乳腺癌細(xì)胞ret基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)及其與PI3KAktmTOR信號(hào)通路相關(guān)因子的關(guān)系

楊 滿，崔軍威，程 苒，韋 偉

(北京大學(xué)深圳醫(yī)院乳甲外科，廣東 深圳 518036)

乳腺癌細(xì)胞ret基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)及其與PI3KAktmTOR信號(hào)通路相關(guān)因子的關(guān)系

楊 滿，崔軍威，程 苒，韋 偉

(北京大學(xué)深圳醫(yī)院乳甲外科，廣東 深圳 518036)

目的 探討乳腺癌細(xì)胞ret基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)及其與PI3KAktmTOR信號(hào)通路相關(guān)因子的關(guān)系。方法以乳腺癌細(xì)胞為研究對(duì)象，采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞中RET、PI3K、mTOR和AKT mRNA表達(dá)量，構(gòu)建合成ret shRNA慢病毒載體，轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，再次采用RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中RET、PI3K、mTOR和AKT mRNA表達(dá)量。比較轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中RET、PI3K、mTOR和AKT mRNA表達(dá)量，并采用Pearson線性相關(guān)分析法分析其細(xì)胞中RET mRNA表達(dá)量與其PI3K、mTOR和AKT mRNA表達(dá)量的關(guān)系。結(jié)果 轉(zhuǎn)染前細(xì)胞中RET、PI3K、mTOR和AKT mRNA表達(dá)量分別為0.851±0.126、0.872±0.126、0.845±0.087和0.769±0.355，均分別高于轉(zhuǎn)染后的0.108±0.023、0.113±0.022、0.098±0.022和0.072±0.013(P<0.05)。Pearson線性相關(guān)分析結(jié)果顯示，細(xì)胞中RET mRNA表達(dá)量與其PI3K、mTOR和AKT mRNA表達(dá)量均呈正相關(guān)(r=0.877、0.852、0.863,P<0.05)。結(jié)論 乳腺癌細(xì)胞ret基因轉(zhuǎn)錄水平較高且與PI3KAktmTOR信號(hào)通路相關(guān)因子密切相關(guān)，可能通過調(diào)控PI3KAktmTOR信號(hào)通路而影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，可能作為乳腺癌治療的靶基因之一。

乳腺癌； ret基因； PI3KAktmTOR信號(hào)通路； 關(guān)系

乳腺癌是常見惡性腫瘤疾病，其惡性程度高，病情進(jìn)展快，患者預(yù)后情況差，急需改善[1-2]。近年來乳腺癌的診治水平取得了較大進(jìn)展，然而患者的預(yù)后情況仍不容樂觀。因此，改善乳腺癌治療效果是目前急需解決的醫(yī)療難題。近年來基因靶向治療成為乳腺癌等癌癥治療的熱門方向[3]。在癌癥相關(guān)基因中，原癌基因RET發(fā)揮著重要作用，其過量表達(dá)與甲狀腺癌等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。因此，RET基因亦可能與乳腺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)。而乳腺癌的發(fā)生發(fā)展受到PI3KAktmTOR信號(hào)通路等的影響[5]。因此，本研究假設(shè)RET基因可能與乳腺癌PI3KAktmTOR信號(hào)通路相關(guān)，并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)證實(shí)，將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞來源

2015年9月至2016年6月于北京大學(xué)深圳醫(yī)院行手術(shù)治療的60例乳腺癌患者癌組織細(xì)胞，為新鮮組織，均經(jīng)病理學(xué)檢查診斷證實(shí)為原發(fā)性乳腺癌，腺癌21例，浸潤性導(dǎo)管癌39例，年齡28～78(53.32±9.76)歲，PTNM分期為I期20例，Ⅱ期37例，Ⅲ期3例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院倫理學(xué)委員會(huì)審核批準(zhǔn)，且相關(guān)患者均簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

于2015年9月至2016年6月在北京大學(xué)香港科技大學(xué)醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3 試劑和儀器

恒溫箱(江蘇佳美儀器有限公司)，離心管、玻璃瓶、吸管、試管等(廣東東普醫(yī)療科技有限公司)，離心機(jī)(德國艾本德公司)，DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清(美國Gibco公司)，RNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、cDNA合成試劑盒(美國Promega公司)，實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒和SYBR Premix EX Taq(日本Takara公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱、細(xì)胞培養(yǎng)板(美國SHELLAB公司)，熒光顯微鏡(日本Nikon公司)，離心管、玻璃瓶、吸管、試管等(廣東東普醫(yī)療科技有限公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱、細(xì)胞培養(yǎng)板、醫(yī)用恒溫水浴箱(美國SHELLAB公司)，低溫冰箱(青島海爾公司)，引物(上海生物工程有限公司)，ABI PRISM 377測(cè)序儀(美國Perkin-Elmer公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)

