玳玳果降脂提取物急性毒性試驗(yàn)研究

陳紅，馬國(guó)萍，陳丹，黃嬌，謝平，朱仙慕

（1.福建省立醫(yī)院干一科臨床老年病研究所，福建福州350001；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122）

玳玳果降脂提取物急性毒性試驗(yàn)研究

陳紅1，馬國(guó)萍2，陳丹2，黃嬌2，謝平2，朱仙慕2

（1.福建省立醫(yī)院干一科臨床老年病研究所，福建福州350001；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122）

目的觀察玳玳果降脂提取物小鼠急性毒性，初步評(píng)價(jià)其用藥安全性。方法取40只體質(zhì)量24～29 g昆明種小鼠，隨機(jī)分成給藥組與空白組各20只，雌雄各半，選用最大耐受量（MTD）法試驗(yàn)。給藥組按玳玳果降脂提取物可以灌胃的最大濃度（0.8 018 g／mL）及小鼠可承受的最大體積（0.4 mL／10 g）一次性口服灌胃，空白組蒸餾水（0.4 mL／10 g）灌胃。灌胃給藥1次，連續(xù)觀察14 d，記錄小鼠的毒性反應(yīng)、死亡情況。結(jié)果無法得出玳玳果降脂提取物L(fēng)D50；給藥后連續(xù)觀察14 d，小鼠未見中毒反應(yīng)，無動(dòng)物死亡；給藥14 d后解剖小鼠，肉眼未見臟器異常；臟器指數(shù)評(píng)價(jià)，2組比較無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)論小鼠灌胃給藥最大耐受劑量為32.07 g／kg，相當(dāng)于臨床成人日用量的285.07倍，提示玳玳果降脂提取物口服毒性小，臨床劑量下用藥安全。

玳玳果降脂提取物；最大耐受量；急性毒性試驗(yàn)

玳玳（Citrus aurantium L.var daidai Tanaka）屬蕓香科柑桔亞屬，為酸橙變種，藥食同源植物，在我國(guó)福建閩北、浙江、四川一帶廣為栽培。玳玳又稱代代，其果在民間作為蘇枳殼被應(yīng)用于中醫(yī)臨床，資源豐富且藥材相關(guān)不良反應(yīng)少，是一種具有廣泛開發(fā)應(yīng)用價(jià)值的藥用植物［1］。課題組以往研究表明：閩產(chǎn)玳玳果中含有黃酮、生物堿、揮發(fā)油等化學(xué)成分［2-4］，由其分離制備的玳玳果黃酮提取物具有良好的降脂抗氧化作用［5-8］。本研究根據(jù)中藥、天然藥物急性毒性研究的相關(guān)指導(dǎo)原則［9］，以最大給藥濃度和小鼠最大灌胃體積給藥，考察玳玳果降脂提取物的急性毒性反應(yīng)，評(píng)價(jià)其口服用藥安全性，為獲得質(zhì)量穩(wěn)定、安全的玳玳果降脂提取物提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 受試藥物玳玳果降脂提取物（總黃酮含量82.7%，批號(hào)20170405），實(shí)驗(yàn)室自制，取玳玳果藥材適量，6倍量75%乙醇回流提取3次，回收乙醇，減壓干燥，得玳玳果總黃酮粗提物；經(jīng)AB-8型大孔吸附樹脂純化，收集50%乙醇洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，得玳玳果總黃酮提取物。

1.2 動(dòng)物體質(zhì)量24～29 g昆明種小鼠60只，雌雄各半，清潔級(jí)，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，合格證編號(hào)：2015000520265。實(shí)驗(yàn)前均在福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，使用許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。

1.3 主要儀器ARA 520百分之一電子天平及AR 2140萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；100 mL三角燒瓶；50 mL燒杯；2 mL注射器。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料屬正態(tài)分布以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥液配制取玳玳果降脂提取物24.06 g，臨用時(shí)用30 mL蒸餾水溶解，配制成具有一定黏稠度的混懸液，黏稠度以灌胃針測(cè)試，至抽藥吸取較難但不至于無法吸取的程度為止，即得玳玳果降脂提取物的最大濃度藥液（0.8 018 g／mL）。

2.2 小鼠急性毒性LD50預(yù)實(shí)驗(yàn)取昆明種小鼠20只，雌雄各半，體質(zhì)量24～29 g，給藥前禁食不禁水16 h，灌胃給藥玳玳果降脂提取物藥液1次，按本品可以灌胃的最大濃度（0.8 018 g／mL），小鼠可承受的最大體積（0.4 mL／10 g）灌胃給藥，給藥后自由進(jìn)食和進(jìn)水，并連續(xù)觀察7 d，觀察小鼠死亡數(shù)、體征變化及生理反應(yīng)，擬找出100%死亡率，即Dm值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：各組小鼠無死亡，狀況良好，無明顯中毒反應(yīng)，無數(shù)據(jù)計(jì)算玳玳果降脂提取物L(fēng)D50，故實(shí)驗(yàn)選用玳玳果降脂提取物的最大耐受量（MTD）法試驗(yàn)。

