仙人草多糖提取及分離純化工藝研究

吉惠杰，曹雪玲，鄭鳳梅，沈啟慧，呂 洋，于麗穎*

（1.吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022；2.吉林石化煉油廠，吉林 吉林 132000）

仙人草多糖提取及分離純化工藝研究

吉惠杰1，曹雪玲1，鄭鳳梅2，沈啟慧1，呂 洋1，于麗穎1*

（1.吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022；2.吉林石化煉油廠，吉林 吉林 132000）

選取仙人草為原料，采用微波輔助水提法對仙人草粗多糖進(jìn)行提取。單因素試驗考察微波功率、提取劑用量、提取時間、提取次數(shù)及提取溫度對其粗多糖提取率的影響，利用正交試驗優(yōu)化提取工藝。結(jié)果表明：仙人草粗多糖最佳提取工藝條件為提取溫度80℃、料液比(g·mL-1)1∶40、微波功率350 W、提取時間45 min，此條件下仙人草中粗多糖的平均提取率為2.40%。仙人草粗多糖經(jīng)Sevage法脫蛋白，并利用SephadexG-200葡聚糖凝膠層析柱對其提取物分離純化,得到3個主要的多糖組分。

仙人草；多糖；微波提取；分離純化

仙人草（Mesona Chinensis.Benth）為唇形科涼粉草屬（Mesona Chinensis）草本植物，又名涼粉草、仙草，分布于印度、東南亞及我國廣東、福建、廣西等地[1]，是我國一種重要的藥用植物[2]。

仙人草主要含有多糖、黃酮類化合物、酚類、齊墩果酸、熊果酸、α-香樹精、β-香樹精、果膠、色素（花青素）、氨基酸、揮發(fā)性油[3-4]等多種生物活性成分。多糖（Polysaccharides，PS）又稱多聚糖，是由10個以上的單糖分子通過糖苷鍵聚合而成，有些多糖無生物活性，如淀粉、樹膠和黏液質(zhì)等，而具有藥效作用的大多是活性多糖。仙人草多糖為酸性雜多糖，主要為半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸，具有調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤、抗氧化、降血脂、降血糖、抗輻射、保護(hù)肝臟[5-10]等作用，也可作為食品添加劑，制成各種保健食品或功能性食品[11]。

植物多糖提取方法[12-19]有熱水浸提法（該法破細(xì)胞壁效果不好、提取率不高）、堿液浸提法（堿性較強會水解）、微波水提法及超聲輔助水提法（對多糖破壞小、溶劑用量少、成本低、得率高）、生物酶提取法（條件溫和、分解植物組織、加速多糖釋放，但試劑成本高）。這些方法提取出的粗多糖含雜質(zhì)且多糖為混合物需分離純化為單一多糖[20-25]。本研究嘗試微波輔助水提法提取仙人草粗多糖并優(yōu)化其提取工藝，對粗多糖進(jìn)行脫蛋白質(zhì)、脫色素，采用葡聚糖凝膠柱層析分離純化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

仙人草為干燥全草，購于廣東省長壽蕉嶺仙人草種植基地；考馬斯亮藍(lán)G-250、SephadexG-200葡聚糖凝膠、無水乙醇、石油醚、三氯甲烷、正丁醇、苯酚、濃硫酸、無水葡萄糖、氯化鈉、濃磷酸，均為國產(chǎn)分析純；試驗用水為雙蒸水。

1.2 儀器與設(shè)備

CW2000-A型超聲-微波協(xié)同萃取反應(yīng)儀：上海新拓分析儀器科技有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；TU-1950型雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器責(zé)任有限公司；FA2005N型電子分析天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；TS-200B型恒溫振蕩培養(yǎng)搖床：上海天呈儀器制造有限公司；H2050R型離心機：湖南湘儀實驗儀器有限公司；葡聚糖凝膠柱：北京夢怡美生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 仙人草樣品的制備

1.3.1.1 仙人草樣品的提取

仙人草的產(chǎn)地、品種、提取方法都影響仙人草多糖的含量[18]，因此原料的選擇對仙人草的提取率影響很大。試驗選擇廣東省長壽蕉嶺仙人草種植基地的全草作為研究對象。

