黃曲霉毒素B1對原代人皮膚成纖維細胞毒性作用研究

劉 珊，羅仲秋，譚 洪

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院檢驗科，四川 成都 610072；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610031；3.成都市第一人民醫(yī)院普外科，四川 成都 610041)

黃曲霉毒素B1對原代人皮膚成纖維細胞毒性作用研究

劉 珊1，羅仲秋2，譚 洪3

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院檢驗科，四川 成都 610072；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610031；3.成都市第一人民醫(yī)院普外科，四川 成都 610041)

目的探討黃曲霉毒素B1(AFB1)對原代培養(yǎng)的人皮膚成纖維細胞(HSF)的毒性作用。方法分離培養(yǎng)原代HSF細胞，不同濃度的AFB1處理HSF細胞后，觀察細胞形態(tài)學(xué)變化，并采用CCK-8法檢測細胞存活率。結(jié)果AFB1能抑制HSF細胞生長，隨著AFB1染毒濃度和染毒時間的增加，細胞增殖能力減弱。100 μmol/L和200 μmol/L的AFB1處理HSF細胞15天后，分別有62.4%和89.2%的細胞生長被抑制。結(jié)論AFB1對HSF細胞具有明顯的細胞毒性作用。

黃曲霉毒素B1；原代人皮膚成纖維細胞；細胞毒性

黃曲霉毒素(aflatoxins，AF)是糧食食品霉變過程中主要由黃曲霉菌和寄生曲霉菌產(chǎn)生的劇毒代謝產(chǎn)物。其中，在天然污染的食品中以黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)最為多見，其毒性和致癌性也最強，對人類健康構(gòu)成嚴重威脅[1～3]。目前，AFB1的強烈危害性已引起各國廣泛關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)AFB1暴露能引起人體多個系統(tǒng)的毒性效應(yīng)，包括消化系統(tǒng)毒性、肝臟毒性、生殖發(fā)育毒性等[4～7]。皮膚作為人體面積最大的組織器官，是人體接觸外來物質(zhì)的第一道屏障，也是最容易接觸到AFB1的器官。但目前關(guān)于AFB1對皮膚毒性作用的研究，國內(nèi)外尚未有報道。因此，2015～2017年作者分離培養(yǎng)健康人原代皮膚成纖維細胞(human skin fibroblast cells，HSF)，用AFB1處理HSF細胞后進行細胞增殖和毒性分析。為暴露于AFB1污染環(huán)境的人群提供一定的參考價值，并為AFB1對人皮膚細胞毒性作用的研究提供相關(guān)基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要儀器和試劑倒置顯微鏡(日本Olympus公司)、Model 680型酶標儀(美國Bio-Rad公司)。AFB1(純度≥99%)(美國Sigma公司)、CCK-8試劑盒(日本Dojin公司)、二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma公司)，DMEM培養(yǎng)液(美國HyClone公司)、小牛血清(美國HyClone公司)，0.25%胰蛋白酶溶液(美國Thermo Fisher公司)、波形蛋白抗體(美國Labvision公司)、二抗免疫組織化學(xué)試劑盒(武漢晶美試劑公司)。

1.2原代HSF細胞的分離、培養(yǎng)、純化和鑒定健康志愿者前臂皮膚經(jīng)75%乙醇消毒后，取小塊皮膚組織置于含3×105U/L青霉素、300 mg/L鏈霉素的PBS緩沖液中保存。迅速送往實驗室后，在培養(yǎng)皿中，除去脂肪、結(jié)締組織和皮下血管，放入含100 mU/ml dispase酶中4 ℃消化過夜。第二天，剝?nèi)ケ砥樱瑢⒄嫫蛹舫? mm3大小的組織塊，用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合液37 ℃消化10 min，過100 μm篩網(wǎng)去除未消化組織塊。分離得到的細胞加入細胞培養(yǎng)基(100 ml/L小牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、2 mM L-谷氨酰胺和DMEM低糖培養(yǎng)基)，貼壁培養(yǎng)1 h，洗掉未貼壁細胞，加入細胞培養(yǎng)基，放入5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。通過差速貼壁法，進一步純化細胞后，采用波形蛋白抗體鑒定皮膚成纖維細胞。

1.3實驗分組和處理取對數(shù)生長期HSF細胞，按5×103/孔接種于96孔板，過夜培養(yǎng)14～18 h，使其充分貼壁。次日，將血清培養(yǎng)基替換為100 μl終濃度為100、200、300、400 μmol/L AFB1的培養(yǎng)基。溶劑對照孔中加入相應(yīng)濃度的DMSO溶液。培養(yǎng)5、10、15天后，顯微鏡觀察細胞形態(tài)，并采用CCK-8法檢測細胞存活率。每個染毒組設(shè)置3個平行孔。