2.3 玳玳果降脂提取物急性毒性MTD法實(shí)驗(yàn)取體質(zhì)量24～29 g昆明小鼠40只，隨機(jī)分為給藥組與空白組各20只，雌雄各半，給藥前禁食不禁水16 h，給藥組按提取物可以灌胃給藥的最大濃度（0.8 018 g／mL）、小鼠可承受的最大體積（0.4 mL／10 g）灌胃給藥，空白組蒸餾水灌胃（0.4 mL／10 g）。灌胃給藥1次。給藥當(dāng)天密切觀察4 h內(nèi)2組小鼠灌胃后的癥狀，給藥4 h后自由進(jìn)食進(jìn)水。連續(xù)觀察14 d，觀察記錄小鼠外觀、行為、分泌物、排泄物、中毒癥狀以及死亡情況；同時(shí)稱量給藥前后14 d內(nèi)的體質(zhì)量，觀察小鼠體質(zhì)量變化；若有小鼠死亡，立刻將死亡小鼠解剖，肉眼觀察小鼠各臟器；待第14天稱重后脫頸處死各組小鼠，肉眼觀察小鼠主要臟器組織是否有肉眼可見病變，若發(fā)現(xiàn)肉眼可見病變，則進(jìn)行病理組織形態(tài)學(xué)檢查；同時(shí)稱取2組小鼠的各臟器濕重，計(jì)算臟器指數(shù)。小鼠癥狀、體征觀察指標(biāo)見表1。

2.4 小鼠給藥后癥狀小鼠灌胃給藥后，密切觀察給藥當(dāng)天4 h內(nèi)各組小鼠的癥狀，并連續(xù)觀察14 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：給藥后30 min內(nèi)，小鼠靜臥抱團(tuán)，閉眼不動(dòng)，無叫聲異常、流涎、流涕、呼吸困難、腹瀉等現(xiàn)象；但30 min后，小鼠大多逐漸恢復(fù)正常活動(dòng)，在鼠籠內(nèi)攀爬竄動(dòng)，主動(dòng)進(jìn)食飲水；觀察14 d期間，小鼠排便恢復(fù)正常，由起初給藥后的黑灰色轉(zhuǎn)變?yōu)檎５亩裹S色，活動(dòng)自如，進(jìn)食良好，毛色正常，觀察期間無小鼠死亡。

2.5 小鼠體重變化小鼠給藥后，連續(xù)觀察14 d并稱取各組小鼠體重。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：觀察14 d期間給藥組小鼠體重正常增長(zhǎng)，與空白組比較，體重變化均無顯著性差異（P＞0.05），見表2。玳玳果降脂提取物MTD實(shí)驗(yàn)小鼠體重自身差異曲線圖見圖1、圖2。

表1小鼠癥狀、體征觀察指標(biāo)

圖1 MTD試驗(yàn)雄性小鼠體重變化圖

2.6 小鼠臟器指數(shù)小鼠在給藥后第14天稱取體重后，脫頸處死，進(jìn)行解剖，肉眼觀察心、肝、脾、胃、腎、胸腺等重要臟器變化，稱取各臟器濕重，計(jì)算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)＝臟器濕重（mg）／小鼠體重（g）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：小鼠實(shí)質(zhì)器官肉眼觀察大致正常，無心肺瘀血，無肝脾腫大；給藥組小鼠各主要臟器的質(zhì)地、顏色，與空白組小鼠各臟器的質(zhì)地、顏色比較無異常，2組臟器指數(shù)比較，無顯著性差異（P＞0.05），見表3。

3 討論

3.1 課題組以往研究表明：玳玳果含有黃酮等活性物質(zhì)，具有較好藥理和食療作用，由閩產(chǎn)玳玳果制備的玳玳果總黃酮提取物具有顯著的降脂、清除自由基及抗氧化作用，具有良好的藥用開發(fā)價(jià)值［2－4］。

3.2 預(yù)實(shí)驗(yàn)以玳玳果降脂提取物可以灌胃的最大濃度（0.8 018 g／mL），小鼠可承受的最大體積（0.4mL／10 g）灌胃給藥1次，連續(xù)觀察7 d，無Dm值（100%死亡率），故玳玳果降脂提取物的急性毒性試驗(yàn)選用最大耐受量（MTD）法。另外，給藥組小鼠在給藥后開始幾天，體重增加緩慢甚至減輕，主要原因是對(duì)小鼠的滿負(fù)荷灌胃導(dǎo)致的，經(jīng)過幾天適應(yīng)期后，小鼠體重逐漸恢復(fù)正常。

3.3 玳玳果降脂提取物小鼠急性毒性試驗(yàn)經(jīng)灌胃口服給藥未能測(cè)出玳玳果降脂提取物的LD50，根據(jù)《中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》［9］選用MTD法測(cè)定，結(jié)果表明：小鼠對(duì)玳玳果降脂提取物的最大耐受量為32.07 g／kg，玳玳果成人（體重以60 kg計(jì)）民間食用習(xí)慣的日口服最大劑量6.75 g／d，玳玳果降脂提取物的最大耐受量相當(dāng)于臨床用量的285.07倍。一般以小鼠最大給藥量相當(dāng)于成人臨床日用劑量的100倍以上為安全的［9］，提示玳玳果降脂提取物的毒性極低或基本無毒，規(guī)定劑量下口服用藥是安全的。

圖2 MTD試驗(yàn)雌性小鼠體重變化圖

表3 2組小鼠臟器指數(shù)比較（x±s）

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R285.5

A

1000-338X（2017）04-0037-03

2017-05-27

福建省醫(yī)學(xué)創(chuàng)新項(xiàng)目（2016-CX-45）；福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2010Y2004）。

陳紅（1966—），女，副主任醫(yī)師，主要從事老年病學(xué)研究。

陳丹（1961—），女，博士，教授。E-mail：gscd2@163.com