血必凈注射液對嚴重膿毒癥患者免疫調(diào)理機制的影響

康 健，周雯慧，沈景桂，周思佳，龔 平

(1.大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 急診科，遼寧 大連116011；2.中南大學湘雅醫(yī)學院 2013級臨床醫(yī)學專業(yè)，湖南 長沙 410013；3.鄭州中心醫(yī)院 重癥醫(yī)學科，河南 鄭州 450000；4.遼寧省腫瘤醫(yī)院 重癥醫(yī)學科，遼寧 沈陽 110042)

論 著

血必凈注射液對嚴重膿毒癥患者免疫調(diào)理機制的影響

康 健1，周雯慧2，沈景桂3，周思佳4，龔 平1

(1.大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 急診科，遼寧 大連116011；2.中南大學湘雅醫(yī)學院 2013級臨床醫(yī)學專業(yè)，湖南 長沙 410013；3.鄭州中心醫(yī)院 重癥醫(yī)學科，河南 鄭州 450000；4.遼寧省腫瘤醫(yī)院 重癥醫(yī)學科，遼寧 沈陽 110042)

目的 觀察血必凈注射液對嚴重膿毒癥患者Th1細胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet mRNA和Th2細胞轉(zhuǎn)錄因子GATA-3 mRNA表達的影響，探討其能否通過影響Th1/Th2漂移來調(diào)理嚴重膿毒癥患者的免疫紊亂。方法 將15例嚴重膿毒癥患者分為血必凈治療組(n=9)和常規(guī)治療組(n=6)。常規(guī)治療組給予膿毒癥的一般治療，包括液體復蘇、抗感染、必要時呼吸機輔助治療以及營養(yǎng)支持等。血必凈治療組在相同的常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用血必凈注射液(100 mL，2次/d，應用7 d)。兩組分別于入院當天(0 d)和入院后第1、3和7 天抽外周靜脈血；應用Real-time RT-PCR檢測T-bet和GATA-3 mRNAs；ELISA法檢測血Th1分泌的IFN-γ和Th2分泌的IL-4；并同時進行APACHE II評分。結(jié)果 常規(guī)治療組患者入院第3 天和第7 天的血IFN-γ、T-bet mRNA、T-bet/GATA-3、IFN-γ/IL-4均明顯高于0 d(均P<0.05)，GATA-3 mRNA和IL-4明顯低于0 d(均P<0.05)；血必凈注射液治療后第3 天和第7天患者的血IFN-γ、T-bet mRNA、T-bet /GATA-3、IFN-γ/IL-4明顯低于常規(guī)治療組(均P<0.05)，GATA-3 mRNA和IL-4明顯高于常規(guī)治療組(均P<0.05)。血必凈注射液治療后第7 天 APACHE II評分較常規(guī)治療組顯著下降(18.22±1.99 vs. 22.67±2.16，P=0.042)。結(jié)論 嚴重膿毒癥患者存在Th1/Th2 失衡；血必凈注射液能通過抑制T-bet mRNA表達和促進GATA-3 mRNA表達來改善Th1/Th2 失衡和緩解病情的嚴重程度。