仙人草粉碎過40目篩，在燒瓶中加入一定量的石油醚加熱回流3 h進(jìn)行脫脂脫色素，待用。準(zhǔn)確稱取5.0 g干燥仙人草以一定料液比置于微波反應(yīng)儀中，通過改變提取時間、微波功率、料液比、提取次數(shù)及提取溫度進(jìn)行提取。微波提取后過濾，收集濾液，連續(xù)提取2次，合并收集濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮提取液，得仙人草粗多糖提取液。

1.3.1.2 脫蛋白

采用 Sevage法脫蛋白，多糖樣品中蛋白質(zhì)含量的測定參照Bradford[26]的方法略作修改，該方法操作簡單，是常用的去除蛋白的有效方法[27]。

1.3.1.3 分步醇沉法

仙人草提取液濃縮至藥液比為1∶1～1∶2，加入適量乙醇使體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%，醇沉24 h過夜，得多糖沉淀。過濾后，除去析出的脂溶性成分，取上清液繼續(xù)加入乙醇使體積分?jǐn)?shù)達(dá)到85%，醇沉24 h過夜，得多糖沉淀，抽濾，除單糖、苷類、低聚糖，即得到沉淀為仙人草粗多糖。

1.3.2 粗多糖含量的測定

1.3.2.1 繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

稱取120℃干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖21.9 mg，加水溶解并定容至100 mL容量瓶中，即得葡萄糖貯備液。

精確量取貯備液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL分別置于25 mL容量瓶中，加入去離子水稀釋至刻度。取上述葡萄糖對照品溶液各2.0 mL，加入4%苯酚1.0 mL，迅速加入7.0 mL濃硫酸，搖勻，于40℃水浴放置30 min后，冷卻至室溫。以空白為對照，在最大波長489 nm處測定吸光度值。以質(zhì)量濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，建立線性方程：A=0.045 7 C+0.009，r=0.999 3。

1.3.2.2 仙人草粗多糖含量的測定

精確吸取仙人草提取液適量于10 mL容量瓶中，按1.3.2.1所述方法測定，以試劑空白做對照，在波長489 nm處測吸光度，通過線性方程計算提取液中粗多糖質(zhì)量濃度，計算仙人草總多糖提取率。

多糖提取率=仙人草多糖質(zhì)量/仙人草質(zhì)量。

1.3.3 粗多糖蛋白質(zhì)測定

1.3.3.1 考馬斯亮藍(lán)溶液的配制

稱取100 mg考馬斯亮藍(lán) G－250溶于5 mL 90%乙醇，再加入85%磷酸10 mL，定容于100 mL容量瓶中，即得考馬斯亮藍(lán)溶液。

1.3.3.2 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取牛血清白蛋白10 mg，用去離子水溶解，定容至10 mL，吸取5 mL定容于50 mL容量瓶中，即得100 μg/mL的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.3.3 繪制牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

吸取 100 μg/mL的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 分別置于 10 mL 容量瓶中，加入去離子水至1.0 mL。加入考馬斯亮藍(lán)G－250溶液5 mL，混勻，放置2 min后于紫外分光光度計595 nm處測定吸光度值。以蛋白質(zhì)含量（μg）為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸分析，建立線性方程：A=0.065C+0.059 8，r=0.999 0。

1.3.3.4 仙人草粗多糖蛋白質(zhì)測定

配制適當(dāng)濃度的粗多糖溶液，準(zhǔn)確吸取1.0 mL，加入考馬斯亮藍(lán) G－250溶液5 mL，混勻，放置2 min后于紫外分光光度計595 nm處測定吸光度值。參照楊培民[28]的方法略作修改，計算多糖保留率和蛋白脫除率。

多糖保留率=脫蛋白后多糖質(zhì)量/粗多糖中多糖質(zhì)量。

蛋白脫除率=（去除蛋白前的質(zhì)量－去除蛋白后的質(zhì)量）/去除蛋白前的質(zhì)量。

1.3.4 葡聚糖凝膠柱柱層析分離

粗多糖進(jìn)行脫蛋白質(zhì)、脫色素后得到的仍是粗多糖，它們?yōu)楹胁煌肿淤|(zhì)量的幾種多糖，需進(jìn)一步對其組分進(jìn)行分離提純。凝膠柱層析法為活性多糖純化最常用的方法。洗脫液為不同濃度的鹽溶液。

1.3.4.1 葡聚糖凝膠預(yù)處理

稱取Sephadex G－200干粉5.0 g，加入適量蒸餾水，沸水浴進(jìn)行溶脹3 h。冷卻后用蒸餾水洗2～3次，進(jìn)行濕法裝柱，用蒸餾水平衡24 h備用。

