人參養(yǎng)榮湯對(duì)顱腦外傷大鼠TGF-β1／Smad信號(hào)通路相關(guān)因子的干預(yù)實(shí)驗(yàn)研究

賴躍平，陳建松，陳實(shí)

（廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院，福建福州350007）

人參養(yǎng)榮湯對(duì)顱腦外傷大鼠TGF-β1／Smad信號(hào)通路相關(guān)因子的干預(yù)實(shí)驗(yàn)研究

賴躍平，陳建松，陳實(shí)

（廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院，福建福州350007）

目的通過人參養(yǎng)榮湯干預(yù)大鼠顱腦外傷模型探討TGF-β1／Smad信號(hào)通路在顱腦創(chuàng)傷發(fā)生后的作用。方法建立大鼠顱腦外傷模型后，分為正常組、模型對(duì)照組（只做開顱重物擊傷）、實(shí)驗(yàn)組（開顱重物擊傷＋人參養(yǎng)榮湯），采用HE染色大鼠腦組織，ELISA法檢測血清中的Decorin、TGF-β1、Smad2、Smad3含量，Western Blot檢測腦組織中的TGF-β1、Smad2、Smad3、TF蛋白含量。結(jié)果HE染色顯示：模型對(duì)照組腦組織出現(xiàn)了較嚴(yán)重的皮質(zhì)與海馬神經(jīng)細(xì)胞變性、丟失，實(shí)驗(yàn)組次之；正常組血清中Decorin的表達(dá)最高，實(shí)驗(yàn)組次之，模型對(duì)照組最低，各組比較均有顯著性差異（P＜0.05）；TGF-β1、Smad2、Smad3、TF蛋白的表達(dá)，模型對(duì)照組最高，實(shí)驗(yàn)組次之，正常組最低，各組比較均有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)論人參養(yǎng)榮湯能通過TGF-β1／Smad信號(hào)通路改善顱腦創(chuàng)傷。

顱腦外傷；大鼠；人參養(yǎng)榮湯；TGF-β1／Smad信號(hào)通路

顱腦外傷是常見的神經(jīng)外科疾病，近年來隨著經(jīng)濟(jì)、交通的發(fā)展，我國顱腦外傷發(fā)生率及因顱腦外傷致死致殘的傷員逐年增加。有研究顯示：顱腦損傷后的神經(jīng)細(xì)胞損害及死亡主要是由于繼發(fā)炎性反應(yīng)所致［1］。在創(chuàng)傷后由于急性應(yīng)激，體內(nèi)短時(shí)間內(nèi)會(huì)分泌大量的TGF-β1，而過多的TGF-β1沉積又加重局部炎性反應(yīng)。Smad為TGF-β1的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白，TGF-β1／Smad形成通路系統(tǒng)參與繼發(fā)性炎性反應(yīng)的調(diào)控［2］。人參養(yǎng)榮湯出自于《太平惠民和劑局方》，研究表明：人參養(yǎng)榮湯能夠改善骨髓造血功能，對(duì)機(jī)體防御系統(tǒng)功能紊亂有修復(fù)作用，可抑制大腦皮質(zhì)神經(jīng)元密度的下降等，同時(shí)對(duì)顱腦損傷引起的炎癥反應(yīng)有明顯抑制作用［3-4］。本研究擬建立大鼠顱腦外傷模型，采用人參養(yǎng)榮湯干預(yù)大鼠顱腦外傷模型，檢測損傷后不同組別血清、腦組織中TGF-β1／Smad信號(hào)通路的關(guān)鍵因子，探討人參養(yǎng)榮湯通過TGF-β1／Smad信號(hào)通路在顱腦創(chuàng)傷發(fā)生后的干預(yù)作用，探討其治療顱腦損傷可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥物3月齡SPF級(jí)SD雄性大鼠40只，上海西斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0002，合格證編號(hào)：2007 000562039，體重（350±20）g，飼養(yǎng)于福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心鼠類實(shí)驗(yàn)室。藥物制作方法：首先將人參、黃芪、白術(shù)、茯苓、當(dāng)歸、白芍、熟地黃、陳皮等干品等量混合，用75%乙醇回流提取2～3次，每次溶媒用量約為生藥量的8～12倍，每次提取時(shí)間為1～2 h，合并提取液后濃縮至干，并進(jìn)一步干燥，得人參養(yǎng)榮湯提取物。