膿毒癥；血必凈； T-bet ；GATA-3；IFN-γ；IL-4

膿毒癥是指機體對感染的反應失調(diào)而導致危及生命的器官功能障礙[1]，是臨床上危重患者死亡的重要原因之一。多年來盡管對膿毒癥的研究不斷深入，但其發(fā)病機制仍不完全清楚。近年研究認為，膿毒癥不單純是病原體及其毒素導致的炎癥損害，還存在免疫功能紊亂，主要表現(xiàn)為免疫抑制，其中T淋巴細胞亞群變化是引起膿毒癥免疫功能紊亂的關(guān)鍵因素[2-3]。CD4+T淋巴細胞被病原微生物激活后可分化為Th0細胞，而Th0細胞依據(jù)其分泌細胞因子的不同可分為Th1和Th2兩個亞群[4]。Th1通過分泌IL-2、IL-12、INF-γ等促炎細胞因子，介導細胞免疫應答；Th2通過分泌IL-4、IL-5、IL-10等抗炎細胞因子，介導體液免疫應答并與免疫抑制相關(guān)[4-5]。T-bet和GATA-3分別是Th1和Th2特異性轉(zhuǎn)錄因子[6-8]。正常狀態(tài)下，體內(nèi)Th1和Th2功能處于動態(tài)平衡，維持正常的細胞和體液免疫應答；Th1向Th2分化的漂移是膿毒癥產(chǎn)生免疫抑制的主要機制之一[4]。血必凈注射液在我國已廣泛應用于膿毒癥患者的治療[9-11]。研究表明，血必凈注射液具有改善膿毒癥患者炎癥、免疫和凝血等功能[12-13]，但其對Th1/Th2漂移及其上游調(diào)控機制的影響尚未見研究。本研究擬觀察血必凈注射液對嚴重膿毒癥患者T-bet和GATA-3 mRNAs表達的影響，探討其能否通過影響Th1/Th2漂移來調(diào)理膿毒癥患者的免疫紊亂。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年6月至2014年12月大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院急診ICU就診的嚴重膿毒癥患者15例，其中男10例，女5例，年齡(59.3±13.9)歲。嚴重膿毒癥診斷標準參照2001年美國胸科醫(yī)師協(xié)會/美國危重病學會聯(lián)合會議通過的相關(guān)定義及診斷標準[14]。排除患有HIV、血液系統(tǒng)疾病、腫瘤、長期服用激素、免疫抑制劑等嚴重影響免疫功能的藥物以及其它嚴重影響患者免疫功能及生存的疾病的患者。

1.2 分組及治療方法

本研究經(jīng)大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準，且本人或家屬簽署知情同意書。根據(jù)治療方法不同將患者分為血必凈治療組(n=9)和常規(guī)治療組 (n=6)。兩組患者在性別、年齡和入院當天(0 d) APPACHE II評分的差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05，見表1)。

表1 兩組患者的一般資料

兩組患者入院當天開始均給予膿毒癥的一般治療，包括液體復蘇、抗感染、必要時呼吸機輔助治療以及營養(yǎng)支持等。血必凈治療組在入院當天開始給予血必凈注射液(紅日藥業(yè)集團，天津)100 mL加0.9%氯化鈉 100 mL靜脈滴注，2次/d，應用7 d；常規(guī)治療組給予等量的0.9%氯化鈉靜脈滴注。

1.3 檢測指標

兩組患者分別于入院當天(0 d)和入院后第1、3和7 天各抽取外周血4 mL，其中2 mL置于EDTA管中用于淋巴細胞分離并檢測T-bet和GATA-3 mRNAs，另2 mL置于促凝管中用于檢測血IFN-γ和IL-4。并同時進行APACHE II評分。

1.3.1 Real-time RT-PCR檢測T-bet和GATA-3 mRNAs

采血后2 h內(nèi)用人淋巴細胞分離液(索萊寶公司，北京)提取淋巴細胞，置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩０碩RIzol(TaKaRa)試劑說明書從分離的淋巴細胞中提取總RNA，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。將各個樣品總RNA稀釋至相同濃度，使用Prime Script RT PCR Kit試劑盒(寶生物公司，大連)按50 μL的反應體系制備cDNA，具體操作按試劑盒說明書進行。T-bet引物大小為 118 bp，上游引物：5'-ACAAACCCGATATGGCTGAGA-3'；下游引物:5'-CCTGCTTGCTTCTCCT GTTC-3'；GATA-3 引物大小為240 bp，上游引物為5'-TGCGGGCTCTACCACAAAAT-3'，下游引物為5'-TCGGTTTCTGGTCTGGATGC-3'；內(nèi)參基因GAPDH引物大小為238 bp，上游引物為5'-CCATCACTGCCACTCAGAAGACT-3'，下游引物為5'-GTCAGATCCACAACGGATACATTG-3'。然后采用Quant script RT Kit(天根生化科技有限公司，北京)進行Real-time RT-PCR分析，以2-ΔΔCt法計算，所測基因的循環(huán)時間(Ct) 用GAPDH標準化。每個樣本測3次。