1.3.4.2 葡聚糖凝膠裝柱與加樣

由于用以分離純化，選擇凝膠柱柱長與柱徑之比為20∶1，將柱垂直安裝固定，加入1/3柱體積蒸餾水，用玻璃棒邊攪勻邊將溶脹好的葡聚糖凝膠連續(xù)裝入柱內(nèi)，在柱內(nèi)自然沉降，同時使蒸餾水從下口慢速流出。凝膠必須均勻裝柱，不能有氣泡或明顯條紋。裝好柱子后，用蒸餾水平衡2～3 h，可將樣品分離。

1.3.4.3 樣品上樣洗脫

稱取純化后的仙人草粗多糖80 mg，用 10 mL蒸餾水充分溶解后上樣。向柱內(nèi)緩慢加入多糖溶液， 用 125 mL 蒸餾水和 0.01、0.03、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.3、2.5、2.7、3.0、3.3 mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，流速1.5 mL/min，分步收集餾分裝瓶（6 min/瓶），根據(jù)苯酚－硫酸法顯色反應(yīng)結(jié)果合并相同餾分，以收集的管數(shù)為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波輔助提取仙人草粗多糖單因素試驗

2.1.1 提取次數(shù)對粗多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5.0 g過60目篩的仙人草粉，按料液比1∶40 g/mL加入蒸餾水，每次提取60 min，提取溫度80℃，提取次數(shù)分別為1、2、3次，提取次數(shù)對仙人草粗多糖提取率的影響見圖1。

圖1 提取次數(shù)對粗多糖提取率的影響Fig.1 Effect of extraction times on extraction rate of crude polysaccharides

由圖1可知，當(dāng)提取次數(shù)為2次時仙人草多糖提取率最高。增加提取次數(shù)，多糖提取率明顯下降。再增加提取次數(shù)耗費試劑，綜合考慮，仙人草多糖提取2次時效果最佳。

2.1.2 微波功率對粗多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5.0 g過60目篩的仙人草粉，料液比1∶40 g/mL，提取2次，提取溫度80℃，每次提取60 min，微波功率分別為250 W、350 W、450 W、550 W，微波功率對仙人草粗多糖提取率的影響見圖2。

圖2 微波功率對粗多糖提取率的影響Fig.2 Effect of microwave power on extraction rate of crude polysaccharides

由圖2可知，當(dāng)微波功率250 W時，總多糖的提取率很低，隨著微波功率上升至350 W時，總多糖提取率上升得非常明顯，仙人草多糖提取率最高，微波功率加大，物質(zhì)吸收的微波能越多，細(xì)胞破壁效果就越好，有利于活性物質(zhì)的溶出。而后，當(dāng)微波功率繼續(xù)上升時，提取率下降。故當(dāng)微波功率為350 W時，仙人草多糖的提取效果最佳。

2.1.3 料液比對粗多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5.0 g過60目篩的仙人草粉，提取2次，提取溫度80℃，每次提取60 min，微波功率為350 W，料液比分別為 1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 （g/mL），料液比對仙人草粗多糖提取率的影響見圖3。

圖3 料液比對粗多糖提取率的影響Fig.3 Effect of material－to－liquid ratio on extraction rate of crude polysaccharides

由圖 3可知，料液比為 1∶30（g/mL）時仙人草多糖提取率最高。料液比偏小時，固液相中有效成分的濃度差偏少，隨著料液比的增大，提取過程中兩相濃度差增大，傳質(zhì)速度加快，多糖在溶劑中的量不斷增加。當(dāng)料液比增加到一定程度時，雖然兩相中有效成分的濃度差依然存在，但傳質(zhì)動力增加不大，因此多糖的提取率減小。從資源的有效利用及降低能耗兩方面考慮，選取仙人草多糖提取料液比為 1∶30（g/mL）。

2.1.4 提取時間對粗多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5.0 g過60目篩的仙人草粉，料液比 1∶30（g/mL），提取溫度 80 ℃，微波功率為 350 W，提取 2 次，提取時間分別為 30、45、60、75 min，提取時間對仙人草粗多糖提取率的影響見圖4。

