采用分散固相萃?。咝б合嗌V－串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定鵪鶉蛋及肉中多種喹諾酮類藥物殘留

楊盛茹，姚喜梅，丁長河，張 煌，鄒 建*

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院 食品工程學院，河南 鄭州 450046；2.中國標準化協(xié)會，北京 100048；3.河南工業(yè)大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001）

采用分散固相萃?。咝б合嗌V－串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定鵪鶉蛋及肉中多種喹諾酮類藥物殘留

楊盛茹1，姚喜梅2，丁長河3，張 煌1，鄒 建1*

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院 食品工程學院，河南 鄭州 450046；2.中國標準化協(xié)會，北京 100048；3.河南工業(yè)大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001）

應用分散固相萃?。咝б合嗌V－串聯(lián)質(zhì)譜建立鵪鶉蛋及肉中22種喹諾酮類藥物殘留的檢測方法。樣品經(jīng)過酸化乙腈提取，以氨丙基硅膠為凈化劑進行基質(zhì)分散固相凈化，經(jīng)Acquity UPLC BEH Shield RP18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）分離，以甲醇和 0.1%甲酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，雙通道MRM信號采集模式，22種喹諾酮類藥物能在9 min內(nèi)快速分離，方法的最低定量限均低于10.0 μg/kg，在10.0～50.0 μg/kg范圍內(nèi)，22種喹諾酮類藥物線性良好，相關系數(shù)均在0.99以上；對10、20、50 g/kg 3個水平的加標回收試驗表明，鵪鶉蛋中喹諾酮類藥物殘留的回收率在60.3%～113%，RSD值為0.750%～12.7%，鵪鶉肉中喹諾酮類藥物殘留的回收率在64.9%～111%，RSD值為0.450%～10.1%。該方法前處理簡單，結果準確可靠，能全面篩查和確證鵪鶉蛋及肉中多種喹諾酮類藥物殘留，對防范非法添加，保障消費者食品安全具有一定的參考價值。

鵪鶉蛋；組織；喹諾酮類；分散固相萃??；UPLC－MS/MS

0 前言

鵪鶉肉味甘、性平，可補中益氣、清利濕熱。鵪鶉蛋含有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、多種維生素和鈣、磷、鐵等礦物質(zhì)，其豐富的卵磷脂和腦磷脂，具有健腦的作用，適宜嬰幼兒、孕產(chǎn)婦、老人、病人及身體虛弱的人食用，但鵪鶉養(yǎng)殖具有飼養(yǎng)密度大、飼養(yǎng)周期短、疾病傳染快的特點，為預防和治療大腸桿菌類疾病，首選使用喹諾酮類藥物，而養(yǎng)殖過程中喹諾酮類藥物的不規(guī)范使用，導致動物產(chǎn)品中殘留喹諾酮類藥物，長期食用還會產(chǎn)生細菌耐藥性問題，尤其對嬰幼兒、孕產(chǎn)婦和年老體弱者存在極大安全隱患[1]。

歐盟規(guī)定動物肌肉、肝臟和腎臟中達氟沙星、二氟沙星、恩諾沙星（環(huán)丙沙星與恩諾沙星量之和）、麻保沙星、沙拉沙星等的最大殘留量為0.01～1.9 mg/kg；美國禁止在食用動物養(yǎng)殖中使用FQNs（氟喹諾酮類）；2002年我國農(nóng)業(yè)部第235號公告中對動物性食品中獸藥最高殘留限量進行了要求，其中對喹諾酮藥物在動物性食品中殘留限量進行了規(guī)定，2015年農(nóng)業(yè)部第2292號公告決定在食品動物中停止使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種獸藥，隨著對喹諾酮類藥物禁用藥物范圍的擴大，新型喹諾酮藥物用于動物生產(chǎn)的風險也越來越大。目前雞蛋和雞肉中喹諾酮類藥物殘留檢測文獻較多[2－6]，但藥物種類較少，未涵蓋吉米沙星、加雷沙星等新型喹諾酮類藥物，還未見鵪鶉肉和蛋中多種喹諾酮類藥物殘留同時檢測的報道，因此建立適用于鵪鶉蛋及肉中多種喹諾酮類藥物殘留同時檢測的方法勢在必行。

