職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所, 北京 100050)

研究論文

固相萃取-超高效液相色譜-高分辨質譜法快速測定食用油中4種酚類環(huán)境雌激素殘留

潘勝東1, 何 仟2, 陳曉紅1, 王 立1, 邱巧麗1, 金米聰1*

(1. 寧波市疾病預防控制中心, 浙江省微量有毒化學物健康風險評估技術研究重點實驗室, 寧波市毒物研究與控制重點實驗室, 浙江 寧波 315010; 2. 中國疾病預防控制中心, 職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所, 北京 100050)

建立了固相萃取-超高效液相色譜-高分辨質譜(SPE-UPLC-HRMS)快速測定食用油中4種痕量酚類環(huán)境雌激素(雙酚S(BPS)、雙酚F(BPF)、雙酚A(BPA)和4-壬基酚(4-NP))的分析方法。食用油樣品經乙腈渦旋提取和SLC玻璃固相萃取小柱凈化后,以0.05%(v/v)三乙醇胺和甲醇溶液為流動相進行梯度洗脫,采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)進行分離,在電噴霧離子源負離子模式(ESI-)和選擇性離子監(jiān)測(SIM)模式下進行檢測,內標法定量。4種目標物在各自的范圍內有良好的線性關系,相關系數(r)>0.999。方法的檢出限(LOD,S/N=3)和定量限(LOD,S/N=10)分別為0.03～0.11 μg/kg和0.10～0.36 μg/kg。在1.0、10.0和80.0 μg/kg 3個加標水平下,4種目標物的加標回收率為86.3%～96.1%,相對標準偏差(RSD)為2.2%～8.8%(n=6)?；|效應實驗表明方法在低、中、高3個濃度水平下均無明顯的基質干擾。該法簡便、快速,能用于食用油中雙酚S、雙酚F、雙酚A和4-壬基酚殘留的快速檢測。

超高效液相色譜-高分辨質譜;固相萃取;酚類環(huán)境雌激素;雙酚S;雙酚F;雙酚A;4-壬基酚;食用油

雙酚A(BPA)、雙酚F(BPF)和4-壬基酚(4-NP)均為內分泌干擾物質,具有類似雌激素的作用,低劑量水平的BPA即可干擾正常的內分泌調節(jié)[1-3],過量攝入則可能影響生殖功能,甚至能引起細胞癌變和器官畸形發(fā)育[4,5]。據統(tǒng)計,歐洲每年消耗約69萬噸BPA[6],BPA可通過多種方式進入環(huán)境,危及人類健康。隨著我國經濟的快速發(fā)展,BPA等內分泌干擾物的生產和需求不斷增加[7]。BPA被廣泛添加于食品包裝材料、容器內壁涂料等材料中，塑料制品中也常含有BPA和4-NP等有害成分。因此,在塑料桶裝食用油的儲存過程中容器內壁的BPA等環(huán)境雌激素可能會析出,從而影響人類健康。為此,相對更安全的雙酚S(BPS)作為BPA的替代物被廣泛使用,然而最新研究發(fā)現,BPS可能和BPA同樣有害,體外實驗已證實BPS具有雌激素效應及抗雄性激素效應,其激素效應分別為BPA的32%和25%[8]。此外,實驗發(fā)現長期暴露在低劑量BPS環(huán)境中的雌鼠肥胖的概率明顯增加[9]。