由圖4可知，隨著提取時間的增加，多糖的提取率也隨之增加，當(dāng)提取60 min時，多糖的提取率最高，在45～60 min時，微波對細(xì)胞壁的破壞作用大，多糖溶出增多，提取率也相應(yīng)地增加，當(dāng)超過60 min后，細(xì)胞壁的過分破碎使溶解的雜質(zhì)相應(yīng)增多，溶劑幾乎飽和，提取時間過長會使多糖發(fā)生水解，提取率減小。故當(dāng)提取時間為60 min時，多糖的提取效果最佳。

圖4 提取時間對粗多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction duration on extraction rate of crude polysaccharides

2.1.5 提取溫度對粗多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5.0 g仙人草粉， 料液比1∶30（g/mL），提取溫度80℃，提取2次，每次提取60 min，微波功率為350 W，提取溫度分別為60℃、70℃、80℃、90℃，提取溫度對仙人草粗多糖提取率的影響見圖5。

圖5 提取溫度對粗多糖提取率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction rate of crude polysaccharides

由圖5可知，隨著提取溫度的升高，仙人草多糖提取率不斷增加，當(dāng)提取溫度到達(dá)80℃時，其提取率達(dá)到最高。之后提取溫度逐漸提高提取率反而下降，其原因與多糖穩(wěn)定性相關(guān)，高溫下導(dǎo)致多糖降解。提取溫度過高會破壞有效成分，影響多糖生物活性；提取溫度太低，不利于水分子和多糖分子擴散，影響多糖溶出。綜合考慮，確定仙人草多糖提取溫度為80℃。

2.2 微波輔助提取仙人草粗多糖正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以仙人草中粗多糖提取率為考察指標(biāo)，選擇提取溫度、料液比、提取時間、微波功率為考察因素，設(shè)計正交試驗，確定最佳工藝條件。

2.2.1 正交試驗設(shè)計

選擇L9（34）正交表優(yōu)化提取工藝，因素與水平見表 1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2.2.2 正交試驗結(jié)果與分析

以仙人草粗多糖提取率為考察指標(biāo)，正交試驗結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 正交試驗方案及結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal experiments

表3 方差分析結(jié)果Table 3 The results of variance analysis

由表2和表3可知，仙人草中多糖提取率受各因素影響的主次順序為B＞C＞A＞D，即料液比＞提取時間＞提取溫度＞微波功率。多糖提取率的最佳工藝條件為：提取溫度80℃、料液比1∶40 g/mL、提取時間45 min、微波功率350 W，在此條件下總多糖的提取率為2.33%。

2.3 最佳工藝驗證性試驗

根據(jù)正交試驗的最佳工藝條件，為進(jìn)一步考察最佳工藝的穩(wěn)定性和可行性，進(jìn)行3次驗證性試驗。得到仙人草粗多糖提取率分別為2.49%、2.31%、2.40%，3次驗證性試驗的平均提取率2.40%，高于正交試驗中的提取率，說明此工藝條件的穩(wěn)定性好，可行性強。

2.4 仙人草粗多糖的分離純化

2.4.1 分步醇沉法

當(dāng)乙醇的體積分?jǐn)?shù)在50%～60%時，會去除大量的雜質(zhì)，如淀粉、樹脂、黏液質(zhì)等成分，醇體積分?jǐn)?shù)為75%時，能去除鞣質(zhì)、水溶性色素等成分，醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%～85%時才會醇沉出粗多糖。體積分?jǐn)?shù)太高，醇沉雜質(zhì)大部分可以除去，但會包裹一部分有效成分，造成多糖的損失。體積分?jǐn)?shù)低了，雜質(zhì)除不盡；從而降低了有效成分在溶液中的含量。

2.4.2 Sevage法脫蛋白

在多糖溶液中加入氯仿－正丁醇（體積比4∶1），混合溶液在恒溫?fù)u床中充分振搖，重復(fù)7次，游離蛋白變性成不溶物除掉，經(jīng)多次操作將大部分蛋白除去。

圖6 Sevage法脫蛋白結(jié)果Fig.6 Removal of protein by Sevage method

由圖6可知，隨著處理次數(shù)的增加，蛋白質(zhì)脫除率隨之增加，可達(dá)80%以上；處理次數(shù)的增多會使多糖保留率降低，多糖的保留率近60%，之后趨于平穩(wěn)。Sevage法脫蛋白的方法較為溫和，對多糖的結(jié)構(gòu)影響不大，使多糖的損失小，適宜仙人草粗多糖的脫蛋白處理，效果較好。