1.3.2 ELISA法檢測血IFN-γ和IL-4

采用ELISA法檢測外周血IFN-γ和IL-4(RD公司，美國)，具體操作按說明書進行。每個樣本測3次。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者T-bet和GATA-3 mRNAs的比較

常規(guī)治療組第3和7 天患者的T-bet mRNA及T-bet /GATA-3均明顯高于0 d(均P<0.05)，GATA-3 mRNA明顯低于0 d(P<0.05)；而跟常規(guī)治療組相比，血必凈注射液治療后第3和7 天患者的T-bet mRNA及T-bet /GATA-3明顯降低(均P<0.05)，GATA-3 mRNA明顯升高(P<0.05)。見表2。

2.2 兩組患者血IFN-γ和IL-4的比較

常規(guī)治療組入院第3和7天患者的血IFN-γ和IFN-γ/IL-4均明顯高于0 d(均P<0.05)，血IL-4明顯低于0 d(P<0.05)；跟常規(guī)治療組相比，血必凈注射液治療后第3和7 天患者的血IFN-γ和IFN-γ/IL-4明顯降低(均P<0.05)，血IL-4明顯升高(P<0.05)。見表3。

表2 兩組患者不同時間點T-bet 和GATA-3 mRNA及T-bet /GATA-3的比較

Tab 2 Comparison of T-bet and GATA-3 mRNAs and T-bet/GATA-3 of patients at different time points in the two groups

項目常規(guī)治療組(n=6)血必凈治療組(n=9)T-betmRNA 0d1.03±0.161.04±0.24 1d1.31±0.171.29±0.14 3d2.35±0.211)1.49±0.192) 7d2.40±0.261)1.10±0.212)GATA-3mRNA 0d1.34±0.341.22±0.24 1d1.39±0.241.25±0.13 3d0.92±0.141)1.02±0.222) 7d0.81±0.181)1.15±0.122)T-bet/GATA-3 0d0.77±0.140.85±0.14 1d0.94±0.131.03±0.17 3d2.55±0.711)1.46±0.152) 7d2.96±0.911)0.96±0.202)

1)與0 d比較，P<0.05；2)與常規(guī)治療組比較，P<0.05

表3 兩組患者不同時間點血IFN-γ和IL-4及IFN-γ/IL-4的比較

Tab 3 Comparison of blood IFN-γ, IL-4 and IFN-γ/IL-4 of patients at different time points in the two groups

項目常規(guī)治療組(n=6)血必凈治療組(n=9)IFN-γ(ng/L) 0d165.8±22.8170.1±23.0 1d176.6±31.8173.9±36.7 3d314.7±22.91)281.6±49.22) 7d329.4±66.81)280.6±59.22)IL-4(ng/L) 0d243.5±1.9245.3±1.7 1d238.4±3.2241.2±3.4 3d216.2±3.61)235.3±3.02) 7d205.8±1.51)234.9±1.72)IFN-γ/IL-4 0d 0.7±0.2 0.7±0.1 1d 0.7±0.2 0.7±0.1 3d 1.5±0.21) 1.2±0.92) 7d 1.6±0.31) 1.2±2.82)

1)與0 d比較，P<0.05；2)與常規(guī)治療組比較，P<0.05

2.3 兩組患者APACHE II評分的比較

血必凈注射液治療后第7 天 APACHE II評分較常規(guī)治療組顯著下降(18.22±1.99 vs. 22.67±2.16，P=0.042)，而在治療后第1和3天兩組APACHE II評分之間的差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，嚴重膿毒癥患者外周血促炎介質(zhì)IFN-γ、Th1細胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet mRNA、Th1和Th2細胞轉(zhuǎn)錄因子的比值(T-bet/GATA-3)、促炎介質(zhì)IFN-γ和抑炎介質(zhì)IL-4的比值(IFN-γ/IL-4)均升高，GATA-3 mRNA和IL-4均降低；而血必凈注射液治療能顯著降低患者血IFN-γ、T-bet mRNA、T-bet /GATA-3、IFN-γ/IL-4，升高GATA-3 mRNA和IL-4，并改善患者的APACHE II評分。