目前,國內外針對BPA和BPS等酚類環(huán)境雌激素在食品中的檢測方法主要包括氣相色譜-質譜法(GC-MS)[10-12]、液相色譜-紫外可見光譜法(HPLC-UV)[13]和液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[14-17]等。GC-MS的優(yōu)點在于分離度好,對雙酚A和烷基酚的靈敏度要高于液相色譜法,但是酚類化合物的揮發(fā)性差,需要對目標物進行衍生化反應(硅烷化反應、芐基化反應、乙?；磻头；磻?,操作繁瑣,前處理時間較長,不如液相色譜法操作簡單[18]; HPLC-UV測定BPA類化合物不用衍生化,可以保持化合物的組成不變,但靈敏度較低;LC-MS/MS能有效彌補HPLC-UV的不足,具有操作簡單、假陽性率低的特點,尤其適用于食品中多組分的同時檢測,目前已大量用于食品安全的殘留分析[19-23]。但針對食品樣品的分析,采用LC-MS/MS時產生的基質效應卻不可避免[24],往往需要進行有效的基質凈化才能實現準確的定性、定量分析。此外,由于BPS結構中具有砜基(-SO2-),極性較強,與BPF、BPA和4-NP的色譜行為差異性大,在常規(guī)C18色譜柱上保留能力差,大大限制了復雜基質樣品的測定。

本研究選擇對極性化合物具有更強保留能力的Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱進行分離,采用超高效液相色譜-高分辨質譜作為檢測手段,通過準分子離子峰精確的相對分子質量定性(誤差<0.50 ppm (1×10-6)),開發(fā)了基于固相萃取凈化模式快速檢測食用油中BPS、BPF、BPA和4-NP 4種酚類環(huán)境雌激素的方法。該法快速、準確,為食品安全風險監(jiān)測提供了新思路。

1 實驗部分

1.1儀器和試劑

Waters UPLC I Class型超高效液相色譜儀(美國Waters公司); Q-Exactive Orbitrap型高分辨質譜儀,配有Trace Finder 3.3數據處理系統(tǒng)(美國Thermo Fisher公司); Legend RT型離心機(德國Heraeus公司); SLC玻璃固相萃取小柱(500 mg/6 mL,杭州福?？萍挤沼邢薰?。

甲醇(LC-MS級,批號:20160205)購自美國Thermo Fisher公司;氨水(色譜純,批號:83Y1409PF)和三乙醇胺(色譜純,批號:81Y1509PF)購自德國Merck公司;BPS(批號:127044)、BPF(批號:50107)、BPA(批號:40217)、4-NP(批號:90819)標準品和13C12-BPS、D4-BPA同位素內標均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司。食用油樣品購自各大型超市。

1.2標準溶液的配制

分別準確稱取1.0 mg BPS、BPF、BPA和4-NP于1.0 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,配制質量濃度為1 000 mg/L的4種目標物的標準儲備液;分別準確移取上述4種標準儲備液100 μL，置于100 mL容量瓶中,用甲醇稀釋并定容至刻度,配制質量濃度為1.0 mg/L的混合標準溶液。

分別準確稱取1.0 mg13C12-BPS和D4-BPA,置于1.0 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,配制質量濃度為1 000 mg/L的內標儲備液;分別準確移取上述2種內標儲備液100 μL,置于100 mL容量瓶中,用甲醇稀釋并定容至刻度,配制質量濃度為1.0 mg/L的內標應用液。

分別準確吸取1.0、2.0、5.0、10.0、25.0、100.0 μL 1.0 mg/L的混合標準溶液,置于10.0 mL容量瓶中,分別加入50.0 μL 1.0 mg/L的內標應用液,用甲醇稀釋并定容至刻度,配制質量濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、100.0 μg/L的系列混合標準溶液,其中內標13C12-BPS和D4-BPA的質量濃度均為5.0 μg/L。

1.3樣品前處理

提取:稱取0.50 g(精確至0.01 g)食用植物油，置于10 mL具塞玻璃刻度試管,加入5.0 μL 1.0 mg/L的內標應用液,混勻,加入2 mL乙腈,渦旋混勻5 min,以10 000 r/min離心2 min,取上層乙腈相，待凈化。

凈化:依次用5 mL二氯甲烷和5 mL乙腈活化SLC玻璃固相萃取小柱,然后移取2 mL上述提取液,上樣,收集流出液于試管中,再用2 mL乙腈洗脫,并收集洗脫液于同一試管中,于60 ℃氮氣吹至近干,用1 mL甲醇復溶,進樣測定。