1.4CCK-8法檢測細胞存活率AFB1染毒結(jié)束后，按照CCK-8試劑盒說明書檢測細胞存活率。每孔加入10 μl CCK-8試劑，于細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h。使用酶標儀在檢測波長450 nm、參比波長630 nm處分別測定每孔吸光度值，并計算細胞存活率。細胞存活率(%)=(樣品A630 nm-樣品A450 nm)/(對照A630 nm-對照A450 nm)×100

1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1細胞形態(tài)學(xué)觀察AFB1染毒后，通過倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)，對照組中HSF細胞形態(tài)正常，貼壁生長，呈長梭形，滿視野生長，排列緊密。AFB1處理HSF細胞后，細胞形態(tài)無改變，貼壁生長，但細胞數(shù)量減少。隨AFB1染毒濃度、染毒時間的增加，細胞數(shù)量越來越少。100 μmol/LAFB1處理15天后，細胞數(shù)量減少約40%；當AFB1濃度增加到200 μmol/L時，細胞數(shù)量僅有對照孔的10%(圖1)。這表明隨著AFB1染毒濃度和時間的增加，HSF細胞增殖活性越低。

圖1 AFB1對HSF細胞生長抑制作用

2.2AFB1對HSF細胞毒性作用觀察細胞形態(tài)變化后，進一步用CCK-8法對AFB1染毒后的細胞存活情況進行定量檢測。100、200、300、400 μmol/LAFB1處理細胞5天后，100、200 μmol/LAFB1處理的細胞存活率和對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)，但300、400 μmol/LAFB1處理的細胞存活率低于對照組(P< 0.05)。隨著染毒時間的增加，細胞存活率越來越低。100 μmol/LAFB1染毒15天后，細胞存活率不到40%；當AFB1濃度增加到200 μmol/L時，細胞存活率僅有10.8%。見表1。

表1 CCK-8定量分析AFB1染毒后HSF細胞存活率 (%)

*與對照組比較，P< 0.05

3 討論

AFB1具有極強的毒性和致癌性，廣泛存在于各種糧食食品和飼料中，對人類健康構(gòu)成了嚴重的威脅[8～11]。研究表明AFB1對肝臟、腎臟、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等都具有一定的毒性，能夠造成相應(yīng)細胞損傷[12～14]。然而，AFB1對皮膚的毒性作用鮮有報道，更是尚未有AFB1對原代分離培養(yǎng)的皮膚細胞毒性作用的報道。本實驗采用原代皮膚成纖維細胞作為實驗細胞株，研究AFB1對皮膚細胞的毒性作用。原代培養(yǎng)的細胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上相似性大，能更好地反應(yīng)AFB1對人體皮膚的毒性效應(yīng)。該研究可為暴露于AFB1污染環(huán)境的人群提供一定價值，以及為AFB1皮膚損傷作用的研究提供參考。

本研究發(fā)現(xiàn)，AFB1對HSF細胞具有明顯的細胞毒性作用。隨著AFB1染毒濃度和染毒時間的增加，細胞增殖活性減弱。已有多項研究報道了AFB1對多種其他體外培養(yǎng)細胞的毒性損傷作用。Ribeiro等研究發(fā)現(xiàn)AFB1對體外培養(yǎng)的肝細胞具有損傷作用，染毒劑量增加后，細胞大量凋亡而死亡[15]。Golli-Bennour等發(fā)現(xiàn)AFB1能使P53表達上調(diào)、Bcl-2表達下調(diào)，從而引起猴胚腎細胞核斷裂、細胞死亡[7]。Lewis和Palanee等通過MTT法分別定量檢測了AFB1對人食管上皮細胞和人非小細胞肺癌的毒性作用[16，17]。這些研究結(jié)果都表明AFB1通過引起細胞死亡對相應(yīng)的體外培養(yǎng)細胞產(chǎn)生毒性效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，AFB1不引起HSF細胞死亡，而是通過引起HSF細胞生長抑制、增殖能力減弱產(chǎn)生毒性效應(yīng)。這提示AFB1對人皮膚細胞產(chǎn)生損傷作用的機制可能不同，值得進一步研究。

[1] Yang XJ，Lu HY，Li ZY，et al.Cytochrome P450 2 A13 mediates aflatoxin B1-induced cytotoxicity and apoptosis in human bronchial epithelial cells[J].Toxicology，2012，300(3)：138-148.

[2] Storvik M，Huuskonen P，Kyllonen T，et al.Aflatoxin B1--a potential endocrine disruptor--up-regulates CYP19 A1 in JEG-3 cells[J].Toxicol Lett，2011，202(3)：161-167.

[3] Liu R，Jin Q，Huang J，et al.In vitro toxicity of aflatoxin B1 and its photodegradation products in HepG2 cells[J].J Appl Toxicol，2012，32(4)：276-281.

[4] Lei M，Zhang N，Qi D.In vitro investigation of individual and combined cytotoxic effects of aflatoxin B1 and other selected mycotoxins on the cell line porcine kidney 15[J].Exp Toxicol Pathol，2013，65(7-8)：1149-1157.