筆者建立鵪鶉蛋及肉中22種喹諾酮類藥物的超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，方法靈敏度高，穩(wěn)定性好，22種喹諾酮類藥物能在9 min內(nèi)快速分離，方法最低定量限均低于10.0 μg/kg，方法可滿足鵪鶉蛋及肉中多種喹諾酮類藥物殘留同時檢測的要求。

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材

加雷沙星 （Garenoxacin）， 曲伐沙星（Trovafloxacin），莫西沙星（Moxifloxacin），奧比沙星（Orbifloxacin），吉米沙星（Gemifloxacin），加替沙星（Gatifloxacin），氟羅沙星（Fleroxacin），馬波沙星（Marbofloxacin），那氟沙星（Nadifloxacin），氟甲喹（Flumequine）， 諾氟沙星 （Norfloxacin）， 吡哌酸（Pipemidic acid），萘啶酸（Nalidixic acid），培氟沙星（Pefloxacin），環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin），氧氟沙星（Ofloxacin），恩諾沙星（Enrofloxacin），達氟沙星（Danofloxacin），洛美沙星（Lomefloxacin），二氟沙星（Difloxacin），司帕沙星（Sparfloxacin spara），沙拉沙星（Sarafloxacin）購于德國 Dr.Ehrenstorfer公司，純度均在97%以上；乙腈、甲醇、乙酸、甲酸、正己烷等有機溶劑均為色譜純，購自美國Fisher公司；凈化劑：PSA、C18、GCB、氨丙基硅膠、弗羅里硅土等凈化劑購自博納艾杰爾科技公司；濾膜：兩款Syringe Filter,PTFE,0.2 μm分別購于美國 Waters公司和Agilent公司，0.22 μm有機尼龍膜和聚醚砜膜購于天津津騰實驗設備有限公司。

將標準品及內(nèi)標用甲醇配成單標母液，并配制10 μg/mL混合儲備液于－20℃保存，使用時現(xiàn)配成系列標準工作液；鵪鶉蛋及肉購于農(nóng)貿(mào)市場，經(jīng)LC－MS/MS分析確認為陰性樣本。

1.2 儀器設備

超高效液相色譜儀（Acquity UPLC）配三重四級桿質(zhì)譜儀（quattro premier XE）：美國Waters公司；3K15型離心機：美國Sigma公司；純水儀：美國Millipore公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 前處理過程

準確稱取經(jīng)勻質(zhì)的鵪鶉蛋或肉樣5 g于50 mL離心管中，加入15 mL 2%甲酸乙腈（肉樣需加入5 mL水），3 g無水硫酸鎂和1 g無水乙酸鈉，振蕩混合5 min，超聲10 min，9 500 r/min離心5 min，準確量取6 mL上清液加入200 mg氨丙基硅膠基質(zhì)填料作為凈化劑（肉樣需加入1.5 g無水硫酸鎂），振蕩 10 min，9 500 r/min離心 5 min。準確量取上清液3 mL，50℃氮氣吹至近干，1 mL初始流動相定容，0.22 μm濾膜過濾待上機測定。

1.3.2 液相條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH Shield RP18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流速：0.25 mL/min；流動相A:甲醇，B:0.1%甲酸水溶液，0～5 min，10%A 線性變化至 35%；5～8 min，35%A 線性變化至 90%；8～8.5 min，90%A 保持不變；8.5～8.6 min，90%A 線性變化至10%；8.6～9 min，10%A保持不變。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電離模式：ESI+；毛細管電壓：3.0 kV；萃取錐孔電壓：3 V；RF透鏡電壓：0.5 V；源溫：110 ℃；脫溶劑溫度：350℃；錐孔氣流速：50 L/h；脫溶劑氣流速：550 L/h；碰撞氣流速：0.18 mL/min；采集模式：雙通道MRM；各種藥物優(yōu)化母離子和子離子及對應聚焦電壓和碰撞電壓值見表1。

2 結果與討論

2.1 不同濾膜對喹諾酮類藥物的吸附研究

影響回收率的因素貫穿整個前處理過程，而上機前過濾是保護儀器、去除雜質(zhì)的關鍵步驟，因此濾膜的選擇對整個前處理過程至關重要?？疾炝薟aters PTFE膜、Agilent PTFE膜、津騰聚醚砜膜和有機尼龍膜4種適用于絕大多數(shù)有機溶劑和水溶液的濾膜對20 μg/L混合標準溶液的吸附影響，結果見圖1。由圖1可見，有機尼龍膜和Aglient PTFE濾膜對那氟沙星吸附較為嚴重，聚醚砜膜比Waters PEFT膜濾過性能更好，藥物吸附更少，因此試驗選取聚醚砜膜作為試驗用過濾膜。