1.4色譜條件

色譜柱:Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm);流速:0.3 mL/min;進樣量:5.0 μL;流動相:A相為0.05%(v/v)三乙醇胺溶液,B相為甲醇。梯度洗脫程序:0～4.00 min, 20%B～95%B; 4.00～5.00 min, 95%B; 5.00～5.01 min, 95%B～20%B; 5.01～7.00 min, 20%B。

1.5質譜條件

離子源:電噴霧離子(ESI)源;掃描方式:負離子掃描;離子源溫度:320 ℃;定量檢測方式:選擇性離子監(jiān)測模式(SIM);電噴霧電壓:-2.8 kV;溶劑化氣壓力:275.8 kPa;輔助氣速率:180 L/h;射頻棱鏡電壓(S-lens RF level): 60%;輔助氣加熱溫度:300 ℃;分辨率:35 000;自動增益控制(AGC): 1×105;最大注入時間(maximum IT): 60 ms。4種酚類環(huán)境雌激素及2種內標物的準分子離子峰均為[M-H]-,分別以各化合物準分子離子峰的精確相對分子質量(Mr)和保留時間(tR)定性,內標法定量。表1列舉了BPS、BPF、BPA和4-NP及內標物的質譜參數。

表 1 BPS、BPF、BPA和4-NP及內標物的分子式、相對分子質量、質量數偏差和保留時間Table 1 Formulas, relative molecular mass (Mr), mass deviations and retention times (tR) of BPS, BPF, BPA, 4-NP and their internal standards

2 結果與討論

2.1色譜條件的優(yōu)化

圖 1 不同色譜柱與流動相條件下BPS(5.0 μg/L)的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of BPS (5.0 μg/L) with different kinds of chromatographic columns and mobile phases a. column: Waters BEH C18 column (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm); mobile phases: 0.1% (v/v) ammonia-methanol; b. column: Waters BEH C18 column (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm); mobile phases: 0.05% (v/v) triethanolamine-methanol; c. column: Waters HSS T3 column (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm); mobile phases: 0.1% (v/v) ammonia-methanol; d. column: Waters HSS T3 column (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm); mobile phases: 0.05% (v/v) triethanolamine-methanol.

采用液相色譜分離分析有機化合物時,C18色譜柱是首選,本研究首先采用Waters BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)分離BPS、BPF、BPA和4-NP 4種酚類環(huán)境雌激素,并分別考察了水-甲醇、乙酸銨-甲醇、0.1%(v/v)氨水-甲醇和0.05%(v/v)三乙醇胺-甲醇作為流動相時4種酚類環(huán)境雌激素的分離效果和靈敏度。結果表明,當水-甲醇作為流動相時,4種酚類環(huán)境雌激素能較好地分離,BPS的保留也較好,但BPA的靈敏度較差,不能滿足痕量檢測的要求,且4-NP的保留時間滯后嚴重,峰形不佳;當乙酸銨-甲醇溶液作為流動相時,4-NP的保留時間合適,但BPA基本無質譜響應;當0.1%(v/v)氨水-甲醇作為流動相時,4種待測物能較好地實現分離,峰形對稱,靈敏度好,但BPS的保留較差(tR=0.57 min),接近死時間(見圖1a);當選用0.05%(v/v)三乙醇胺-甲醇作為流動相時,BPS的保留有所改善,tR為1.04 min(見圖1b),可能是因為BPS分子中含有-SO2-和-OH基團,極性較大,在堿性條件下,電離成負離子,較難在C18色譜柱上保留,而三乙醇胺的存在可能與BPS通過氫鍵作用力形成復合物,從而增強了在C18柱上的保留，但由于BPS的保留時間依然較短,有待進一步完善。之后選用對極性化合物具有更強保留能力的Waters HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)進行分析。當水-甲醇和乙酸銨-甲醇作為流動相時,各目標化合物的色譜和質譜行為與使用Waters BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)時相似,BPA質譜響應較弱,不能滿足殘留分析的要求;當0.1% (v/v)氨水-甲醇作為流動相時,BPS在T3色譜柱上的保留依然較差(tR=0.92 min,見圖1c);當以0.05% (v/v)三乙醇胺-甲醇作為流動相進行分離時,BPS在色譜柱上的保留能力有了較大提高,保留時間為1.62 min(見圖1d),且此時BPA、BPF和4-NP的保留、峰形和靈敏度也較好。綜上,本文采用Waters HSS T3色譜柱進行分離，選擇0.05% (v/v)三乙醇胺-甲醇作為流動相進行梯度洗脫。加標樣品中4種酚類環(huán)境雌激素及2種內標物的SIM色譜圖見圖2。