研究證明，膿毒癥發(fā)病中炎癥反應貫穿始終，同時存在免疫系統(tǒng)失衡，這是導致其預后不佳的主要原因之一[2,5,15]。因此，膿毒癥治療中抗炎治療與免疫調(diào)理越來越受到關(guān)注。Th1和Th2細胞調(diào)控著機體復雜的細胞因子網(wǎng)絡，可在整體水平上評估膿毒癥患者的免疫功能，當向Th2細胞漂移時，機體將出現(xiàn)免疫抑制[4-5,15]。IFN-γ和IL-4分別作為Th1和Th2細胞分泌的細胞因子，其本身也在調(diào)節(jié)Th1和Th2細胞分化中起重要作用[15]。IFN-γ具有促進Th1細胞的分化和抑制Th2細胞分化的作用[2]；而IL-4則具有促進Th2細胞的分化和抑制Th1細胞分化的作用[3,8]。本研究中觀察到常規(guī)治療組患者促炎介質(zhì)IFN-γ和抑炎介質(zhì)IL-4及其比值(IFN-γ/IL-4)均升高，提示嚴重膿毒癥患者的促炎和抑炎反應都升高，但總體上是促炎反應占優(yōu)勢，即存在亢進的全身炎癥反應綜合征(SIRS)。

T-bet和GATA-3分別作為Th1和Th2細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)這兩類細胞分化中起重要作用[6-7,15]。T-bet能促進Th1細胞分化和INF-γ分泌增加；GATA-3在調(diào)節(jié)Th2細胞分化中起重要作用，可通過抑制T-bet和INF-γ基因的表達來實現(xiàn)Th1向Th2細胞的漂移，同時也可通過激活I(lǐng)L-4基因的表達來促進Th2細胞的分化[8,15]。另外，T-bet和GATA-3的表達量與Th1和Th2細胞數(shù)量呈正相關(guān)[15]。本研究觀察到常規(guī)治療組患者T-bet和GATA-3 mRNAs表達的變化趨勢與Th1和Th2的變化趨勢(即IFN-γ和IL-4)是一致的，驗證了T-bet和GATA-3在Th1和Th2細胞分化中的重要調(diào)節(jié)作用。

血必凈注射液的主要化學成分有紅花、丹參、川芎、赤芍和當歸五味中藥，已有許多研究證實其具有改善膿毒癥患者炎癥反應作用，但其具體機制不完全清楚[9-13]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過血必凈注射液治療后嚴重膿毒癥患者血Th1的 T-bet mRNA表達及其分泌的促炎介質(zhì)IFN-γ均下降，同時血Th2的 GATA-3 mRNA表達及其分泌的抑炎介質(zhì)IL-4均升高，這提示血必凈注射液能通過影響Th1和 Th2細胞轉(zhuǎn)錄因子的表達來抑制嚴重膿毒癥患者的炎癥反應，這可能是血必凈注射液改善膿毒癥患者炎癥反應的作用機制之一。APACHE II評分，即急性生理與慢性健康評分，因其具有能簡便和可靠地評估病情嚴重程度的特點而已成為目前世界范圍內(nèi)ICU普遍使用的評分系統(tǒng)。本研究中，經(jīng)血必凈注射液治療的嚴重膿毒癥患者APACHE II評分降低，提示血必凈注射液能改善患者發(fā)病的嚴重程度，這可能與血必凈注射液對Th1和 Th2細胞轉(zhuǎn)錄因子表達的上述影響有關(guān)。然而，膿毒癥患者出現(xiàn)Th1和Th2細胞的漂移是多因素作用的結(jié)果，除細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的原因外，Treg細胞活性、調(diào)節(jié)性樹突狀細胞的功能改變均可對Th1和Th2細胞之間的漂移產(chǎn)生影響[16]。一項有關(guān)血必凈注射液治療膿毒癥的動物實驗表明其可通過促進Treg細胞的凋亡來影響Th1和Th2細胞的分化[17]。另外一項研究也顯示出血必凈注射液可以通過抑制調(diào)節(jié)性樹突狀細胞的功能來改善Th1細胞向Th2細胞的漂移[12]。這些研究提示，血必凈注射液影響Th1細胞和Th2細胞之間漂移的機制很復雜，還需要進一步研究。