2.2 不同凈化材料對喹諾酮類藥物的吸附研究

分散固相萃取常用的凈化劑主要有N－丙基乙二胺（PSA）、C18、GCB、氨丙基硅膠、弗羅里硅土等，其中PSA和氨丙基硅膠能有效去除樣品基質(zhì)中的有機酸、色素和糖類雜質(zhì)；C18具有良好的除脂能力；而GCB和弗羅里硅土可吸附提取液中的色素成分。本試驗選取上述5種吸附凈化劑，對其凈化效果進行了考察，結果見圖2。由圖2可以看出，GCB和弗羅里硅土對喹諾酮類藥物的吸附尤其嚴重，除萘啶酸和氟甲喹外，其他藥物吸附率均在90%以上，C18對喹諾酮類藥物的吸附也較為嚴重，吸附率高于40%，相比之下，氨丙基硅膠吸附率最小、凈化效果最好。

試驗選擇 50、100、200、500 mg 4 個水平對氨丙基硅膠吸附凈化劑的用量進行優(yōu)化，結果表明，200 mg的氨丙基硅膠作吸附凈化劑時，提取液顏色較淺，回收率最佳。

2.3 樣品前處理過程優(yōu)化

喹諾酮類藥物易溶于極性和水溶性有機溶劑、酸、堿等溶液，動物性食品中喹諾酮類藥物提取劑有有機溶劑、酸性有機溶劑和緩沖鹽溶液[7－9]。本文通過在空白樣品添加10 μg/kg喹諾酮類混標溶

液，分別選取甲醇、乙腈和2%甲酸乙腈為提取溶劑處理樣品，結果表明：當甲醇為提取劑時，蛋白沉淀差，樣品整體較為渾濁，回收率較低；而乙腈及酸化乙腈為提取劑時，蛋白沉淀較完全，且酸化乙腈比純乙腈提取效率更好，原因主要為酸性條件有助于喹諾酮類藥物的溶解，因此選取2%甲酸乙腈作為最終提取溶劑，不同提取條件下的回收率見圖3。

表1 22種喹諾酮類藥物的檢測離子、對應質(zhì)譜參數(shù)及保留時間Table 1 Qualitative ions，relevant parameters and retention time of 22 kinds of quinolones

圖1 不同濾膜過濾時的回收率Fig.1 Recoveries were obtained by different filtration membranes

圖2 不同凈化條件下的回收率Fig.2 Recoveries under different purification conditions

圖3 不同提取溶劑的提取回收率Fig.3 Recoveries of different extraction solvents

試驗表明，針對鵪鶉肉樣本，需在加入提取液前，加入5 mL水，更有利于肉樣組織分散，使提取更為充分，在凈化過程中加入200 mg氨丙基硅膠的同時加入1.5 g無水硫酸鎂以便除去提取液中剩余的水分。

2.4 基質(zhì)效應研究

鵪鶉蛋樣本含有更多的卵磷脂、腦磷脂和核黃素，基質(zhì)成分復雜，因此設計基質(zhì)效應對照試驗，按照1.3.1方法處理空白鵪鶉蛋和鵪鶉肉樣本，制成含有20 μg/kg混合標準溶液的基質(zhì)加標溶液，與溶劑加標溶液進行比較，結果見圖4。由圖4可見，22種藥物均存在不同程度的基質(zhì)抑制作用，鵪鶉蛋中抑制率在4.1%～39.7%，鵪鶉肉中抑制率在6.2%～36.5%。因此在檢測過程中應采用基質(zhì)加標溶液來消除基質(zhì)效應的影響，不同藥物基質(zhì)抑制程度見圖4。

圖4 基質(zhì)效應Fig.4 Matrix effect in quail eggs and tissues

2.5 線性方程及靈敏度考察

采用鵪鶉蛋及肉樣品經(jīng)1.3.1方法處理，在5～50 μg/kg范圍內(nèi)分別添加喹諾酮類藥物混標溶液，配制梯度系列基質(zhì)加標溶液，依次進樣，以色譜峰面積為縱坐標，化合物含量為橫坐標做標準曲線，將處理好的空白鵪鶉蛋及肉樣品逐級稀釋標準溶液，按10倍信噪比確定方法的定量限（LOQ），結果見表 2。結果表明在 10～50 μg/kg范圍內(nèi)線性良好，相關系數(shù)均大于0.99。