37 ℃水浴箱中使細(xì)胞融化，以3500 r·min-1轉(zhuǎn)速離心5 min后棄去上清液，加入培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，在37 ℃和5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的高糖型DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)細(xì)胞至80%融合，采用0.25%的胰酶進(jìn)行消化并按1：3～1：5的比率行傳代培養(yǎng)，并取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。

1.4.2 器具處理

所有實(shí)驗(yàn)器具均在使用前1 h行紫外線照射1 h，并在各器皿上貼上相應(yīng)的標(biāo)簽以免實(shí)驗(yàn)操作中出現(xiàn)失誤。

1.4.3 指標(biāo)檢測(cè)

采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞中RET、PI3K、mTOR和AKT mRNA表達(dá)量，常規(guī)提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，按照試劑盒說明進(jìn)引導(dǎo)進(jìn)行操作，將cDNA冷藏于-20 ℃低溫冰箱中備用。實(shí)行RT-PCR檢測(cè)，操作亦按照相關(guān)試劑盒說明書進(jìn)行，反應(yīng)條件分別為先于94 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃反應(yīng)60 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃反應(yīng)5 min。進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)檢測(cè)。結(jié)果分析采用7500SDS v1.3.1軟件操作，以18srRNA為內(nèi)參，所得數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt公式進(jìn)行分析。

1.4.4 含綠色熒光蛋白(GFP)慢病毒顆粒構(gòu)建

化學(xué)合成ret基因的shRNA序列(5′-CCTCGGTCCCAGCCTAAGGTCAAT-3′)，將實(shí)驗(yàn)合成的ret shRNA序列插入到GFP慢病毒顆粒中，構(gòu)建ret shRNA慢病毒載體。

1.4.5 ret shRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染

取對(duì)數(shù)生長期人乳腺癌細(xì)胞，顯微鏡下觀察其生長情況并取生長狀態(tài)良好的人乳腺癌細(xì)胞平鋪在6孔板中，培養(yǎng)細(xì)胞至80%融合，各添加1 μL的ret shRNA慢病毒載體，3500 r·min-1和2 cm離心轉(zhuǎn)染30 min，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)1 d。

轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)1 d后再次行RET、PI3K、mTOR和AKT mRNA表達(dá)量的檢測(cè)，具體檢測(cè)方法同1.4.3。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0軟件建立數(shù)據(jù)庫并行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其中計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，采用兩獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，采用Pearson線性相關(guān)分析法分析其細(xì)胞中RET mRNA表達(dá)量與其PI3K、mTOR和AKT mRNA表達(dá)量的關(guān)系，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染前后的RET mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

經(jīng)核苷酸序列確定FAK shRNA序列成功插入GFP慢病毒顆粒，與轉(zhuǎn)染前比較，轉(zhuǎn)染后RET mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低，RET shRNA慢病毒載體可有效抑制RET mRNA表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2 轉(zhuǎn)染前后的PI3K、mTOR和 AKT mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

與轉(zhuǎn)染前比較，轉(zhuǎn)染后PI3K、mTOR和 AKT mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

時(shí)間nRETmRNA相對(duì)表達(dá)量PI3KmRNA相對(duì)表達(dá)量mTORmRNA相對(duì)表達(dá)量AKTmRNA相對(duì)表達(dá)量轉(zhuǎn)染前600.851±0.1260.872±0.1260.845±0.0870.769±0.055轉(zhuǎn)染后600.108±0.0230.113±0.0220.098±0.0220.072±0.013t44.93145.96564.47995.530P<0.05<0.05<0.05<0.05

2.3 乳腺癌細(xì)胞中RET mRNA表達(dá)量與其PI3K、mTOR和 AKT mRNA表達(dá)量的關(guān)系分析

Pearson線性相關(guān)分析結(jié)果顯示，細(xì)胞中RET mRNA表達(dá)量與其PI3K、mTOR和 AKT mRNA表達(dá)量均呈正相關(guān)(r=0.877、0.852、0.863,P<0.05)，見封四圖1—3。