1.1.2 分組及模型建立應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法分組，每組10只，分為正常組、模型對(duì)照組（只做開顱重物擊傷）、實(shí)驗(yàn)組（開顱重物擊傷＋人參養(yǎng)榮湯），人參養(yǎng)榮湯提取液最佳濃度9 g／（kg·d）。正常組、模型對(duì)照組采用生理鹽水灌胃，實(shí)驗(yàn)組采用人參養(yǎng)榮湯提取液灌胃。手術(shù)大鼠前3 d單獨(dú)喂養(yǎng)，術(shù)前禁食8 h，實(shí)驗(yàn)時(shí)腹腔內(nèi)注射水合氯醛進(jìn)行麻醉，俯臥位固定于腦立體定向儀上。消毒皮膚，頭部正中切開，剝離骨膜，暴露右頂骨，用牙科鉆在冠狀縫后、中線旁區(qū)域鉆一直徑5 mm骨窗，保持硬膜完整。將撞桿置于硬膜上，用祛碼于一定高度沿外周導(dǎo)管墜落，撞擊撞桿從而撞擊硬膜，使腦組織產(chǎn)生瞬間形變，致頂葉腦挫裂傷，迅速將裝置移開保證只有1次撞擊。撞擊后切口內(nèi)滴注4萬U硫酸慶大霉素4～5滴，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮。

1.1.3 主要試劑與儀器TGF-β1、Smad2、Smad3、TF抗體（美國Santa Cruz公司）；WesternBreeze（美國Invitrogen公司）；PVDF膜（美國Amersham公司）；Decorin、TGF-β1、Smad2、Smad3酶聯(lián)免疫吸附測試試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；石蠟切片機(jī)（CUT 4060型，德國Leica Biosystems公司）；OLYMPUS電子顯微鏡（日本TKO光學(xué)儀器株式會(huì)社產(chǎn)品）；HMIAS－2000顯微圖像分析系統(tǒng)（武漢千屏影象技術(shù)有限責(zé)任公司）；GEL DOC 2000凝膠成像系統(tǒng)（美國伯樂BIO-RAD公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 取材各組均于造模后連續(xù)干預(yù)30 d后取材。大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛麻醉，常規(guī)胸腹聯(lián)合切口，經(jīng)左心室插管，分別用生理鹽水、多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液灌注，注畢取出大腦放人4%多聚甲醛溶液內(nèi)，4℃固定48 h后樣本切片，作尼氏體染色。腹主動(dòng)脈取血，離心，取血清，冷凍、待檢。

1.2.2 ELISA法檢測血清中的Decorin、TGF-β1、Smad2、Smad3含量取各組血清，按要求分別加入樣品、稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)品各50 μL，37℃30 min溫育。再加入酶標(biāo)偶合液洗板，加入底物反應(yīng)15 min后加入終止液，酶標(biāo)儀450 nm處讀取OD值。

1.2.3 Western Blot檢測腦組織中的TGF-β1、Smad2、Smad3、TF蛋白的含量各組腦組織低溫充分勻漿后，用Bradford法進(jìn)行蛋白定量；取20 μg蛋白樣品，10%SDS-PAGE電泳，100 V轉(zhuǎn)移1 h至硝酸纖維素薄膜，放入封閉液中37℃封閉1 h；一抗（TGF-β1、Smad2、Smad3、TF）4℃過夜；同時(shí)，另1張用不含抗體TBS-T液孵育，作為陰性對(duì)照；反復(fù)洗膜后，將膜與堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記的抗IgG抗體孵育，室溫輕搖1 h；洗膜后，用Western Blot印跡觀察，用圖像分析測定各帶吸光度（A）值做定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料屬正態(tài)分布用（x±s）表示，采用多組間單因素方差分析方法（F檢驗(yàn)）。

圖1 正常組腦組織尼氏體染色結(jié)果（×400）

圖2 實(shí)驗(yàn)組腦組織尼氏體染色結(jié)果（×400）

圖3 模型對(duì)照組腦組織尼氏體染色結(jié)果（×400）

表1 3組血清中Decorin、TGF-β1、Smad2、Smad3含量變化

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦組織尼氏體染色結(jié)果正常組尼氏體為細(xì)顆粒；模型對(duì)照組尼氏體為細(xì)塵狀顆粒，胞漿著色淺，胞體腫脹，細(xì)胞變?yōu)閳A形，胞核移至位于軸突起始部對(duì)側(cè)邊緣部；而實(shí)驗(yàn)組仍可見部分正常尼氏體。見圖1～圖3。

2.23 組血清中Decorin、TGF-β1、Smad2、Smad3含量比較見表1。

2.33 組腦組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、TF蛋白表達(dá)比較見表2、圖4。

3 討論

顱腦損傷后的繼發(fā)的炎性反應(yīng)常常導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的損害及死亡［5］。創(chuàng)傷后應(yīng)激促進(jìn)體內(nèi)炎癥介質(zhì)刺激組織因子（tissue factor，TF）大量分泌，激活外源性凝血途徑，激發(fā)整個(gè)凝血過程，進(jìn)一步加劇神經(jīng)細(xì)胞的損害［6－7］。正常生理狀態(tài)下，血漿中TF水平表達(dá)非常低，血液中的單核細(xì)胞和接觸血漿的血管內(nèi)皮細(xì)胞不表達(dá)TF，而在創(chuàng)傷應(yīng)激情況下，血漿中的TF活性可增加至14倍［8］。有研究發(fā)現(xiàn)：若顱腦外傷患者入院時(shí)TF大量表達(dá)，則其凝血功能就存在異常，則有很大概率發(fā)生繼發(fā)性腦損傷，TF對(duì)凝血功能異常程度及判斷腦組織受損程度和評(píng)估預(yù)后具有重要價(jià)值［9］。本研究結(jié)果顯示模型對(duì)照組中TF蛋白表達(dá)最高，正常組最低，與此觀點(diǎn)一致。