表2 鵪鶉蛋及肉中22種喹諾酮類藥物線性系數(shù)及定量限值Table 2 Linear coefficients and the limits of quantitation of 22 quinolones in quail eggs and tissues

2.6 回收率試驗

取空白鵪鶉蛋及肉樣品，藥物添加量為10、20、50 μg/kg 3個水平的混標溶液，每組做6個平行，按1.3.1方法進行添加回收率試驗，結果見表3。鵪鶉蛋中回收率為 0.3%～113%，RSD值為0.750%～12.7%，鵪鶉肉中回收率為64.9%～111%，RSD值為0.450%～10.1%。

表3 鵪鶉蛋及肉中22種喹諾酮類藥物添加回收率和RSD值Table 3 Spiked recoveries and RSD of 22 kinds of quinolones in Quail eggs and tissues（n=6）

2.7 實際樣品檢測

使用建立的方法對全國農(nóng)貿(mào)市場抽檢的18份鵪鶉蛋和肉樣品進行測定，其中1份鵪鶉蛋樣品檢出恩諾沙星 21.4 μg/kg，檢出率為 5.56%。表明該方法適用于鵪鶉蛋及肉中喹諾酮類藥物的檢測，同時也表明鵪鶉蛋及肉中獸藥殘留安全隱患不容忽視。

3 結論

本試驗針對鵪鶉蛋及肉樣本，建立了包括吉米沙星、加雷沙星等新型喹諾酮藥物在內(nèi)的22種喹諾酮類藥物同時檢測的UPLC－MS/MS檢測方法。該方法操作簡單，穩(wěn)定性好，能夠滿足鵪鶉蛋及肉中喹諾酮類藥物殘留檢測要求，為保障鵪鶉制品的食品安全提供了技術參考。

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SIMULTANEOUS DETERMINATION OF QUINOLONES RESIDUES IN QUAIL EGGS AND TISSUE BY DISPERSIVE SOLID－PHASE EXTRACTION AND ULTRA PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY COMBINED WITH TANDEM MASS SPECTROMETRY

YANG Shengru1，YAO Ximei2，DING Changhe3，ZHANG Huang1，ZOU Jian1
（1.College of Food Engineering，Henan University of Animal Husbandry and Economy，Zhengzhou 450046，China；2.China Association for Standardization，Beijing 100018，China；3.School of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China）

A method for simultaneously detecting 22 kinds of quinolones in quail eggs and tissues was established by using dispersive solid－phase extraction and ultra performance liquid chromatography combined with tandem mass spectrometry (UPLC －MS/MS).Samples were extracted with acidified acetonitrile，then subjected to matrix dispersion solid －phase purification using aminopropyl silica gel as purifier，separated by Acquity UPLC BEH Shield RP18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，and eluted gradiently in the presence of methanol and 0.1 formic acid solution as the mobile phase，wherein signals were acquired by a dual－channel MRM signal acquisition mode.Results showed that the 22 kinds of quinolones could be separated rapidly in 9 minutes;the limit of quantification was less than 10 μg/kg;and the 22 kinds of quinolones had good linearity within 10.0 to 50.0 μg/kg，with correlation above 0.99.Recovery tests of 10，20 and 50 μg/kg showed that the recovery of quinolones in quail eggs was 60.3%to 113%，RSD 0.75%to 12.7%;and the recovery of quinolones in quail tissues was 64.9%to 111%，RSD 0.45%～10.1%.The method was simple in pretreatment，reliable in results，and can detect multiple kinds of quinolones residues in quail eggs and tissues completely，thereby providing reference for preventing illegal addition and ensuring food safety.

quail eggs；tissues；quinolones；dispersive solid－phase extraction；UPLC－MS/MS

TS207.3

：B

1673－2383(2017)04－0057－07

http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20170828.0857.022.html

網(wǎng)絡出版時間：2017－8－28 8:57:20

2016－12－14

河南省科技攻關項目（142102110178）

楊盛茹（1988—），女，河南商丘人，碩士，主要從事食品質(zhì)量安全研究。

*通信作者