3 討論

近年來隨著生活方式、飲食結(jié)構(gòu)和居住環(huán)境等的改變，各類癌癥的發(fā)生不斷增加。其中乳腺癌為臨床常見癌癥，是可嚴(yán)重威脅患者生命安全的惡性腫瘤疾病[6]。因此，對(duì)乳腺癌病情和預(yù)后的改善十分重要。乳腺癌的治療方法多樣，常采用的治療方法有手術(shù)治療、化療、免疫治療等，但各類治療方法的預(yù)后情況仍較差[7]。改善乳腺癌療效和預(yù)后的問題亟待解決。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展涉及到原癌基因的活化以及抑癌基因的失活引發(fā)的相關(guān)蛋白合成障礙和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)障礙，細(xì)胞生物學(xué)行為改變等[8]。RET基因?yàn)樵┗?，與乳腺癌密切相關(guān)[9]。而胡海燕[10]的畢業(yè)論文研究了青海地區(qū)乳腺癌、甲狀腺多原發(fā)癌患者癌組織中RET基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，其研究結(jié)果顯示，青海地區(qū)乳腺癌、甲狀腺多原發(fā)癌的癌組織中RET基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平較高，RET基因的過量表達(dá)與青海地區(qū)乳腺癌、甲狀腺多原發(fā)癌的發(fā)生相關(guān)。因此，RET基因亦可能與乳腺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

乳腺癌的發(fā)生發(fā)展涉及多個(gè)信號(hào)通路，其中PI3KAktmTOR信號(hào)通路是乳腺癌細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的重要途徑，其異常激活與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可通過抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長、調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞周期、促進(jìn)腫瘤新生血管形成而促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移等多種途徑影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展以及臨床轉(zhuǎn)歸，而抑制PI3KAktmTOR信號(hào)通路的活性對(duì)乳腺癌治療具有重要意義[11-12]。近年來基因靶向治療在乳腺癌的治療研究較多[13]。本研究假設(shè)RET基因可能通過活化PI3KAktmTOR信號(hào)通路影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，抑制RET基因可能抑制PI3KAktmTOR信號(hào)通路而達(dá)到抑制乳腺癌發(fā)展的目的。因此，本研究設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，以乳腺癌細(xì)胞為研究對(duì)象，構(gòu)建合成病毒載體及RET ShRNA，轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中RET、PI3K、mTOR和AKT mRNA表達(dá)量，比較了轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中RET、PI3K、mTOR和AKT mRNA表達(dá)量并分析了其細(xì)胞中RET mRNA表達(dá)量與其PI3K、mTOR和AKT mRNA表達(dá)量的關(guān)系，旨在為尋找乳腺癌基因靶向治療的新的有效治療基因提供依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，ret shRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染前乳腺癌細(xì)胞中RET、PI3K、mTOR和AKT mRNA表達(dá)量均較高，均在0.79以上，提示RET基因和PI3KAktmTOR信號(hào)通路均與乳腺癌的發(fā)生相關(guān)。而ret shRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染后的RET、PI3K、mTOR和AKT mRNA表達(dá)量明顯降低，均降低到0.1左右，提示RET mRNA表達(dá)量可能與PI3K、mTOR和AKT mRNA表達(dá)量有關(guān)。進(jìn)一步的Pearson線性相關(guān)分析結(jié)果顯示，隨著乳腺癌細(xì)胞中RET mRNA表達(dá)量的增加，其PI3K、mTOR和AKT mRNA表達(dá)量亦增加，乳腺癌細(xì)胞中RET mRNA表達(dá)量與其PI3K、mTOR和AKT mRNA表達(dá)量均呈正相關(guān)。RET與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其在乳腺癌中的作用可能是通過激活PI3KAktmTOR信號(hào)通路而促進(jìn)乳腺癌發(fā)生發(fā)展，而抑制RET基因的表達(dá)可抑制PI3KAktmTOR信號(hào)通路活性，抑制乳腺癌進(jìn)一步發(fā)展，改善乳腺癌病情和預(yù)后。RET基因可能作為乳腺癌靶向治療的靶基因之一，靶向抑制RET基因表達(dá)可能是乳腺癌治療的有效方法之一

綜上所述，乳腺癌細(xì)胞ret基因與乳腺癌發(fā)生發(fā)展和PI3KAktmTOR信號(hào)通路均相關(guān)，可能通過調(diào)控PI3KAktmTOR信號(hào)通路而影響乳腺癌發(fā)展，因此，靶向抑制RET基因表達(dá)可能作為乳腺癌靶向治療的方法之一。

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(責(zé)任編輯：羅芳)

RET mRNA相對(duì)表達(dá)量

RET mRNA相對(duì)表達(dá)量

RET mRNA相對(duì)表達(dá)量

2017-01-14

R737.9

A

1009-8194(2017)06-0043-03

10.13764/j.cnki.lcsy.2017.06.016