[5] Bernabucci U，Colavecchia L，Danieli PP，et al.Aflatoxin B1 and fumonisin B1 affect the oxidative status of bovine peripheral blood mononuclear cells[J].Toxicol In Vitro，2011，25(3)：684-691.

[6] He CH，F(xiàn)an YH，Wang Y，et al.The individual and combined effects of deoxynivalenol and aflatoxin B(1)on primary hepatocytes of Cyprinus carpio[J].Int J Mol Sci，2010，11(10)：3760-3768.

[7] Golli-Bennour EE，Kouidhi B，Bouslimi A，et al.Cytotoxicity and genotoxicity induced by aflatoxin B1，ochratoxin A，and their combination in cultured Vero cells[J].J Biochem Mol Toxicol，2010，24(1)：42-50.

[8] Clarke R，Connolly L，F(xiàn)rizzell C，et al.High content analysis： a sensitive tool to detect and quantify the cytotoxic，synergistic and antagonistic effects of chemical contaminants in foods[J].Toxicol Lett，2015，233(3)：278-286.

[9] Qureshi H，Hamid SS，Ali SS，et al.Cytotoxic effects of aflatoxin B1 on human brain microvascular endothelial cells of the blood-brain barrier[J].Med Mycol，2015，53(4)：409-416.

[10]Zhang J，Zheng N，Liu J，et al.Aflatoxin B1 and aflatoxin M1 induced cytotoxicity and DNA damage in differentiated and undifferentiated Caco-2 cells[J].Food Chem Toxicol，2015，83：54-60.

[11]Forouharmehr A，Harkinezhad T，Qasemi-Panahi B.Effect of Aflatoxin B1 on Growth of Bovine Mammary Epithelial Cells in 3D and Monolayer Culture System[J].Adv Pharm Bull，2013，3(1)：143-146.

[12]Zimmermann CE，Cruz IB，Cadona FC，et al.Cytoprotective and genoprotective effects of beta-glucans against aflatoxin B(1)-induced DNA damage in broiler chicken lymphocytes[J].Toxicol In Vitro，2015，29(3)：538-543.

[13]Sun LH，Lei MY，Zhang NY，et al.Individual and combined cytotoxic effects of aflatoxin B1，zearalenone，deoxynivalenol and fumonisin B1 on BRL 3 A rat liver cells[J].Toxicon，2015，95：6-12.

[14]Clarke R，Connolly L，F(xiàn)rizzell C，et al.Cytotoxic assessment of the regulated，co-existing mycotoxins aflatoxin B1，fumonisin B1 and ochratoxin，in single，binary and tertiary mixtures[J].Toxicon，2014，90：70-81.

[15]Ribeiro DH，F(xiàn)erreira FL，da Silva VN，et al.Effects of aflatoxin B(1) and fumonisin B(1) on the viability and induction of apoptosis in rat primary hepatocytes[J].Int J Mol Sci，2010，11(4)：1944-1955.

[16]Lewis CW，Smith JE，Anderson JG，et al.Increased cytotoxicity of food-borne mycotoxins toward human cell lines in vitro via enhanced cytochrome p450 expression using the MTT bioassay[J].Mycopathologia，1999，148(2)：97-102.

[17]Palanee T，Dutton MF，Chuturgoon AA.Cytotoxicity of aflatoxin B1 and its chemically synthesised epoxide derivative on the A549 human epithelioid lung cell line[J].Mycopathologia，2001，151(3)：155-159.

CytotocixityofaflatoxinsB1onprimaryhumanskinfibroblastcells

LIUShan1，LUOZhong-qiu2，TANHong3

(1.DepartmentofClinicalLaboratory，SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople’sHospital，Chengdu610072，China；2.SchoolofMedicalScienceandTechnology，ChengduUniversityofTCM，Chengdu610031，China；3.DepartmentofGeneralSurgery，theFirstPeople’sHospitalofChengdu，Chengdu610041，China)

TANHong

ObjectiveTo investigate the cytotoxicity of aflatoxin B1(AFB1) on primary human skin fibroblast cells (HSF).MethodsPrimary HSF cells were isolated，cultured and treated with AFB1at different concentrations.The morphological changes were observed.Cell viability was measured by CCK-8 kit.ResultsAFB1could inhibit the growth of HSF cells.Cell viability was decreased with the increase of exposed dose and time.When HSF cells were treated with AFB1at concentrations of 100 μmol/L and 200 μmol/L for 15 d，62.4% and 89.2% of cell growth was inhibited，respectively.ConclusionAFB1exhibits significantly cytotoxic effects on HSF cells.

Aflatoxins B1；Primary human skin fibroblast cells；Cytotoxicity

譚 洪

R446.5

A

1672-6170(2017)05-0030-03

2017-02-06；

2017-04-24)