腦組織中的星形細(xì)胞、神經(jīng)元、少突細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞都能產(chǎn)生TGF-β1，病理狀態(tài)下TGF-β1可在腦組織中大量表達(dá)，并可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖、細(xì)胞外基質(zhì)的形成以及促進(jìn)顱腦損傷后的組織修復(fù)［10］。Smad蛋白質(zhì)群是一類細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白，參與TGF家族成員的信號(hào)傳導(dǎo)，Smad2和Smad3是激活TGF-βs信號(hào)通路的作用底物，在細(xì)胞核中直接地應(yīng)答TGF-β的轉(zhuǎn)錄功能［11］。

當(dāng)腦損傷發(fā)生后，腦組織中大量表達(dá)TGF-β1，并激活具有絲氨酸、蘇氨酸激酶活性的TGF-β受體，活化后的受體進(jìn)一步激活Smad2和Smad3等蛋白，使其發(fā)生絲氨酸磷酸化，磷酸化后的Smads蛋白聚集形成復(fù)合物后進(jìn)入細(xì)胞核，與特異性的DNA連接蛋白結(jié)合，最后影響腦組織中神經(jīng)細(xì)胞的分化。Decorin是一種普遍存在于細(xì)胞外基質(zhì)的富含亮氨酸的小分子蛋白多糖，是TGF-β最重要的負(fù)調(diào)節(jié)劑，能降低TGF-β生物學(xué)活性［12］。本研究結(jié)果顯示：當(dāng)顱腦外傷發(fā)生后，大鼠體內(nèi)TF大量分泌，血液中的炎癥介質(zhì)向腦損傷區(qū)聚集，釋放TGF-β1使血細(xì)胞或免疫細(xì)胞產(chǎn)生的TGF-β1進(jìn)入腦損傷區(qū)，同時(shí)激活TGF-β1／Smad信號(hào)通路，表現(xiàn)為模型對(duì)照組血清中TGF-β1、Smad2、Smad3含量最高，正常組最低；Decorin的表達(dá)與之相反，正常組最高，模型對(duì)照組最低；而腦組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、TF蛋白表達(dá)趨勢也與血清中一致。表明TGF-β1／Smad信號(hào)通路與顱腦創(chuàng)傷診斷及損傷程度的判斷關(guān)系密切，TGF-β1信號(hào)因子可作為顱腦創(chuàng)傷的診斷、治療、預(yù)后的判斷指標(biāo)。

我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為顱腦損傷的病機(jī)為外力撞擊腦部，導(dǎo)致脈絡(luò)破損，氣機(jī)逆亂，離經(jīng)之血瘀阻于清竅；瘀阻氣滯而化痰，痰瘀互阻而蒙竅，導(dǎo)致而清陽不升，濁陰不降，至元神失主，神機(jī)失用而昏厥。人參養(yǎng)榮湯由人參、白芍、黃芪、茯苓、白術(shù)、熟地黃、當(dāng)歸、陳皮等十幾味中藥組成，具有扶正固本，改善機(jī)體內(nèi)環(huán)境，增強(qiáng)和調(diào)動(dòng)機(jī)體自身抗病能力從而減低并發(fā)癥發(fā)生率。有實(shí)驗(yàn)研究表明：人參養(yǎng)榮湯中含皂甙、糖類、氨基酸、維生素等多種成分，具有輔佐細(xì)胞存在下改善造血功能；刺激單核細(xì)胞活性；可促進(jìn)脾集落生成單位的增加及成紅細(xì)胞系的恢復(fù)，繼而刺激CSF的產(chǎn)生，促進(jìn)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞的分化，刺激IL-6的生成等作用，修復(fù)機(jī)體防御系統(tǒng)功能，提高抗應(yīng)激能力及抗疲勞的作用［13-16］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：采用人參養(yǎng)榮湯干預(yù)大鼠顱腦外傷模型后血清與蛋白的Decorin、TGF-β1、Smad2、Smad3、TF均較模型對(duì)照組有所升高，表明人參養(yǎng)榮湯能通過TGF-β1／Smad信號(hào)通路改善外傷后顱腦的損傷程度。

表2 3組腦組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、TF蛋白表達(dá)比較

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R285.5

A

1000-338X（2017）04-0027-03

2017-04-08

福州市科技資助項(xiàng)目（2014-S-137-9）

賴躍平（1963—），男，主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)外科臨床工作。