總之，嚴重膿毒癥患者存在Th1/Th2 失衡；血必凈注射液能通過抑制T-bet mRNA表達和促進GATA-3 mRNA表達來改善促炎/抗炎反應的失衡，起到免疫調(diào)理的作用，達到改善病情嚴重程度的效果。這也啟示我們可利用中藥改善患者的免疫功能來提高膿毒癥患者的生存率的可能性，然而遺憾的是本研究納入病例偏少，尚需繼續(xù)擴大樣本量，對血必凈注射液影響膿毒癥患者的免疫調(diào)理作用及機制進行深一步的探討。

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Effect of Xuebijing injection on immune regulation in patients with severe sepsis

KANG Jian1, ZHOU Wenhui2,SHEN Jinggui3, ZHOU Sijia4, GONG Ping1

(1.Department of Emergency, the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116011,China; 2.Undergraduate Student of Clinical Medicine Enrolled in 2013, Xiangya Medical College of Central South University, Changsha 410013,China; 3.Department of Intensive Care Medicine, Zhengzhou Central Hospital, Zhengzhou 450000, China; 4.Intensive Care Medicine, Liaoning Cancer Hospital, Shenyang 110042,China)

Objective To observe the effect of Xuebijing injection on the expressions of Th1 lymphocyte transcription factor T-bet mRNA and Th2 lymphocyte transcription factor GATA-3 mRNA and thus investigate its possible mechanism of immune regulation by affecting Th1/Th2 shift in patients with severe sepsis. Methods Fifteen severe septic patients were randomly divided into Xuebijing treatment group (n=9) and conventional therapy group (n=6). The patients in the conventional therapy group

the conventional treatments for sepsis, including fluid resuscitation, antibiotic therapy, mechanical ventilation if necessary, nutrient support and so on. Based on the same treatment as conventional therapy group, the patients in the Xuebijing treatment group received Xuebijing treatment (100 mL, twice, for 7 days). Peripheral venous blood was drawn from the patients in the two groups on admission and days 1,3 and 7, the expressions of T-bet and GATA-3 mRNAs were tested by Real-time RT-PCR,blood IFN-γ secreted by Th1 and IL-4 secreted by Th2 were tested by ELISA, meanwhile APACHE II scores were assessed. Results The patients in the conventional therapy group showed higher blood levels of IFN-γ, T-bet mRNA, T-bet /GATA-3 and IFN-γ/IL-4 on days 3 and 7 and lower levels of GATA-3 mRNA and IL-4 compared with those on day 0 (allP<0.05). The patients in the Xuebijing treatment group had the decreased blood levels of IFN-γ, T-bet mRNA, T-bet /GATA-3 and IFN-γ/IL-4 and the increased blood levels of GATA-3 mRNA and IL-4 compared with the patients in the conventional therapy group on days 3 and 7 (allP<0.05). The APACHE II scores were significantly decreased in the Xuebijing treatment group compared with the conventional therapy group on day 7 (18.22±1.99 vs. 22.67±2.16,P=0.042). Conclusions Patients with severe sepsis has an imbalance of Th1/Th2. Xuebijing injection improves the imbalance of Th1/Th2 and the severity of sepsis by inhibiting the expression of T-bet mRNA and improving the expression of GATA-3mRNA.

sepsis; Xuebijing; T-bet; GATA-3; IFN-γ; IL-4

國家自然科學基金項目(81571869)；遼寧省自然科學基金項目(201403858)

康 健(1968-)，女，主任醫(yī)師。E-mail: kangjian2014@sina.com

龔 平，主任醫(yī)師。E-mail: gongp828@sina.cn

10.11724/jdmu.2017.04.04

R459.7

A

1671-7295(2017)04-0329-05

康健，周雯慧，沈景桂，等.血必凈注射液對嚴重膿毒癥患者免疫調(diào)理機制的影響[J].大連醫(yī)科大學學報，2017,39(4)：329-333.

2017-06-12；

2017-06-28)