2.4.3 葡聚糖凝膠柱層析

多糖溶液加入到層析柱端，進(jìn)入填料后，色帶集中在填料頂部，當(dāng)洗脫液NaCl的濃度較大時，發(fā)現(xiàn)有部分色素下移，不久后收集到的洗脫液呈現(xiàn)微黃色。

2.4.4 柱層析洗脫曲線

利用葡聚糖凝膠柱層析對仙人草多糖進(jìn)行了初步的分離純化，洗脫曲線見圖7。從圖7可以看出，經(jīng)水和NaCl溶液梯度洗脫后，仙人草粗多糖分離得到3個主要組分，依次分別是水洗脫的組分、0.1 mol/L NaCl溶液洗脫組分和0.3 mol/L NaCl溶液洗脫組分。當(dāng)出現(xiàn)洗脫峰時，沒有加入洗脫液，使多糖不能被洗脫液洗脫，被洗脫下來的多糖較少，隨著洗脫液的增加，大量多糖陸續(xù)被洗脫下來。洗脫液不能低于柱床的頂端，使凝膠顆粒浸泡在水中，否則影響洗脫效果。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，選擇0.1 mol/L NaCl作為洗脫劑，抑制凝膠吸附作用強，可有效減輕洗脫峰拖尾現(xiàn)象。只收集峰尖位置幾管洗脫液，合并后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮液經(jīng)真空冷凍干燥即可得到純化的多糖樣品。

圖7 柱層析洗脫曲線Fig.7 Column chromatography elution curve

3 結(jié)論

通過單因素試驗和正交試驗確定微波輔助水提法提取仙人草粗多糖的最佳工藝條件為提取溫度80℃、料液比1∶40 g/mL、提取時間45 min、微波功率350 W，粗多糖的平均提取率為2.40%。

多糖提取物一般混有淀粉、樹脂、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，去除蛋白質(zhì)一般采用Sevage法、三氯乙酸法、酶解法。Sevage法脫蛋白相對其他方法較為溫和，不會對多糖大分子結(jié)構(gòu)造成影響。Sevage法是去除游離蛋白最有效的方法。

粗多糖經(jīng)葡聚糖凝膠層析柱分離純化，得到3個主要的多糖組分，分別是水洗脫的組分、0.1 mol/L NaCl溶液洗脫組分和0.3 mol/L NaCl溶液洗脫組分。通過測定其多糖含量，純度在85%～90%，如果需要做其活性和結(jié)構(gòu)的鑒定，應(yīng)該用葡聚糖凝膠柱再次進(jìn)行純化。

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STUDY ON EXTRACTION AND PURIFICATION TECHNOLOGY OF POLYSACCHARIDE FROM MESONA CHINENSIS

JI Huijie1， CAO Xueling1， ZHENG Fengmei2， SHEN Qihui1， LU Yang1， YU Liying1
（1.College of Chemical and Pharmaceutical Engineering， Jilin Institute of Chemical Technology， Jilin 132022，China；2.Jilin Petrochemical Refinery， Jilin 132000，China）

In thisstudy， crude polysaccharide wasextracted from raw materialMesona chinensisusing microwave－assisted water method.In order to evaluate the extraction efficiency of crude polysaccharide，the factors including microwave power， amount of extraction solvent，extraction time，extraction times and temperature were selected and their effects on the extraction yield of crude polysaccharides were investigated and the orthogonal experiment was used to optimize extraction process.The results showed that the optimal extraction conditions were as follows:extraction temperature was 80 ℃， solid/liquid ratio was 1∶40 g·mL－1， microwave power was 350 W and extraction time was 45 min.Under these optimal conditions，the average extraction ratio of crude polysaccharide was 2.40%.Afterwards，proteins in crude polysaccharide were removed by sevage method.Then the polysaccharide was isolated and purified by Sephadex G －200 gel chromatography， three polysaccharide fractions eluted obtained respectively.

Mesona chinensis；total polysaccharide；microwave extraction；separation and purification

TS201.2

：B

1673-2383(2017)04-0064-06

http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20170828.0857.024.html

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2017-8-28 8:57:21

2017-01-05

吉惠杰（1973—），女，吉林省吉林市人，高級實驗師，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)成分的提取與分離及生物活性的研究。

*通信作者