圖 2 加標食用油樣品中4種酚類環(huán)境雌激素及2種內標物(5.0 μg/kg)的SIM色譜圖Fig. 2 SIM chromatograms of the four phenolic environmental estrogens and two internal standards (5.0 μg/kg) spiked in cooking oil samples

2.2質譜條件的優(yōu)化

由于本文所研究的4種酚類環(huán)境雌激素的分子結構中均含有羥基,容易電離形成負離子,因此在ESI-模式下對各目標化合物進行分析。實驗表明,當采用一級質譜時,在ESI-模式下,4種酚類環(huán)境雌激素所產生的準分子離子均為[M-H]-,鑒于通過高分辨質譜獲得的精確相對分子質量與理論值間偏差較小(均<0.50 ppm,見表1),準分子離子完全可以作為各化合物定性分析的依據。因此,本文采用Targeted SIM模式對4種酚類環(huán)境雌激素進行定性定量分析,并對影響Q-Exactive靈敏度和選擇性的各參數(如分辨率、自動增益控制、最大注入時間)進行優(yōu)化,結果表明,當設定分辨率為35 000、AGC為1×105和最大注入時間為60 ms時,4種酚類環(huán)境雌激素及其內標物的質譜響應程度最強,選擇性最佳。優(yōu)化后的質譜參數見表1。

2.3前處理條件的優(yōu)化

2.3.1提取溶劑的選擇

本研究分析的4種酚類環(huán)境雌激素的化學結構中均帶有一個或多個羥基極性基團,根據相似相溶原理,其在極性溶劑中的溶解度應較為理想。因此本實驗考察了甲醇、乙腈和丙酮3種溶劑對目標分析物的提取效率。實驗結果表明,當采用乙腈提取時，食用油基質中的待測物可被充分提取,4種酚類環(huán)境雌激素的提取率為93.6%～99.5%,優(yōu)于其他兩種提取溶劑。因此本實驗選擇乙腈作為食用油中酚類環(huán)境雌激素的提取溶劑。

2.3.2凈化方式的選擇

食用油樣品基質較為復雜,尤其含有大量的脂肪,導致采用質譜分析時基質效應顯著,需對提取液進行適當的凈化。然而,酚類環(huán)境雌激素在塑料制品中普遍殘留,常規(guī)的塑料固相萃取小柱可能會對實驗結果造成影響,因此選擇分散固相萃取或玻璃填充固相萃取小柱能有效減少不必要的干擾。

圖 3 不同凈化方式對4種酚類環(huán)境雌激素回收率的影響(n=3)Fig. 3 Effect of different clean-up approaches on the recoveries of the four phenolic environmental estrogens (n=3)

本研究分別比較了采用C18粉末、SILICA/PSA玻璃混合型固相萃取小柱和SLC玻璃固相萃取小柱時目標分析物的回收率(見圖3)。實驗結果表明,C18粉末能有效去除食用油中的非極性雜質,BPS、BPA和4-NP的回收率可達76.5%～86.5%,但BPF的回收率較低(<65%); 采用SILICA/PSA玻璃混合型固相萃取小柱時，BPF、BPA和4-NP的回收率為85.9%～92.6%,但BPS的保留較強,幾乎難以洗脫，回收率<15%;SLC玻璃固相萃取小柱由中性氧化鋁和強陽離子交換材料(SCX)復合而成,在凈化過程中,食用油樣品經乙腈提取后,提取液中含有一定量的甘油三酯,可通過疏水作用機理吸附于氧化鋁表面,從而達到除雜的目的,而SCX成分可通過靜電作用機理有效吸附提取液中離子型雜質,進而實現雜質凈化的目的。實驗結果表明，4種酚類環(huán)境雌激素的回收率為93.1%～98.8%，因此實驗選用SLC玻璃固相萃取小柱進行凈化。

2.4基質效應的評價

在不含BPS、BPF、BPA和4-NP的食用油提取液(經固相萃取柱凈化)中分別添加低、中、高3個水平(1.0、10.0和80.0 μg/kg)的BPS、BPF、BPA和4-NP,比較相同水平下食用油基質中目標物峰面積(S2)與標準品溶液中目標物峰面積(S1)間的差異,并計算絕對基質效應(Absolute matrix effect, AME),公式為：AME=S2/S1×100%。實驗結果表明,BPS、BPF、BPA和4-NP在低、中、高3個添加水平下的絕對基質效應為84.3%～96.3%,表明食用油樣品經SLC固相萃取凈化后的基質干擾不明顯,提取凈化效果較好。

2.5方法學驗證

對配制的質量濃度為0.1～100.0 μg/L的系列標準溶液進行分析,根據內標物與被測物的性質,選擇13C12-BPS作為BPS的內標物、D4-BPA作為BPF、BPA和4-NP的內標物,以被測組分與內標物的峰面積之比(y)對標準溶液中被測組分與內標物的質量濃度之比(x)進行線性回歸,結果見表2。由表2可知,4種酚類環(huán)境雌激素在各自的范圍內均具有良好的線性關系,相關系數(r)>0.999。采用空白食用油樣品中添加待測物的方式確定方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),分別以目標分析物色譜峰信噪比(S/N)為3和10時計算,4種酚類環(huán)境雌激素的LOD和LOQ分別為0.03～0.11 μg/kg和0.10～0.36 μg/kg。

準確稱取18份0.50 g(精確至0.01 g)空白食用油樣品,置于10 mL具塞玻璃刻度試管中,以6份為一組,加入5.0 μL 1.0 mg/L的內標應用液,然后分別準確加入1.0 mg/L的混合標準溶液各1.0、10.0和80.0 μL,配制低、中、高3個添加水平的加標樣品(1.0, 10.0和80.0 μg/kg),按1.3節(jié)進行前處理,然后采用UPLC-HRMS測定,每一水平平行測定6次,計算回收率和精密度(見表2)。結果表明,食用油樣品中4種目標分析物的加標回收率為86.3%～96.1%,RSD為2.2%～8.8%(n=6)。

表 2 4種酚類環(huán)境雌激素的線性范圍、回歸方程、相關系數、檢出限、定量限、回收率和精密度Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r), LODs, LOQs, recoveries, and precisions of the four phenolic environmental estrogens

y: peak area ratio of target analyte to its internal standard;x: mass concentration ratio of target analyte to its internal standard.

圖 4 典型陽性樣品中BPA的SIM色譜圖及其一級質譜圖和理論質譜圖Fig. 4 SIM chromatogram of a BPA positive sample and its experimental and theoretical mass spectra

2.6實際樣品分析

采集市售食用油樣品30份作為研究對象,采用本文建立的SPE-UPLC-MS/MS方法測定4種酚類環(huán)境雌激素。實驗結果表明,共檢出15份食用油樣品中含有BPA, 10份含有BPS, 5份含有4-NP, 2份含有BPF,總體的含量范圍為1.1～50.2 μg/kg。典型的BPA陽性樣品的SIM色譜圖和質譜圖見圖4。由圖4可知,BPA陽性樣品一級質譜圖與BPA的理論圖譜極其接近,兩個主要的準分子離子同位素峰的精確相對分子質量的偏差均<0.50 ppm,定性能力好。由此可見,本研究所建立的食用油中酚類環(huán)境雌激素的檢測方法具有準確可靠的優(yōu)點。

3 結論

本文建立了固相萃取-超高效液相色譜-高分辨質譜測定食用油中4種痕量酚類環(huán)境雌激素殘留的分析方法。該法具有快速、準確、靈敏和定性能力好等優(yōu)點,可用于食用油中酚類環(huán)境雌激素的快速確證分析。

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Rapid determination of four phenolic environmental estrogen residues in cooking oil by ultra-performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry coupled with solid-phase extraction

PAN Shengdong1, HE Qian2, CHEN Xiaohong1, WANG Li1, QIU Qiaoli1, JIN Micong1*

(1. Zhejiang Provincial Key Laboratory of Health Risk Appraisal for Trace Toxic Chemicals, Ningbo Key Laboratory of Poison Research and Control, Ningbo Municipal Center for Disease Control and Prevention,Ningbo 315010, China; 2. National Institute of Occupational Health and Poison Control, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100050, China)

A fast, sensitive and accurate method for the determination of trace bisphenol S (BPS), bisphenol F (BPF), bisphenol A (BPA) and 4-nonylphenol (4-NP) in cooking oil samples was developed by ultra-performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) coupled with solid-phase extraction (SPE). Cooking oil samples were extracted by acetonitrile, then the supernatant was purified by SLC SPE cartridges. The chromatographic separation was carried out on a Waters ACQUITY UPLC HSS T3column (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm) with a linear gradient elution procedure using 0.05% (v/v) triethanolamine aqueous solution and methanol as mobile phases. The quantification analysis was operated in a negative electrospray ion (ESI-) source mode under the selected ion monitoring (SIM) mode with internal standard method. The four target analytes showed good linearity with correlation coefficients (r) greater than 0.999. The limits of detection (LODs,S/N=3) and limits of quantification (LOQs,S/N=10) were in the ranges of 0.03-0.11 μg/kg and 0.10-0.36 μg/kg, respectively. The recoveries of the four target analytes spiked in oil samples were in the range of 86.3%-96.1% at spiked levels of 1.0, 10.0 and 80.0 μg/kg, respectively, while the relative standard deviations (RSDs) were in range of 2.2%-8.8% (n=6). No significant matrix interference was found in this method. The proposed method is simple and fast. It can be applied for the rapid determination of trace BPS, BPF, BPA, and 4-NP in cooking oil samples.

ultra-performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS); solid-phase extraction (SPE); phenolic environmental estrogens; bisphenol S (BPS); bisphenol F (BPF); bisphenol A (BPA); 4-nonylphenol (4-NP); cooking oil

10.3724/SP.J.1123.2017.06003

2017-06-01

.E-mail: jmcjc@163.com.

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生平臺骨干項目(2015RCB023);浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生平臺重點項目(2014ZDA021);寧波市自然科學基金項目(2016A610178);浙江省公共衛(wèi)生應急檢測關鍵技術重點實驗室開放基金.

O658

A

1000-8713(2017)09-0980-07

Foundation item: Zhejiang Provincial Medical Health Platform Backbone Project (No. 2015RCB023); Zhejiang Provincial Medical Health Platform Key Project (No. 2014ZDA021); Ningbo Natural Science Foundation of China (No. 2016A610178); Opening Foundation of Key Laboratory of Key Technologies of Emergency Detection for Public Health of Zhejiang Province.

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